專利名稱：小鼠抗人ck19單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以原核表達的CK19蛋白免疫小鼠獲得的分泌CK19單克隆抗體的雜交瘤細胞株11F5，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
CK即細胞角蛋白(Cytokeratin)，是細胞骨架蛋白之一中間絲多基因家族中的一種，為上皮細胞主要的結(jié)構(gòu)蛋白和分化的早期標志物。細胞角蛋白由30種不同的基因編碼，這些基因可以轉(zhuǎn)錄成分子量不同的20種多肽，分別命名為CKl CK20。細胞角蛋白又可根據(jù)等電點的不同分為酸性(I類)蛋白，包括CK9 CK20;及堿性(II類)蛋白，包括CKl CK8。一般而言，相對分子質(zhì)量小的細胞角蛋白總是與大的細胞角蛋白配對，而酸性細胞角蛋白總是與堿性細胞角蛋白配對。細胞分化的不同階段及不同類型上皮細胞表達不同的細胞角蛋白。CK19屬于酸性(I類)細胞角蛋白，分子量約40kDa，是相對分子質(zhì)量最小的細胞角蛋白，存在于正常上皮和各種上皮來源的腫瘤中，特別是單層上皮細胞和間皮；在肝細胞和角膜為陰性表達，在子宮上皮、羊膜的上皮和間質(zhì)中呈陽性表達。CK19在肝細胞中不表達但存在于膽管上皮和膽管癌，由于這一特性，CK19是目前診斷肝內(nèi)膽管細胞癌(ICC)的主要免疫組化標志物。作為上皮源性細胞特異性標志基因，CK19也是早期癌癥微轉(zhuǎn)移研究中運用最多的分子標志之一，主要用于腺癌的診斷以及轉(zhuǎn)移性腺癌和肝癌的鑒別診斷。目前，國內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種CK19的單克隆抗體，但一直以來都需要表達量更多，親和性更好， 稀釋度更高，具有更多優(yōu)良特性的單克隆抗體。獲得活性高的CK19的單克隆抗體對于臨床診斷和科學研究具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高親和性的、可用于科研或臨床免疫組化檢測CK19表達的小鼠抗人CK19單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:(I)根據(jù)CK19的基因序列(BC002539.2)的編碼框，設(shè)計一對特異引物，TrizolReagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增CK19基因，構(gòu)建重組表達載體PET28a-CK19，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，IPTG誘導蛋白表達并親和純化蛋白作為抗原。(2)采用經(jīng)典的細胞融合技術(shù)制備CK19單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測定抗體純度，直接ELISA法測定純化抗體的滴度。(3)通過免疫組織化學分析CK19單克隆抗體染色人甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)腸腺癌和肝臟膽管組織石蠟切片。
(4)根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成特異性引物，PCR擴增單克隆抗體CK19重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，回收目的片段，克隆到PGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細胞后篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒后測序確定了單克隆抗體CK19的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。本發(fā)明提供的以原核表達的CK19蛋白為抗原、免疫小鼠獲得的分泌CK19單克隆抗體的雜交瘤細胞株，名稱為11F5，分類命名為小鼠抗人CK19雜交瘤細胞系，該細胞株11F5已于2012年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCN0.6913。本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細胞株11F5，CGMCC N0.6913產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO =IO0本發(fā)明還提供了一種DNA分子SEQ ID NO:7和DNA分子SEQ ID NO:8，DNA分子SEQ ID NO:7編碼重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO:9 ;DNA分子SEQ ID NO:8編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO: 10。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果:本發(fā)明應(yīng)用重組人的CK19蛋白為免疫抗原，免疫Balb/c小鼠，采用經(jīng)典的細胞融合技術(shù)，通過ELISA篩選，獲得一株能穩(wěn)定分泌抗CK19的雜交瘤細胞株，命名為11F5，亞型鑒定為IgGl，將雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)后收集上清，采用Protein A親和層析法對CK19單抗進行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上；ELISA滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1: 10000以上。人甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)腸腺癌和肝臟膽管組織石蠟切片經(jīng)抗CK19抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞漿內(nèi)出現(xiàn)呈均勻著色的棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色。從實驗結(jié)果上來看，本發(fā)明制備了高效價，高特異性的CK19單克隆抗體，用該抗體檢測證實，其對細胞中的CK19蛋白具有高識別能力，可用于科研或臨床免疫組化檢測CK19表達。


圖1SDS-PAGE分析純化后的CK19單克隆抗體。圖2ELISA法測定CK19單克隆抗體滴度。圖3是免疫組織化學檢測分析CK19單克隆抗體染色人甲狀腺乳頭狀癌石蠟切片。圖4是免疫組織化學檢測分析CK19單克隆抗體染色人結(jié)腸腺癌石蠟切片。圖5是免疫組織化學檢測分析CK19單克隆抗體染色人肝臟膽管組織石蠟切片。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。實施例1:雜交瘤細胞株11F5及其產(chǎn)生的單克隆抗體的獲得1、抗原制備(I)獲得目的基因在該實施例中， 根據(jù)CK19的基因序列(BC002539.2)的編碼框，設(shè)計I對特異引物:
引物1:5' -GGATCCATGACTTCCTACAGCTATCGCC-3' (SEQ ID NO:1)引物2:5' -CTCGAGTCAGAGGACCTTGGAGGCAG-3' ; (SEQ ID NO:2)Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴增CK19基因。(2)構(gòu)建重組表達載體將步驟(I)獲得的PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入表達載體PET28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-CK19。(3)獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種將步驟(2)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。(4)誘導表達和蛋白純化將步驟(2)提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑選單克隆至IOml含有硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，370C，220rpm培養(yǎng)10h，取5ml液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至250ml的大瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD值為0.8，加入0.2mMIPTG誘導表達，16°C誘導過夜，收集菌液超聲，取上清用N1-NTA瓊脂糖親和層析法純化CK19蛋白。2、單抗的制備和純化(I)、免疫動物—般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行三次免疫注射。首次免疫。純化的重組蛋白CK19 (用適量生理鹽水稀釋)+完全弗氏佐劑，100 μ g/只，頸背部皮下多點注射；二次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白CK19(用適量生理鹽水稀釋)+不完全弗氏佐劑，IOOyg/只，頸背部皮下多點注射；三次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白CK19 (用適量生理鹽水稀釋)，不完全弗氏佐劑，IOOyg/只，頸背部皮下多點注射；三次免疫后7 10天采血，用建立的ELISA法檢測效價，選擇效價最高者用于細胞融合。加強免疫(融合前3天)，用純化的重組蛋白50yg腹腔注射。3天后，取脾臟融
口 ο(2)、細胞融合采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細胞懸液。將準備好的同系骨髓瘤細胞SP2/0與小鼠脾細胞按一定比例混合(I: 5 I: 10)，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤 細胞。采用HAT選擇性培養(yǎng)基，進行雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)和篩選。用ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清:以純化的CK19蛋白(10 μ g/ml)包被酶標板，每孔100 μ 1,4°C包板過夜。甩掉包被液,加入200 μ 15%的脫脂奶粉,37°C封閉Ih后，洗滌3次，加雜交瘤細胞培養(yǎng)檢測上清IOOy I (陰性對照為PBSlOOy I)，37°C孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37°C孵育I小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50 μ I，室溫靜置5分鐘，加終止液50 μ I。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。OD值明顯高于陰性對照2倍以上者定為陽性。最后篩選得到一株分泌性能最佳的抗CK19雜交瘤細胞株，命名為11F5，亞型鑒定為IgGl。將選出的陽性雜交瘤細胞株11F5克隆化培養(yǎng)(有限稀釋法)，獲得能產(chǎn)生高效價單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆。將雜交瘤細胞株擴大培養(yǎng)，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細胞為抗人CK19雜交瘤細胞系11F5，該細胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6913。(3)單克隆抗體的大量制備與純化將步驟⑵獲得的細胞株11F5接種至Balb/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中提取抗體。單克隆抗體CK19的純化:采用Protein A親和層析法。首先制備protein A親和柱，用PBS平衡柱子后，取抗CK19的腹水過柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脫，收集峰值區(qū)的洗脫液，經(jīng)透析濃縮后備用。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖1)。(4)直接ELISA法測定純化抗體的滴度以純化的CK19蛋白(10μ g/ml)包被酶標板，每孔100μ 1，4°C包板過夜。甩掉包被液，加入200 μ 15%的脫脂奶粉，37°C封閉Ih后，洗滌3次，將純化的抗體按1: 200，I: 400，I: 800，I: 1600，I: 3200，I: 6400，I: 12800 進行稀釋，以每孔 100 μ I 加入酶標板中(陰性對照為PBSlOOy I)，37°C孵育I小時。洗滌3遍后，加酶標記二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37 °C孵育I小時，去掉酶標二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μ 1，室溫靜置5分鐘，加終止液50 μ I。用酶標儀檢測450nm波長處的OD值。ELISA滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1: 10000以上(參見圖2)。實施例2:單克隆抗體應(yīng)用免疫組化應(yīng)用檢測用CK19單抗，按常規(guī)法作病理切片，對人甲狀腺乳頭狀癌、結(jié)腸腺癌及肝臟膽管組織石蠟切片進行免疫組化染色。具體方法為:(I)脫蠟切片依次置于二甲苯1、I1、III脫蠟每次5分鐘，移至無水乙醇1、II中各浸泡4分鐘，移至95%酒精中浸泡4分鐘，移至85%酒精中浸泡4分鐘，再移至70%酒精中浸泡4分鐘，流水沖洗2分鐘。(2)抗原修復將已沖洗干凈組織切片放入高壓鍋內(nèi)，加入約3000ml左右的檸檬酸鹽抗原修復液(pH6.0)，高火加熱煮沸后調(diào)至低火保持沸騰噴氣3分鐘，關(guān)掉電磁爐開關(guān)，兩分鐘后將高壓鍋移至冷水中冷卻，待高壓鍋內(nèi)抗原修復液完全冷卻后，打開高壓鍋將組織切片用流水沖洗干凈移至蒸餾水中浸泡2分鐘。(3)阻斷

3 % H2O2中浸泡10分鐘，流水沖洗蒸餾水沖洗。取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍畫一圓圈注意圈接頭要接好，防止抗體跑出圈外造成假陰性。PBS緩沖液沖洗。(4)滴加一抗甩去待測組織切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗為實施例1步驟(3)制備并純化的CK19單克隆抗體，稀釋度為1: 1500。放置在孵育盒內(nèi)4°C冰箱中過夜孵育約12小時。(5)滴加二抗將孵育盒從冰箱取出，恢復至室溫后取出切片，用PBS洗3次，每次5分鐘。滴加通用型二抗-HRP聚合物。將切片放入孵育濕盒中，蓋上蓋子，連孵育盒一起放入37°C恒溫箱中孵育30分鐘。(6)顯色、襯染、封片取出切片，擦掉組織周圍的多余的PBS，加入DAB顯色液中顯色3 5分鐘，在顯微鏡下控制染色的強度。待強度適中后將切片置自來水中終止顯色，再用流水沖洗5 10分鐘，蘇木素染液復染I分鐘，0.5 %鹽酸酒精分化3秒鐘，流水沖洗5 10分鐘，脫水、透明、封片、鏡檢。 結(jié)果判定:按照國外學者對組織中CK19的判定標準，CK19蛋白陽性反應(yīng)為黃到棕黃色細小顆粒，定位于胞漿。人甲狀腺乳頭狀癌(參見圖3)、結(jié)腸腺癌(參見圖4)及肝臟膽管組織(參見圖5)經(jīng)抗CK19抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞漿內(nèi)出現(xiàn)呈均勻著色的棕黃色顆粒，背景清晰，無非特異性著色，說明此CK19小鼠單克隆抗體可以特異性的應(yīng)用于免疫組織化學實驗。實施例3:單克隆抗體可變區(qū)測序根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成以下引物:zh085/ -GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3' (SEQID NO:3)zhrll5/ -GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3' (SEQID NO:4)zl025/ -GGGGATATCCACCATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG-3' (SEQIDNO:5)zlr055/ -GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQID NO:6)Trizol Reagent試劑分別提取5X IO6雜交瘤細胞3G7的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用zh08和zhrll為引物進行PCR擴增單克隆抗體β-Tubulin重鏈可變區(qū)，用zlOl和zlr05為引物進行PCR擴增單克隆抗體β -Tubulin輕鏈可變區(qū)，PCR反應(yīng)均采用熱啟動，反應(yīng)條件:94°C 5分鐘；94°C 45秒，60°C 45秒，72°C I分10秒，30個循環(huán)；72°C 7分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化目的片段(輕鏈長度391bp，重鏈長度420bp)?？寺〉絇GEM-T(Promega)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細胞后在IPTGIX-gal平板上進行篩選，取白色菌斑接種于含有氨韋青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴增。篩選陽性克隆，用QIAGEN的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒并進行測序,確定了單克隆抗體β -Tubulin的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。單克隆抗體β -Tubulin可變區(qū)的DNA序列和氨基酸序列:單克隆抗體β-Tubul in 重鏈可變區(qū) DNA 序列(5' —3' , 336bp) (SEQ ID NO:7)；單克隆抗體β-Tubulin 的輕鏈可變區(qū) DNA 序列(5' —3'，387bp) (SEQ ID NO:
8)；
單克隆抗體β -Tubulin重鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(I 12氨基酸)(SEQ ID NO:
9)；單克隆抗體β -Tubulin輕鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(128氨基酸)(SEQ10IDNO:10)。`
權(quán)利要求
1.一種以原核表達的CK19蛋白免疫小鼠獲得的分泌CK19單克隆抗體的雜交瘤細胞株11F5，保藏編號為 CGMCC N0.6913。
2.一種由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞株11F5產(chǎn)生的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:10o
4.一種DNA分子SEQ ID NO:7，它編碼權(quán)利要求3中所述的重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQID NO:9。
5.一種DNA分子SEQ ID NO:8，它編碼權(quán)利要求3中所述的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQID NO :10o
全文摘要
一種小鼠抗人CK19單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。所述的分泌CK19單克隆抗體的雜交瘤細胞株克隆號為11F5，保藏編號為CGMCC No.6913。本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細胞株11F5產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO10。本發(fā)明還提供了一種DNA分子SEQ ID NO7，它編碼重鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ IDNO9；一種DNA分子SEQ ID NO8，它編碼輕鏈可變區(qū)氨基酸序列SEQ ID NO10。該抗體可用于科研或臨床免疫組化檢測CK19表達。
文檔編號C12N5/20GK103173416SQ20131004130
公開日2013年6月26日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者張林剛, 郗日沫, 尹芝南 申請人:天津三箭生物技術(shù)有限公司