專利名稱：鑒別中國與北美牛肝菌的分子特異性標記引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別中國牛肝菌Boletus roseofIavus與北美牛肝菌B.speciosus的分子特異性標記引物，以及一種利用該引物對中國與北美牛肝菌標本進行快速辨別的方法。
背景技術(shù)：
Boletus roseofIavus 隸屬牛肝菌目 Boletales 下 Boletus 屬的 AppendiculatiKonrad&Maubl.ex Lannoy&Estades 類群，目前僅發(fā)現(xiàn)分布于中國。中國 B.roseofIavus的鑒別特征為菌蓋淡粉紅色、紫紅色、玫瑰紅色，菌肉暴露在空氣中不變藍，或緩慢變藍，菌孔受傷后立刻變藍，擔孢子的平均長寬比小于3。在過去的很多年里，分布于云南的B.roseoflavus種一直被我國的菌 物學家錯誤地冠以了北美B.speciosus的種名。北美B.speciosus的鑒別特征為菌蓋顏色為鮮紅到玫瑰紅色，菌肉、菌孔受傷后均立刻變藍。由于B.roseoflavus與B.speciosus在形態(tài)特征、顏色和變色反應上的差別并不顯著，因而過去一直將中國云南的B.roseoflavus標本錯誤鑒定為B.speciosus,國內(nèi)有大量文獻對此有過記載。事實上，B.roseoflavus與B.speciosus并非同種,迄今在中國尚未發(fā)現(xiàn)有真正的B.speciosus存在，這一結(jié)論后來也得到了分子數(shù)據(jù)的支持。對B.roseoflavus和B.speciosus這二個相似種辨別的主要特征是宏觀上并不顯著的子實體顏色差異和變色反應。但由于顏色差異易受生境、氣候、土壤、子實體生長期、生理狀況等的影響而常常導致主觀判別上的偏差，而對于長期保藏的干標本，特別是對古老標本、模式標本的重新鑒別研究，僅憑顏色差異更是難以準確鑒定。因此，在大型真菌分類研究上，分子技術(shù)已成為了對標本輔助鑒定的重要手段。真菌的核糖體基因rRNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer, ITS)的保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異比較明顯，這一特點使得ITS區(qū)段不僅適合于屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，而且非常適合于真菌物種的分子鑒定。對B.roseoflavus和B.speciosus的ITS區(qū)測序結(jié)果顯不，B.roseoflavus和B.speciosus的ITS1-5.8S-1TS2序列長度分別為690 706bp和664bp,很難利用通用引物對(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR擴增、普通電泳來準確分辨開來。對二個相似種的ITS序列比對顯示二者的局部序列存在一些差異，這為設計ITS特異引物，針對性地擴增ITS特異片段，以方便用于這二個相似種的分子輔助鑒定提供了可能性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種可鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和北美牛肝菌B.speciosus的分子特異性標記引物，以及一種利用該引物對中國和北美牛肝菌進行快速辨別的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和北美牛肝菌B.speciosus的分子特異性標記引物，其核苷酸序列如下:上游引物:5'-ATTGAAGACCGTCCGGGATG-3'下游引物:5'-AGTTAAAAGTGACCAAGCC-3' 該引物對是采用PCR技術(shù)，經(jīng)過對中國牛肝菌標本B.roseoflavus和北美牛肝菌標本B.speciosus的核糖體基因ITS區(qū)序列的克隆測序，以得到的ITS序列進行堿基差異比對，并以此設計ITS特異性引物對。以該引物對B.roseoflavus和B.speciosus進行PCR擴增，可從B.roseoflavus中獲得437bp大小的特異性片段。本發(fā)明還涉及所述的分子特異性標記引物在鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和北美牛肝菌B.speciosus中的應用。本發(fā)明還涉及一種利用所述分子特異性標記引物鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和北美牛肝菌B.speciosus的方法，所述方法包括:提取待測牛肝菌標本基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)437bp的DNA條帶，則待測牛肝菌為B.roseoflavus,若電泳結(jié)果未出現(xiàn)437bp的DNA條帶，則待測牛肝菌為B.speciosus ；所述分子特異性標記引物序列為:上游引物:5'-ATTGAAGACCGTCCGGGATG-3'下游引物:5'-AGTTAAAAGTGACCAAGCC-3'所述方法關(guān)鍵在于擴增引物的選擇、DNA提取、PCR反應體系及反應條件確定，以及電泳檢測，均可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進行。需要說明的是，本發(fā)明分子特異性標記引物和檢測方法僅適用于中國牛肝菌B.roseoflavus和北美牛肝菌B.speciosus的鑒別，即待測標本是限定為中國牛肝菌標本B.roseoflavus和北美牛肝菌標本B.speciosus的范圍內(nèi)的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)子實體形態(tài)特征和顏色先進行初步的判斷，再將判斷為B.roseoflavus或B.speciosus的牛肝菌標本用本發(fā)明方法進行鑒別。中國牛肝菌B.roseoflavus和北美牛肝菌B.speciosus在形態(tài)特征、顏色和變色反應上的差別并不顯著，因而在過去有大量國內(nèi)文獻記載過將B.roseoflavus錯誤鑒定為B.speciosus。對B.roseoflavus和B.speciosus的辨別主要通過二者子實體顏色上的些許差異，但對顏色差異的判別具有很強的主觀性，常常出現(xiàn)偏差，而且對于干標本，特別是古老標本、模式標本已很難僅僅通過顏色差異來準確鑒定。采用本發(fā)明方法，可對相似種B.roseoflavus和B.speciosus進行快速的分子鑒定,方法簡單、快捷、準確,是形態(tài)特征辨別的有效輔助。所述PCR擴增反應體系組成如下(總體積25 μ L):
權(quán)利要求
1.一種鑒別中國牛肝菌B.roseof Iavus和北美牛肝菌B.speciosus的分子特異性標記引物，其核苷酸序列如下: 上游引物:5' -ATTGAAGACCGTCCGGGATG-3' 下游引物:5' -AGTTAAAAGTGACCAAGCC-3'。
2.如權(quán)利要求1所述的分子特異性標記引物在鑒別中國牛肝菌B.roseoflavus和北美牛肝菌B.speciosus中的應用。
3.一種利用權(quán)利要求1所述分子特異性標記引物鑒別中國牛肝菌B.roseofIavus和北美牛肝菌B.speciosus的方法，所述方法包括:提取待測牛肝菌標本基因組DNA作為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若電泳結(jié)果出現(xiàn)437bp的DNA條帶,則待測牛肝菌為B.roseof Iavus,若電泳結(jié)果未出現(xiàn)437bp的DNA條帶,則待測牛肝菌為B.speciosus ； 所述分子特異性標記引物序列為: 上游引物:5' -ATTGAAGACCGTCCGGGATG-3' 下游引物:5' -AGTT AAAAGTGACCAAGCC-3'。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述PCR擴增條件如下:94°C預變性6min后；94°C變性40s，65°C退火40s ，72°C延伸2min，共30個循環(huán)；最后于72°C補平7min，終止溫度為4°C。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于方法如下: (1)取待測牛肝菌標本子實體，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待測牛肝菌的基因組DNA ； (2)以步驟(I)提取的基因組DNA為模板，以所述分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增:
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可鑒別中國牛肝菌Boletus roseoflavus與北美牛肝菌B.speciosus的分子特異性標記引物，以及一種利用該引物對中國牛肝菌Boletus roseoflavus與北美牛肝菌B.speciosus進行快速辨別的方法。所述分子特異性標記引物核苷酸序列如下上游引物5′-ATTGAAGACCGTCCGGGATG-3′下游引物5′-AGTTAAAAGTGACCAAGCC-3′本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明分子特異性標記引物可對中國牛肝菌Boletus roseoflavus與北美牛肝菌B.speciosus進行快速的分子鑒定，方法簡單、快捷、準確，是形態(tài)特征辨別二種牛肝菌的有效輔助。
文檔編號C12Q1/68GK103103278SQ20131003722
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者李海波, 魏海龍, 王麗玲, 付立忠, 胡傳久 申請人:浙江省林業(yè)科學研究院