專利名稱：一種抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽及其篩選方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是ー種抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶簡稱BTG)活性的多肽及其篩選方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(transglutaminase, EC2. 3. 2. 13,簡稱TG),是ー種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間以及蛋白質(zhì)與氨基酸之間形成e -(Y-Glu)-Lys異肽鍵使其共價(jià)交聯(lián)聚合，從而直接改變蛋白質(zhì)本身以及蛋白質(zhì)所附著的細(xì)胞、組織等的結(jié)構(gòu)與功能，因而該酶在食品エ業(yè)和醫(yī)藥エ業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用。TG的生產(chǎn)方法有動(dòng)植物組織提取法和微生物發(fā)酵法兩種。TG的早期生產(chǎn)采用動(dòng)物組織提取法，但由于動(dòng)物組織來源少、提取エ藝復(fù)雜、回收率低、產(chǎn)品成本過于昂貴的緣故，酶的生產(chǎn)應(yīng)用一直受到很大限制。微生物來源的TG因其酶活性不依賴Ca2+，且最有希望實(shí)現(xiàn)エ業(yè)生產(chǎn)，引起了廣泛關(guān)注，目前僅茂源鏈霉菌來源的TG實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用在食品加工中。鏈霉菌屬來源的TG具有信號(hào)肽和前肽，由于前肽的作用，使得鏈霉菌來源的TG在細(xì)胞內(nèi)沒有活性，而不損害細(xì)胞，然后通過信號(hào)肽分泌到細(xì)胞外，實(shí)現(xiàn)TG的生產(chǎn)。和鏈霉菌來源的TG相比，枯草芽孢桿菌來源的TG研究要少得多，1996年才由Kobayashi等首次在枯草芽孢桿菌 中發(fā)現(xiàn)了 TG，其沒有信號(hào)肽和前肽，只存在于芽孢上，交聯(lián)芽孢表面蛋白，防止其被蛋白酶降解，從而起到保護(hù)芽孢的作用。由于TG具有蛋白交聯(lián)的活性，對宿主細(xì)胞具有毒性作用，因此，雖然2007年葡萄牙Placido等實(shí)現(xiàn)BTG在大腸桿菌中表達(dá)，但是在不同的誘導(dǎo)和培養(yǎng)條件下酶得率都非常低。目前，仍難以大量制備枯草芽孢桿菌來源的BTG。通過檢索，尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明專利申請相關(guān)的專利公開文獻(xiàn)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了ー種抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽及其篩選方法和應(yīng)用，該多肽使BTG能夠在宿主細(xì)胞低活性表達(dá)，減輕BTG對宿主細(xì)胞的毒性作用，而經(jīng)過蛋白酶簡單處理后其活性又能得到恢復(fù)，為BTG的高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是氨基酸序列為SEQ ID No:1的多肽在抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性中的應(yīng)用。而且，應(yīng)用的方法步驟如下將所述多肽和凝血因子Xa可識(shí)別酶切位點(diǎn)序列連接，形成polypeptide-1-E-G-R,枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因再定向克隆到polypeptide-1-E-G-R的下游，形成polypeptide-1-E-G-R-BTG片段；該多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，經(jīng)凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢復(fù)枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性。抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽，所述多肽為將SEQ ID No:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽。一種篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，步驟如下(I)選擇來源不同的鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶前肽序列；(2)通過重疊延伸PCR將來源不同的鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶前肽克隆到枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的N端，兩者之間添加凝血因子Xa識(shí)別序列連接；(3)將全部編碼序列克隆入pET_28a(+)的NdeI與HindIII酶切識(shí)別位點(diǎn)之間；(4)在E. Coli BL21 (DE3)菌株中重組表達(dá)，親和層析純化得到HIS融合的編碼序列的融合蛋白；(5)通過熒光法檢測融合蛋白的酶活，篩選對枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽。而且，所述步驟⑴中來源不同的鏈霉菌為S. cinnamoneus、S. caniferus、
b.fraaiae、S. hygroscopicus、b.mobaraense、b.netropsis和 b. platensis。而且，所述步驟(5 )中熒光法檢測的具體步驟如下將純化濃縮后的蛋白液各取500 ii L，平分成兩份，其中的ー份用凝血因子Xa酶切6h，獲得去除了 N端多肽序列的成熟枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，測得各蛋白液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算得出酶活，通過比較未經(jīng)凝血因子Xa酶切的酶活相對于切割后的酶活，得到各多肽序列對枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的抑制率。而且，所述熒光強(qiáng)度的檢測步驟為反應(yīng)體系的總體積ImL :N，N-ニ甲基酪蛋白0.67g/L，丹磺尸胺(MDC) 8. 33 y mo I/L, Tris HClpH7. 550mmol/L, DTT3mmol/L，酶液 200 u L ;反應(yīng)體系于 37°C反應(yīng) 30min，加入IOmmoVL(NH4)2SO4終止反應(yīng)，于激發(fā)波長350nm和發(fā)射波長500nm下檢測熒光強(qiáng)度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽通過融合蛋白的形式抑制BTG的活性，抑制率可達(dá)到60%以上，可使細(xì)胞毒性較強(qiáng)的BTG先以活性受抑制的形式在宿主細(xì)胞中表達(dá)，然后在凝血因子Xa (Factor Xa)的作用下，去除抑制物，又使其活性得到恢復(fù)。2、本發(fā)明多肽由于可特異性抑制BTG的活性，而且可隨時(shí)去除，解除抑制效應(yīng)，可以應(yīng)用于抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性中，以及應(yīng)用于制備枯草芽孢桿菌來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶中。3、本發(fā)明多肽的篩選方法如鏈霉菌來源的TG，在BTG的N端加上一段多肽，先通過多肽來抑制BTG的活性，使其低活性表達(dá)，繼而通過蛋白酶的切割，去除多肽，解除對BTG的抑制，充分發(fā)揮其生物活性，從而減輕其對宿主細(xì)胞的毒性作用，為其能夠?qū)崿F(xiàn)在宿主細(xì)胞中的高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。


圖1為本發(fā)明五種融合蛋白的純化后濃縮圖，泳道1-5依次為his-proCan-1-E-G-R-BTG、 his-proFra-1-E-G-R-BTG、 his-proHyg-1-E-G-R-BTG、his-proNet-1-E-G-R-BTG、his-proPIa-1-E-G-R-BTG ；圖2為本發(fā)明另兩種融合蛋白的純化后濃縮圖，泳道1-2依次為his-proMob-1-E-G-R-BTG、his-proCin-1-E-G-R-BTG ；圖3為本發(fā)明七種融合蛋白對BTG活性的抑制效果圖。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。

鏈霉菌屬來源的TG具有信號(hào)肽和前肽，由于前肽的作用，使得鏈霉菌來源的TG在細(xì)胞內(nèi)沒有活性，無法起到交聯(lián)蛋白的作用，從而不損害細(xì)胞。但是枯草芽孢桿菌來源的BTG沒有信號(hào)肽和前肽，只有具有活性的成熟肽，因此希望通過鏈霉菌屬TG的前肽來抑制BTG的活性。選擇與比較了來源于7種不同的鏈霉菌(S. cinnamoneus、S. caniferus、b. fradiae、S. hygroscopicus、b. mobaraense、b. netropsis、b. platensis) TG 目U月太序列，分別記為 proCin、proCan、proFra、proHyg、proMob、proNet、proPla,與 BTG 結(jié)合及其抑制 BTG的情況。主要通過重疊延伸PCR將來源不同的鏈霉菌TG前肽克隆到BTG的N端，兩者之間添加FactorXa識(shí)別序列(ATCGAGGGAAGG)連接。再將全部編碼序列克隆入pET_28a(+)的NdeI與HindIII酶切識(shí)別位點(diǎn)之間，從而去除pET_28a(+)載體上的17 Tag,防止其對多肽抑制效應(yīng)的干擾。在E. Coli BL21(DE3)菌株中重組表達(dá)，親和層析純化得到HIS融合的編碼 7 種序列的融合蛋白 his-proCin-1-E-G-R-BTG、his-proCan-1-E-G-R-BTG、his-proFra-1-E-G-R-BTG, his-proHyg-1-E-G-R-BTG、 his-proMob-1-E-G-R-BTG、his-proNet-1-E-G-R-BTG、his_proPIa-1-E-G-R-BTG。本發(fā)明通過熒光法檢測酶活，分析篩選得到了抑制作用較強(qiáng)的S. caniferus來源的TG前肽序列(序列表中序列I)。一、抑制BTG活性的多肽的設(shè)計(jì)合成與活性篩選1、多肽編碼序列的設(shè)計(jì)合成首先設(shè)計(jì)出7種不同多肽的編碼序列，分別由Al、A2、A3、A4、A5、A6、A7表示，該序列依次為 7 種 TG 前肢序列(proCin、proCan、proFra、proHyg、proMob、proNet、proPla),Factor Xa特異識(shí)別序列以及BTG的N端31bp序列。由生物公司合成并克隆在pUC57的NdeI與HindIII酶切識(shí)別位點(diǎn)之間，質(zhì)粒保存于E. Coli ToplO中。(基因委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成)；然后利用質(zhì)粒小提試劑盒從E. ColiToplO中提取質(zhì)粒，80 U L體系雙酶切3_4h。按以下次序，將各成分在滅菌薄壁離心管內(nèi)混合，反應(yīng)組分加入量質(zhì)粒50 ii L ;IOXK Buffer8 U L ；
NdeI2u L ；HindIII2u L ；ddH2018u L ；總體積80iiL。最后全部經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收得到上述多肽基因Al、A2、A3、A4、A5、A6、A7，作為重疊PCR的上游基因。2、BTG基因的獲得從本實(shí)驗(yàn)室保存的B. subtilisl68中提取基因組作為模板，PCR獲得BTG基因，作為重疊PCR的下游基因B。
權(quán)利要求
1.氨基酸序列為SEQID No:1的多肽在抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用的方法步驟如下 將所述多肽和凝血因子Xa可識(shí)別酶切位點(diǎn)序列連接，形成polypeptide-1-E-G-R,枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶基因再定向克隆到polyp印tide-1-E-G-R的下游，形成polyp印tide-1-E-G-R-BTG片段；該多肽以融合蛋白的形式抑制BTG的活性，經(jīng)凝血因子Xa酶切后去除此多肽，恢復(fù)枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性。
3.抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽，其特征在干所述多肽為將SEQIDNo:1的氨基酸殘基序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽。
4.一種篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，其特征在于步驟如下 ⑴選擇來源不同的鏈霉菌的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶前肽序列； ⑵通過重疊延伸PCR將來源不同的鏈霉菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶前肽克隆到枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的N端，兩者之間添加凝血因子Xa識(shí)別序列連接； ⑶將全部編碼序列克隆入pET-28a(+)的NdeI與HindIII酶切識(shí)別位點(diǎn)之間； ⑷在E. Coli BL21 (DE3)菌株中重組表達(dá)，親和層析純化得到HIS融合的編碼序列的融合蛋白； (5)通過熒光法檢測融合蛋白的酶活，篩選對枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性抑制率最高的前肽序列，即得抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，其特征在于所述步驟⑴中來源不同的鏈霉菌為S. cinnamoneus、S. caniferus、S. fradiae、b. hygroscopicus、S. mobaraense、S.netropsis 和 S. piatensis。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，其特征在于所述步驟(5)中熒光法檢測的具體步驟如下 將純化濃縮后的蛋白液各取500 u L，平分成兩份，其中的ー份用凝血因子Xa酶切6h，獲得去除了 N端多肽序列的成熟枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，測得各蛋白液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算得出酶活，通過比較未經(jīng)凝血因子Xa酶切的酶活相對于切割后的酶活，得到各多肽序列對枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的抑制率。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述篩選抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性多肽的方法，其特征在于所述熒光強(qiáng)度的檢測步驟為 反應(yīng)體系的總體積1111し隊(duì)}ニ甲基酪蛋白0.67§/1，丹磺尸胺(MDC)8. 33umol/L,Tris HCl pH7. 5 50 mmol/L, DTT 3mmol/L，酶液 200 y L ;反應(yīng)體系于 37°C反應(yīng) 30min，加A IOmmoVL(NH4)2SO4終止反應(yīng)，于激發(fā)波長350nm和發(fā)射波長500nm下檢測熒光強(qiáng)度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種氨基酸序列為SEQ ID No:1的多肽在抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶簡稱BTG)活性中的應(yīng)用。本發(fā)明抑制枯草芽孢桿菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶活性的多肽通過融合蛋白的形式抑制BTG的活性，抑制率可達(dá)到60%以上，可使細(xì)胞毒性較強(qiáng)的BTG先以活性受抑制的形式在宿主細(xì)胞中表達(dá)，然后在凝血因子Xa(Factor Xa)的作用下，去除抑制物，又使其活性得到恢復(fù)。
文檔編號(hào)C12N9/10GK103060283SQ201210585268
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者路福平, 劉逸寒, 藺松, 王春霞, 王建玲 申請人:天津科技大學(xué)