專(zhuān)利名稱(chēng)：制備肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的制造工藝。
背景技術(shù)：
酶制劑是一種生態(tài)型高效催化劑，具有高效、安全、生態(tài)和環(huán)保等特點(diǎn)。近20年來(lái)，各種酶制劑已經(jīng)在食品工業(yè)中得到地廣泛應(yīng)用。特別對(duì)于各種肉類(lèi)加工及農(nóng)產(chǎn)品的深加工。酶制劑對(duì)肉類(lèi)加工應(yīng)用的共同點(diǎn)是專(zhuān)業(yè)性強(qiáng)，可以在溫和條件下進(jìn)行；加工中成本低、能耗較低；改變?nèi)忸?lèi)性質(zhì)、提高肉品質(zhì)量顯著；生產(chǎn)效率高；酶加工的肉品中并無(wú)有害成分的殘留。
微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(Microbial Transglutaminase，MTG，EC2.3.2.13)包括肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(StreptoverticilliumCinnanoneum Transglutaminase)被認(rèn)為20世紀(jì)超級(jí)酶制劑，廣泛用于肉類(lèi)、魚(yú)類(lèi)食品、含小麥、大米與豆類(lèi)食品、人造脂肪。通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的催化作用使蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，從而提高蛋白質(zhì)的水溶性、起泡性、可攪拌性、熱穩(wěn)定性、乳化性等功能特性，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)食品的質(zhì)構(gòu)、外感及風(fēng)味。
目前的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶分離純化方法包括硫酸銨沉淀、離子交換層析、凝膠過(guò)濾等方法，分離步驟多、得率低(約50％)，離子交換層析和凝膠過(guò)濾介質(zhì)需要外國(guó)進(jìn)口且價(jià)格昂貴。本發(fā)明所用的工藝僅一步，并且得率高(80％)。使用的羥基磷灰石分離介質(zhì)為國(guó)內(nèi)產(chǎn)品，價(jià)格便宜。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種工藝簡(jiǎn)單且得率高的肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的制造工藝。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種制造肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的新工藝，本發(fā)明包括以下步驟肉桂鏈輪絲菌發(fā)酵后，使用離心、超濾技術(shù)收集發(fā)酵液上清；利用分離介質(zhì)直接分離發(fā)酵液上清，洗脫液含有的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，所述的分離介質(zhì)為羥基磷灰石。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)分子識(shí)別的原理，應(yīng)用酶與底物特異性結(jié)合，鑒定出肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。在此基礎(chǔ)上，利用一步層析法分離純化出該酶，并且得率高(80％)，使用的羥基磷灰石分離介質(zhì)為國(guó)內(nèi)產(chǎn)品，價(jià)格便宜。
本發(fā)明所用的工藝僅一步，即采用的是一步層析法。所謂層析法有很多種，如陰、陽(yáng)離子交換層析法、凝膠過(guò)濾法等，一般情況下分離純化采用兩種以上方法，而本發(fā)明中則是采用一種方法，即一步層析法。
采用本發(fā)明所提供的方法制備的肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，該酶具有一種催化作用并使蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，酶的分子量為41,000，交聯(lián)反應(yīng)中酶反應(yīng)的最適pH范圍6-9，最適酶反應(yīng)溫度為45℃。
采用本發(fā)明制備的肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析為單一條帶，并具有谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶活性，制造該酶的活性片段，或者利用基因工程方法，制造重組肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，還可以制備其它種類(lèi)天然的或基因工程重組的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，利用該酶還可以生產(chǎn)多克隆或單克隆抗體，包括利用純化的肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶免家兔疫三次，獲得特異性的兔抗肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶抗體，雙擴(kuò)結(jié)果顯示，稀釋度為1∶16，Western Blot方法證明該抗體能識(shí)別肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。利用多克隆或單克隆特異性抗酶抗體去篩選能產(chǎn)生谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶微生物新物種，從而利用這種或多種微生物去生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。
附圖概述

圖1是肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的鑒定圖；圖中1為分子量，2表示分子量為41,000的位置出現(xiàn)一酶底物反應(yīng)帶。
圖2是純化的肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶SDS-PAGE分析圖；圖中1為標(biāo)準(zhǔn)分子量，2、3為10、60ul的純化后樣品。
具體實(shí)施例方式
所述的肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶制造、檢測(cè)和抗體制備的工藝簡(jiǎn)述如下1、十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析分離肉桂鏈輪絲菌的發(fā)酵液所含蛋白，然后電轉(zhuǎn)移到膜上，并放置于磷酸緩沖液4℃過(guò)夜，讓酶復(fù)性。次日在上述緩沖液加入CBZ-Gln-Gly及羥胺作為底物，CBZ-Gln-Gly分解為CBZ和Gln-Gly-羥胺，CBZ是顯色的，可看到顯色帶是分子量為41,000的蛋白質(zhì)(圖1)。因而，分子量為41,000的蛋白質(zhì)為谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。
2、使用離心、超濾技術(shù)收集發(fā)酵液上清，然后，利用羥基磷灰石分離介質(zhì)(Hydroxyapatite，HAP)直接分離發(fā)酵液上清，洗脫液含有谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析為單一條帶。
3、利用純化谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶免家兔疫三次，以獲得特異性的兔抗酶抗體。雙擴(kuò)結(jié)果顯示，稀釋度為1∶16。Western Blot方法證明該抗體能識(shí)別肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例實(shí)施例1肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的鑒定。肉桂鏈輪絲菌購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。超濾肉桂鏈輪絲菌發(fā)酵液離心后的上清液20ml至1ml，取其50ul，加入10μl 6XSDS上樣buffer，100℃煮沸10min，上樣于12％SDS-PAGE。電泳完畢后，取PVDF膜，用甲醇濕潤(rùn)后，把電泳后的SDS-PAGE膠放置在PVDF膜上，放入電轉(zhuǎn)移槽里，PVDF膜位于陽(yáng)極那一面，而SDS-PAGE膠位于陰極那一面，100伏電壓，電轉(zhuǎn)移一小時(shí)完畢。取出PVDF膜并放置于磷酸緩沖液4℃過(guò)夜，讓酶復(fù)性。次日在上述緩沖液加入CBZ-Gln-Gly及羥胺作為底物，CBZ-Gln-Gly分解為CBZ和Gln-Gly-羥胺，CBZ是顯色的，可看到顯色帶是分子量為41,000的蛋白質(zhì)。因而，分子量為41,000的蛋白質(zhì)為谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。
實(shí)施例2肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的分離純化。肉桂鏈輪絲菌在高氏斜面半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)菌落生成后，接種于含1000ml發(fā)酵培養(yǎng)基的三角燒瓶中，培養(yǎng)基的成分為甘油20g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨50g/L，MgSO4.7H2O 2g/L，K2HPO4.3H2O 2g/L，pH7.0(121℃滅菌20min)，30℃，210r/Min，培養(yǎng)5天。收集發(fā)酵液4℃離心15分鐘(6000rpm)，取上清，用超濾器4℃超濾，超濾至200ml，加入10mM，pH7.0磷酸鹽緩沖液200ml，繼續(xù)超濾至200ml。再加入10mM，pH7.0磷酸鹽緩沖液200ml，繼續(xù)超濾至100ml。100ml超濾液上已用10mM，pH7.0磷酸鹽緩沖液平衡的羥基磷灰石分離介質(zhì)柱，先用10mM，pH7.0磷酸鹽平衡緩沖液洗去雜蛋白，然后用300mM，pH7.0的磷酸鹽緩沖液洗出一經(jīng)SDS-PAGE分析分子量為41,000的蛋白質(zhì)，經(jīng)實(shí)施例1的方法分析為谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。
實(shí)施例3肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶多克隆抗體的制備。
選擇優(yōu)質(zhì)的大耳白兔子4-6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)、觀察無(wú)病一個(gè)星期。常規(guī)用卡介苗進(jìn)行基礎(chǔ)免疫兔子。一定量的抗原(肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶)SDS-PAGE，用考馬斯亮藍(lán)染色(或250MmKCl染色)，將目的帶切下，用液氮在研缽中將膠磨碎，將膠與佐劑(1∶1)混合，繼續(xù)研磨成糊狀，免疫家兔。時(shí)間為基礎(chǔ)免疫一星期后，1-2mg抗原/只。制備的膠為1mg抗原/1g膠。
1、兩周(或三周)后加強(qiáng)免疫1～2mg抗原/只。
2、一周后加強(qiáng)免疫1～2mg抗原/只?？捎秒p擴(kuò)法檢測(cè)有無(wú)抗體產(chǎn)生。
3、一周后進(jìn)行第三次加強(qiáng)免疫1～2mg抗原/只。
1～2周后，取家兔耳緣靜脈血，用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測(cè)抗肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶抗體。用ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。血清中目的抗體為陽(yáng)性后，大量抽取兔血，收集的血液37℃放置1～2小時(shí)，4℃過(guò)夜，再無(wú)菌的條件下，離心收集血清，分裝(0.2ml)，儲(chǔ)存于-70℃。
權(quán)利要求
1.一種制備肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的新工藝，本發(fā)明包括以下步驟肉桂鏈輪絲菌發(fā)酵后，使用離心、超濾技術(shù)收集發(fā)酵液上清；利用分離介質(zhì)直接分離發(fā)酵液上清，洗脫液含有谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的新工藝，其特征在于所述的分離介質(zhì)為羥基磷灰石。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單并有效的分離純化肉桂鏈輪絲菌谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的新工藝。本發(fā)明的核心在于通過(guò)羥基磷灰石分離介質(zhì)一步層析法分離純化經(jīng)離心、超濾后肉桂鏈輪絲菌發(fā)酵液上清，獲得具有谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶活性、分子量為41,000，在電泳上為單一條帶的蛋白，為該酶的廣泛應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K1/00GK1621521SQ20031010644
公開(kāi)日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2003年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月27日
發(fā)明者徐斌 申請(qǐng)人:合肥永通塑料有限公司