基于纖溶酶原激活物抑制劑－1的流產(chǎn)、早產(chǎn)治療藥的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種診斷早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其特征在于，測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度。詳細(xì)而言，涉及一種特征在于在纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度低于正常孕婦的活性或濃度時(shí)判斷為引起早產(chǎn)或流產(chǎn)的危險(xiǎn)性高的、診斷早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法、早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)診斷用試劑盒、及含有纖溶酶原激活物抑制劑－1的用于預(yù)防早產(chǎn)或流產(chǎn)的藥物組合物。
【專利說明】基于纖溶酶原激活物抑制劑一 1的流產(chǎn)、早產(chǎn)治療藥
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種診斷早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其特征在于，測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度。詳細(xì)而言，涉及一種特征在于在纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度低于正常孕婦的活性或濃度時(shí)判斷為引起早產(chǎn)或流產(chǎn)的危險(xiǎn)性高的診斷早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法、早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)診斷用試劑盒、及含有纖溶酶原激活物抑制劑一I的用于預(yù)防早產(chǎn)或流產(chǎn)的藥物組合物。
【背景技術(shù)】
[0002]作為早產(chǎn)及流產(chǎn)的主要原因，已知有絨毛膜下血腫。目前，針對(duì)絨毛膜下血腫進(jìn)行了基于超聲波斷層法的圖像診斷，但未確立血液學(xué)的診斷方法、治療方法。因此，一旦絨毛膜下血腫發(fā)生并進(jìn)展，則無法避免早產(chǎn)及流產(chǎn)。
[0003]纖溶酶原激活物抑制劑一I(Plasminogen activator inhibitor — I (PAI — I))是絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor (SERPIN))超家族中的一員，是尿激酶型纖溶酶原激活物及組織型纖溶酶原激活物的主要的生理性的控制因子。大量研究顯示PA1-1的水平上升與動(dòng)脈血栓(非專利文獻(xiàn)I)、癌患者的預(yù)后不良(非專利文獻(xiàn)2)等若干病態(tài)相關(guān)聯(lián)，由于PAI — I缺損的病例數(shù)少，因此關(guān)于PA1-1缺損的知識(shí)仍有限。本發(fā)明人等近年來報(bào)告了對(duì)人進(jìn)行了遺傳學(xué)鑒定的完全PA1-1缺損的案例(非專利文獻(xiàn)3)。所述患者顯示出大出血的傾向，這是目前為止的報(bào)告中在PA1-1缺損患者中也被觀察到的傾向(非專利文獻(xiàn)4)。
[0004]可成為出血原因的基因的變化與妊娠中的并發(fā)癥相關(guān)聯(lián)。上述關(guān)聯(lián)的最顯著的實(shí)例是先天性的無纖維蛋白原血癥、先天性凝固因子XIII (FXIII)缺損，它們?nèi)艟S持不治療的狀態(tài)，則引起生殖器出血、妊娠6?8周時(shí)的自然流產(chǎn)(非專利文獻(xiàn)5及6)。
[0005]非專利文獻(xiàn)1:Semin Thromb Hemost2009 ;35:468-77
[0006]非專利文獻(xiàn)2:1mmunol Lett2008 ; 118:116-24
[0007]非專利文獻(xiàn)3: J Thromb Haemost2011 ；9:1200-6
[0008]非專利文獻(xiàn)4:N Engl J Medl992 ;327:1729-33
[0009]非專利文獻(xiàn)5: Curr Drug Targets2005 ；6:535-9
[0010]非專利文獻(xiàn)6:0bstet Gynecol Surv2007 ；62:255-60

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的在于提供絨毛膜下血腫的簡(jiǎn)便且精度高的新型診斷方法及治療絨毛膜下血腫的方法，通過上述方法早期診斷由絨毛膜下血腫引起的早產(chǎn)及流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，從而預(yù)防早產(chǎn)及流產(chǎn)。
[0012]本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)PA1-1缺損癥的患者若妊娠則絨毛膜下血腫發(fā)病而流產(chǎn)，以及若對(duì)所述患者給予含有PA1-1的新鮮冷凍血漿則阻止絨毛膜下血腫的進(jìn)展，可維持妊娠(Thrombosis Researchl29:4, el61_el63)。進(jìn)而,本發(fā)明人等基于上述知識(shí),發(fā)現(xiàn)能夠基于PAI活性判定由絨毛膜下血腫引起的流早產(chǎn)的發(fā)病危險(xiǎn)性，從而完成了本發(fā)明。
[0013]gp，本發(fā)明提供以下[I]?[14]。
[0014][I] 一種診斷早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其特征在于，測(cè)定從受試者分離的血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度。
[0015][2]如[I]所述的方法，其中，以優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間作為指標(biāo)，測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑活性。
[0016][3]如[2]所述的方法，其中，在優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間為500分鐘以下時(shí)，判斷為引起
早產(chǎn)或流產(chǎn)的危險(xiǎn)性高。
[0017][4]如[2]或[3]所述的方法，其中，在優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間為350分鐘以下時(shí)，判斷為引起早產(chǎn)或流產(chǎn)的危險(xiǎn)性高。
[0018][5]如[2]?[4]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，還包括在血漿中添加鈣、測(cè)定優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間的工序及求出不添加鈣的情況下的優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間與添加了鈣的情況下的優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間的比率的工序，基于該比率判斷為引起早產(chǎn)或流產(chǎn)的危險(xiǎn)性高。
[0019][6]如[I]所述的方法，其中，通過使用了與纖溶酶原激活物抑制劑一I結(jié)合的抗體的免疫學(xué)測(cè)定方法，測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑濃度。
[0020][7]如[6]所述的方法，其中，通過ELISA法測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑濃度。
[0021][8]如[6]所述的方法，其中，通過AlphaLISA法測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑濃度。
[0022][9]如[I]?[8]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，早產(chǎn)或流產(chǎn)是由絨毛膜下血腫引起的早產(chǎn)或流產(chǎn)。
[0023][10] 一種早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)診斷用試劑盒，含有包含α —凝血酶、及鈣離子或高嶺土的水溶液。
[0024][11] 一種早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)診斷用試劑盒，含有與纖溶酶原激活物抑制劑一I結(jié)合的抗體。
[0025][12]如[10]或[11]所述的試劑盒，其中，早產(chǎn)或流產(chǎn)是由絨毛膜下血腫引起的早
產(chǎn)或流產(chǎn)。
[0026][13] 一種用于預(yù)防早產(chǎn)或流產(chǎn)的藥物組合物，含有纖溶酶原激活物抑制劑一 I。
[0027][14]如[13]所述的藥物組合物，其中，早產(chǎn)或流產(chǎn)是由絨毛膜下血腫引起的早產(chǎn)或流產(chǎn)。
[0028]若使用本發(fā)明，則可利用血液學(xué)方法并且定量地診斷一直以來只能利用基于超聲波斷層法的圖像診斷進(jìn)行診斷的絨毛膜下血腫及早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。因此，能夠早期診斷早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及提高早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的診斷精度。另外，通過本發(fā)明，即使在發(fā)生了絨毛膜下血腫的情況下也能夠維持妊娠、防止流早產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029][圖1]圖1表示在PA1-1缺損癥患者的三次妊娠過程中觀察到的生殖器出血(G.B.) (g)、給予了的新鮮冷凍血漿(FFP) (U:1U =從200mL的血液中分離的血漿)、及血漿D—二聚體濃度(yg/mL)。黑箭頭表示流產(chǎn)日，白箭頭表示進(jìn)行了緊急剖宮產(chǎn)的時(shí)間?！揪唧w實(shí)施方式】
[0030]1.定義
[0031]“纖溶酶原激活物抑制劑一I (Plasminogen activator inhibitor — I (PAI —
1))”是絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor (SERPIN))超家族中的一員，是尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase type plasminogen activator (uPA))及組織型纖溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator(tPA))的主要的生理性控制因子。
[0032]“纖溶酶原激活物抑制劑一2 (Plasminogen activator inhibitor — 2 (PAI —
2))”是SERPIN超家族中的一員，是uPA及tPA的生理性控制因子。PAI— 2來自胎盤，在非妊娠時(shí)基本未發(fā)現(xiàn)。
[0033]本發(fā)明中，所謂“纖溶酶原激活物抑制劑活性”、“PAI活性”及“PAI的活性”，是指PAI — I及PAI — 2具有的、使纖溶酶原激活物失活而抑制纖維蛋白溶解系統(tǒng)(纖溶系統(tǒng))的活性，表示PAI — I及PAI — 2具有的纖溶抑制活性的總和。雖然妊娠中由胎盤也分泌PA1- 2，但纖溶抑制活性即使在孕婦中也以PA1-1活性為主，因此在本發(fā)明中測(cè)定的PAI活性表示主要由PA1-1引起的活性。需要說明的是，纖溶酶原激活物抑制劑活性越高，纖溶系統(tǒng)越被強(qiáng)烈地抑制。
[0034]所謂“絨毛膜下血腫”，是從妊娠初期至中期經(jīng)常被見到的、在胎盤與蛻膜之間出現(xiàn)的血腫，其特征在于，沿胎盤的邊緣而形成。妊娠初期見到的絨毛膜下血腫大多自然消退，但也有持續(xù)至妊娠中期的情況。絨毛膜下血腫持續(xù)的情況下，由于不能抑制子宮收縮、生殖器出血增加、子宮內(nèi)感染等而導(dǎo)致胎盤功能不全、流早產(chǎn)的概率升高。
[0035]本發(fā)明中，所謂“早產(chǎn)”是指在妊娠22周以后不足37周時(shí)生產(chǎn)，所謂“流產(chǎn)”是指妊娠不足22周時(shí)妊娠喪失。另外，本說明書中，指早產(chǎn)及流產(chǎn)時(shí)，也記作“流早產(chǎn)”。
[0036]本發(fā)明中，所謂“早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)”或“流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)”，是指用于判斷受試者是否流早產(chǎn)的檢查判定基準(zhǔn)。流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)越高，判斷為流早產(chǎn)的可能性越高，該流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)越低，判斷為流早產(chǎn)的可能性越低或是正常的妊娠。
[0037]2.判定早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法
[0038]本發(fā)明涉及判定早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其特征在于，測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度。
[0039](I)血漿的分離
[0040]就本發(fā)明中測(cè)定的試樣而言，通常從受試者采集血液，由所采集的血液制備血漿進(jìn)行使用。采血可使用本領(lǐng)域公知的方法，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員則可適宜選擇，優(yōu)選凝血系統(tǒng)因子的保存良好的、作為抗凝劑使用檸檬酸鈉的方法。本發(fā)明可將末梢血用作試樣。作為制備血漿的方法，可使用離心等本領(lǐng)域公知的方法。取得的血漿可以冷凍保存至測(cè)定。[0041 ] (2)纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度的測(cè)定
[0042]本發(fā)明中，作為測(cè)定纖溶酶原激活物抑制劑活性的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法、即優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間(euglobulin clot lysis time (ECLT))的測(cè)定方法。此處，所謂優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間，是測(cè)定直至在血漿優(yōu)球蛋白成分分離中所制作的凝塊自然溶解為止的時(shí)間，總括地表示主要由PA1-1和tPA的平衡決定的血漿所具有的纖溶活性。但是妊娠中由于由胎盤也分泌纖溶酶原激活物抑制劑一 2，所以孕婦的ECLT中得到的結(jié)果嚴(yán)密地來說是纖溶酶原激活物抑制劑一 I的活性與纖溶酶原激活物抑制劑一 2的活性的總和。但是就纖溶抑制活性而言，即使對(duì)于孕婦來說也是以纖溶酶原激活物抑制劑一 I活性為主，因此，在本發(fā)明中使用ECLT測(cè)定的PAI活性表示主要由PAI — I引起的活性。
[0043]優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間的測(cè)定方法是除去抗纖溶酶并測(cè)定纖維蛋白的溶解時(shí)間的方法，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員則可適宜實(shí)施。具體而言，將血漿用乙酸緩沖液稀釋并靜置后，離心采集沉淀，將該沉淀用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris buffer)混合而得到優(yōu)球蛋白成分。在含有α —凝血酶及鈣離子或者高嶺土的溶液中添加優(yōu)球蛋白成分的樣品，測(cè)定沉淀的溶解時(shí)間。本發(fā)明中，將該溶解時(shí)間作為PAI活性的指標(biāo)。優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間越短PAI活性越低，即，表示纖溶活性高。
[0044]本發(fā)明的一個(gè)方案中，也可以求出不添加鈣離子而測(cè)定的優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間(Regular ECLT)、與添加鈣離子而測(cè)定的優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間(添加Ca的ECLT)的比率，將該比率作為PAI活性的指標(biāo)。需要說明的是，不添加鈣離子的情況下的優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間通過將與上述同樣地制備的優(yōu)球蛋白成分的樣品添加至含α —凝血酶的溶液中，測(cè)定沉淀的溶解時(shí)間而求出。
[0045]作為測(cè)定纖溶酶原激活物抑制劑濃度的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，即，使用了抗PAI — I抗體的免疫學(xué)測(cè)定方法。具體而言,可使用蛋白免疫印跡(Westernblotting)法、免疫沉淀法、酶免疫測(cè)定法(EIA)、酶聯(lián)免疫測(cè)定法(ELISA法)、熒光免疫測(cè)定法(FIA)、放射免疫測(cè)定法(RIA)、及AlphaLISA法(注冊(cè)商標(biāo)、PerkinElmer)等。
[0046]Alphalisa法是利用下述發(fā)光信號(hào)的分析方法，所述發(fā)光信號(hào)僅在結(jié)合至供體微珠(donor beads)的分子與結(jié)合至受體微珠(acceptor beads)的分子進(jìn)行生物學(xué)相互作用而使得兩種微珠(beads)接近了的狀態(tài)時(shí)被檢出。具體而言，在抗原存在下將這兩種微珠緊密接近，基于激光的供體微珠的激發(fā)引起單線態(tài)氧分子的釋放，其與受體微珠內(nèi)的甲狀腺素衍生物反應(yīng)而開始進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，由該反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光能量轉(zhuǎn)移至存在于相同微珠內(nèi)的熒光物質(zhì)，由此光被釋放。因此，本發(fā)明中，若使用結(jié)合了抗PA1-1抗體的供體微珠及受體微珠進(jìn)行AlphaLISA法，則能夠定量PAI — I濃度。另外，本發(fā)明中，可以使抗PAI 一 I抗體及uPA分別結(jié)合至供體微珠或受體微珠，制備結(jié)合了抗PA1-1抗體的供體微珠及結(jié)合了 uPA的受體微珠、或結(jié)合了 uPA的供體微珠及結(jié)合了抗PA1-1抗體的受體微珠，使用所述微珠實(shí)施AlphaLISA法。此時(shí)，由于僅樣品中具有活性的PAI — I與供體微珠及受體微珠結(jié)合，因此作為結(jié)果可測(cè)定PA1-1活性。
[0047]纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度的測(cè)定不限于上述方法，可使用能夠測(cè)定該活性或濃度的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。另外，也可利用多種上述測(cè)定方法。
[0048](3)流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的判定
[0049]本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)PA1-1缺損癥患者若妊娠則絨毛膜下血腫發(fā)病而流產(chǎn)；以及，若對(duì)所述患者給予含有PA1-1的新鮮冷凍血漿則阻止絨毛膜下血腫的進(jìn)展，可維持妊娠。另外，明確了在所述患者中由于PA1-1缺損導(dǎo)致血液的纖溶系統(tǒng)異?？哼M(jìn)，卵膜與子宮的粘合性降低，發(fā)生絨毛膜下血腫。進(jìn)而，本發(fā)明人等基于上述知識(shí)發(fā)現(xiàn)基于PAI活性或濃度能夠診斷絨毛膜下血腫、以及能夠判定由絨毛膜下血腫引起的流早產(chǎn)的發(fā)病危險(xiǎn)性。
[0050]基于上述知識(shí)，本發(fā)明中，在通過上述方法測(cè)定的纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度低于正常孕婦的標(biāo)準(zhǔn)值一標(biāo)準(zhǔn)誤差的情況下，判斷為存在絨毛膜下血腫發(fā)病的可能性、受試者的流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高。
[0051]具體而言，使用優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間作為指標(biāo)的情況下，PAI活性低于正常孕婦血漿的情況下，例如優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間為約500分鐘以下、約400分鐘以下、約350分鐘以下、或約200分鐘以下時(shí)，判斷為受試者的流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高。使用不添加鈣離子測(cè)定的優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間(Regular ECLT)、與添加鈣離子測(cè)定的優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間(添加Ca的ECLT)的比率(Regular ECLT/添加Ca的ECLT)作為指標(biāo)的情況下，例如為約
5.0以下、約4.0以下、約3.0以下、或約1.5以下時(shí)，判斷為受試者的流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高。
[0052]另外，使用纖溶酶原激活物抑制劑濃度作為指標(biāo)的情況下，纖溶酶原激活物抑制劑濃度低于正常孕婦血漿的情況下，例如為正常孕婦的不足0.75倍、不足0.5倍、不足0.25倍、或不足0.1倍時(shí)，判斷為受試者的流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高。通過ELISA法測(cè)定PAI — I濃度的情況下，PAI — I濃度例如為約4ng/ml以下、約3ng/ml以下、約2ng/ml以下、約1.6ng/ml以下、或約lng/ml以下時(shí)，判斷為受試者的流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高。根據(jù)AlphaLISA法測(cè)定PAI — I濃度的情況下,PAI — I濃度為例如約60ng/ml以下、約40ng/ml以下、約20ng/ml以下、或約10ng/ml以下時(shí)，判斷為受試者的流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高。
[0053]本發(fā)明中，可以基于通過一種測(cè)定方法得到的PA1-1活性或濃度判定受試者的流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，也可以基于通過多種測(cè)定方法得到的PAI — I活性或濃度判定受試者的流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。
[0054]3.流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)判定用試劑盒
[0055]本發(fā)明涉及的試劑盒只要是用于實(shí)施上述2.欄中說明的判定流早產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法即可，其中含有的具體的構(gòu)成、材料、設(shè)備等沒有特別限定。
[0056]在本發(fā)明的一個(gè)方案中，本發(fā)明的試劑盒含有包含α —凝血酶、及氯化鈣等鈣離子的水溶液或高嶺土。進(jìn)而，本發(fā)明的試劑盒也可以含有乙酸緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、及磷酸緩沖液等緩沖液。另外，本發(fā)明的試劑盒還可以含有裝有檸檬酸鈉緩沖液的采血管。
[0057]本發(fā)明的其他方案中，本發(fā)明的試劑盒含有針對(duì)抗纖溶酶原激活物抑制劑一 I的抗體(一抗)。抗體只要是能夠識(shí)別纖溶酶原激活物抑制劑一 I的抗體即可，可以為多克隆抗體，也可以為單克隆抗體。另外，根據(jù)情況，也可使用抗體片段，例如Fab、Fab’、F(ab’ )2等。進(jìn)而，本發(fā)明的試劑盒也可含有固相載體、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及二抗。另外，本發(fā)明的試劑盒還可以含有纖溶酶原激活物抑制劑一 I的標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋液、緩沖液以及用于抗原抗體復(fù)合體的檢測(cè)反應(yīng)的底物及終止溶液。
[0058]作為固相載體，可以舉出例如玻璃、塑料、天然或修飾纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、磁體、或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他適合材料形成的載體，作為該固相載體的形狀，也可以制成例如板、孔、載玻片、微珠、粒子、管、纖維、膜的形狀。另外，作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，只要是可用于免疫學(xué)的方法的物質(zhì)則可以使用，可舉出例如酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等。抗體可以固定于固相載體。
[0059]就本發(fā)明的試劑盒而言，進(jìn)一步地作為二抗可以含有與針對(duì)纖溶酶原激活物抑制劑一 I的抗體結(jié)合的抗體、或識(shí)別與一抗識(shí)別的表位不同的表位的針對(duì)纖溶酶原激活物抑制劑一 I的抗體。二抗可以被酶、放射性同位素、熒光色素、抗生物素、生物素等標(biāo)記。[0060]4.含有纖溶酶原激活物抑制劑一 I的用于預(yù)防流早產(chǎn)的藥物組合物
[0061]本發(fā)明的藥物組合物中含有纖溶酶原激活物抑制劑一 I (PA1-1)作為主成分。另夕卜，本發(fā)明的藥物組合物也可以以具有與PA1-1為同等以上的活性的突變型纖溶酶原激活物抑制劑一 I (突變型PA1-1)作為主成分。此處，所謂“同等的活性”，是指PAI — I所具有的將纖溶酶原激活物失活而抑制纖溶系統(tǒng)的活性的強(qiáng)度實(shí)質(zhì)上相同，所謂“突變型纖溶酶原激活物抑制劑一 I”是指，野生型PA1-1的氨基酸序列中具有I個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、添加或插入的PAI — I。上述所謂“I個(gè)或數(shù)個(gè)”是10以下的整數(shù)個(gè)，例如I?10個(gè)左右，優(yōu)選I?5個(gè)左右。
[0062]另外，本發(fā)明的藥物組合物中，只要不損害預(yù)防早產(chǎn)及/或流產(chǎn)這樣的效果，則也可進(jìn)一步含有藥學(xué)上可接受的載體、或根據(jù)劑型不同而在該【技術(shù)領(lǐng)域】中通常使用的添加齊U。作為添加劑，可含有例如著色劑、保存劑、風(fēng)味劑、香味改善劑、提味改善劑、甜味劑、或穩(wěn)定劑、其他藥學(xué)上允許的添加劑。
[0063]本說明書中明確指出的引用的全部專利及參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參照并入本說明書中。另外，作為本申請(qǐng)具有的優(yōu)先權(quán)主張的基礎(chǔ)的申請(qǐng)即日本專利申請(qǐng)2011-249523號(hào)(2011年11月15日申請(qǐng))的說明書及附圖中記載的全部?jī)?nèi)容作為參照并入本說明書中。
[0064]以下，通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明，這些實(shí)施例不限定本發(fā)明。
[0065]實(shí)施例
[0066]1.PA1-1缺損癥患者的妊娠過程
[0067](I)第一次妊娠
[0068]患者為經(jīng)歷多次發(fā)作大量出血的47歲女性。最初的妊娠是26歲。妊娠過程順利，胎兒至16周為止成長(zhǎng)正常。妊娠16周結(jié)束時(shí)，觀察到少量的生殖器出血，患者入院。患者的凝血酶原時(shí)間、活化部分促凝血酶原激酶時(shí)間、及血漿纖維蛋白原濃度在通常的范圍內(nèi)(分別為13.0秒、34.9秒、及165mg/dL)。但是，血漿D —二聚體濃度稍微上升(2.4μ g/mL，通常的范圍為< 0.5μ g/mL)。需要說明的是，D 一二聚體是基于纖溶酶的纖維蛋白分解產(chǎn)物，D—二聚體的監(jiān)測(cè)是臨床病態(tài)中采用的纖溶動(dòng)態(tài)分析法之一。一周給予兩次新鮮冷凍血衆(zhòng)(fresh frozen plasma(FFP)),控制生殖器出血,維持了妊娠。血衆(zhòng)D—二聚體濃度在妊娠18周結(jié)束時(shí)突然上升，在妊娠19周觀察到大量的生殖器出血。在胎盤后方及周邊未觀察到無回聲區(qū)(echo-free space),但發(fā)現(xiàn)胎兒的心搏停止,患者的子宮頸部完全打開。血漿D—二聚體濃度減少、生殖器出血在清除胎兒(220g)l周后停止。流產(chǎn)的胎兒為男嬰，夕卜貌正常。
[0069](2)第二次妊娠
[0070]第二次妊娠是27歲時(shí)?；颊哂谌焉?周確認(rèn)妊娠后立刻入住本發(fā)明人等的醫(yī)院。于妊娠8周觀察到少量的生殖器出血，但該妊娠至11周為止是順利的。從妊娠11周結(jié)束開始，由于觀察到持續(xù)但少量的生殖器出血，因此開始每周給予2?3次FFP。生殖器出血于妊娠20周停止，但繼續(xù)給予FFP，妊娠得以穩(wěn)定。于妊娠28周血漿D —二聚體濃度稍微上升，因此FFP的給予頻率從每周2?3次改為隔天給予。但是，血漿D —二聚體濃度持續(xù)上升，于妊娠32周達(dá)到128 μ g/mL,通過超聲波檢查，診斷為發(fā)生伴隨胎盤剝離的無法控制的子宮收縮。因此，進(jìn)行緊急剖宮產(chǎn)，患者產(chǎn)下1736g的女嬰。手術(shù)前后的失血量為4500mL，這通過給予42U FFP而得以控制。[0071](3)第三次妊娠
[0072] 第三次妊娠是在29歲時(shí)。基于以前妊娠時(shí)的成功管理，患者于妊娠8周入院，開始連續(xù)給予FFP。FFP至妊娠16周為止為每周給予2次，至妊娠19周為止緩慢增加。在妊娠20周后，每日給予FFP。此次妊娠至妊娠24周為止是穩(wěn)定的，但血漿D —二聚體濃度從妊娠25周開始持續(xù)上升，于妊娠27周達(dá)到57.9 μ g/mL,診斷為發(fā)生伴隨胎盤剝離的無法控制的子宮收縮。因此，再次進(jìn)行緊急剖宮產(chǎn)，患者產(chǎn)下978g的女嬰。手術(shù)前后的失血量為1037mL。這兩名女兒健康無癥狀。
[0073]⑷小結(jié)
[0074]上述結(jié)果顯示PA1-1發(fā)揮對(duì)人的妊娠維持來說重要的作用。因此，認(rèn)為PAI —I為低濃度可作為人自然流產(chǎn)及/或早產(chǎn)的危險(xiǎn)因子。
[0075]2.PAI活性的測(cè)定
[0076]A.優(yōu)球蛋白凝塊溶解時(shí)間的測(cè)定方法
[0077](I)PAI活性的測(cè)定法
[0078]將通過檸檬酸采血而得到的患者血液在3000g下離心10分鐘，采集上清液，將其作為血漿樣品。將該血漿用10mM、pH4.5的乙酸緩沖液稀釋至20倍，于4°C靜置I小時(shí)。之后在4°C、1500g下離心10分鐘，采集沉淀，將該沉淀用0.1Μ、ρΗ7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖液混合。將其用作優(yōu)球蛋白成分。
[0079]在α —凝血酶12.5U/ml (最終濃度)中添加優(yōu)球蛋白成分的樣品150 μ I。測(cè)定其沉淀的溶解時(shí)間(Regular ECLT)。在α —凝血酶2.5.U/ml (最終濃度)、鈣離子IOmM (最終濃度)的溶液中添加優(yōu)球蛋白成分的樣品150 μ I。測(cè)定其沉淀的溶解時(shí)間(添加Ca的ECLT)。需要說明的是，也可以添加高嶺土(與鈣的濃度相同)來代替鈣離子。
[0080]⑵PAI活性(優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間)
[0081]對(duì)于因絨毛膜下血腫導(dǎo)致了先兆早產(chǎn)或先兆流產(chǎn)的患者及正常孕婦，按照上述(I)的方法測(cè)定PAI活性(添加Ca的ECLT)。結(jié)果匯總于表1。上述患者血液均為從妊娠初期(~15周)的患者采集的血液。
[0082][表 1]
【權(quán)利要求】
1.一種診斷早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的方法，其特征在于，測(cè)定從受試者分離的血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑活性或濃度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，以優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間作為指標(biāo)，測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑活性。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，在優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間為500分鐘以下時(shí)，判斷為引起早產(chǎn)或流產(chǎn)的危險(xiǎn)性高。
4.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中，在優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間為350分鐘以下時(shí)，判斷為引起早產(chǎn)或流產(chǎn)的危險(xiǎn)性高。
5.如權(quán)利要求2?4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，還包括在血漿中添加鈣、測(cè)定優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間的工序及求出不添加鈣的情況下的優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間與添加了鈣的情況下的優(yōu)球蛋白溶解時(shí)間的比率的工序，基于該比率判斷為引起早產(chǎn)或流產(chǎn)的危險(xiǎn)性高。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過使用了與纖溶酶原激活物抑制劑一I結(jié)合的抗體的免疫學(xué)測(cè)定方法，測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑濃度。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，通過ELISA法測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑濃度。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，通過AlphaLISA法測(cè)定血漿中的纖溶酶原激活物抑制劑濃度。
9.如權(quán)利要求1?8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，早產(chǎn)或流產(chǎn)是由絨毛膜下血腫引起的早產(chǎn)或流產(chǎn)。
10.一種早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)診斷用試劑盒，含有包含α —凝血酶、及鈣離子或高嶺土的水溶液。
11.一種早產(chǎn)或流產(chǎn)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)診斷用試劑盒，含有與纖溶酶原激活物抑制劑一 I結(jié)合的抗體。
12.如權(quán)利要求10或11所述的試劑盒，其中，早產(chǎn)或流產(chǎn)是由絨毛膜下血腫引起的早產(chǎn)或流產(chǎn)。
13.一種用于預(yù)防早產(chǎn)或流產(chǎn)的藥物組合物，含有纖溶酶原激活物抑制劑一 I。
14.如權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其中，早產(chǎn)或流產(chǎn)是由絨毛膜下血腫引起的早產(chǎn)或流產(chǎn)。
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK103959068SQ201280055808
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2012年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月15日
【發(fā)明者】金山尚裕, 梅村和夫, 巖城孝行, 浦野哲盟, 伊熊琴美 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人浜松醫(yī)科大學(xué)