專利名稱：從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及巴夫藻和二十碳五烯酸，具體地說，是涉及從巴夫藻制備二十碳五烯酸甲酯的方法。
背景技術：
綠色巴夫藻(Pavlova viridis)是一種黃綠色的微小金藻。藻體呈橢圓形或圓形，無細胞壁。該藻細胞直徑約4-6μm，能運動，是一種適溫范圍廣，光照要求低的單細胞海洋微藻。常作為蝦類幼體和經濟貝類的良好餌料。近年來的研究表明綠色巴夫藻富含二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，下稱EPA)等多不飽和脂肪酸，其EPA含量占總脂的12-15％(依培養(yǎng)條件不同而變化)。
EPA等多不飽和脂肪酸存在于藻類細胞糖脂中，要得到二十碳五烯酸甲酯一般首先需從巴夫藻提取總酯，皂化使之成游離酸，然后進行甲酯化，最后分離、純化得到二十碳五烯酸甲酯。分離、純化主要有低溫冷凍法，尿素包合法，分子蒸餾法，超臨界CO2萃取法等。但這些方法或者EPA的得率及純度較低，或者成本過高。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種步驟簡單、成本低、純度高、得率高的從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯的方法。
本發(fā)明的技術方案如下一種從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯的方法，它包括下列步驟步驟1.將綠色巴夫藻凍干藻粉N克，裝入容器中，加入20N～30N毫升5％氯乙酰-甲醇(即1∶20 v/v)，充氮氣后密閉，于80-100℃下反應0.5～2小時，冷卻至室溫，步驟2.在步驟1所得的反應混合物中分別加入同等體積的重蒸餾水和正己烷，振蕩萃取，吸取上層液體后，再加入等量的正己烷重復萃取，至上清液不再發(fā)黃，步驟3.合并萃取液后，用干燥劑干燥，濾去干燥劑，在氮氣保護下蒸去正己烷，得到脂肪酸甲酯0.046N～0.07N克，步驟4.將步驟3得到的脂肪酸甲酯用涂銀硅膠柱進行層析，用丙酮-正己烷溶液梯度洗脫，分別收集洗脫液，合并含二十碳五烯酸甲酯純度高于95％的洗脫液，步驟5.在氮氣保護下，蒸去丙酮和正己烷，即得二十碳五烯酸甲酯0.004N克～0.009N克，純度高于95％。
上述的制備和純化方法的步驟4中，丙酮-正己烷溶液梯度洗脫可以分別用丙酮體積百分濃度為0.5％、1％、5％、10％和15％的丙酮-正己烷溶液依次洗脫。
上述的制備和純化方法的步驟4中，涂銀硅膠柱的涂銀硅膠可以如下制備將一定量層析用硅膠加至兩倍體積無水乙醇中，攪拌混合成懸浮液。將硝酸銀溶解于適量70％乙醇中，加入上述層析硅膠充分混合均勻。硝酸銀與硅膠的重量比為1∶10。然后蒸去乙醇，將所得的涂銀硅膠置于烘箱中，于120℃高溫活化(12小時以上)，冷卻后，于暗處保存。
本發(fā)明的從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯的方法步驟簡單，消耗少，成本低，得率高，得率可達理論值的65～72％，純度高，純度可達95％以上。


圖1為實施例2中涂銀硅膠柱層析—梯度濃度洗脫液，15％丙酮-正己烷第一管洗脫液的氣相色譜圖，其中個峰的保留時間和峰面積如下Peak RetTime Type Width Area Height Area# [min] [min] [pA*s][pA] ％----|-------|----|-------|----------|----------|--------|1 14.148 PB 0.06814.08046 7.91750e-1 0.421132 15.930 PP 0.06677.70089 1.642210.794783 18.151 PB 0.0636923.32898 187.03178 95.293514 18.589 PB 0.06243.55124 6.86098e-1 0.366515 19.541 BB 0.071810.97733 1.887971.132936 21.027 BB 0.071314.81180 2.865131.528677 21.685 PV 0.06402.02365 3.86956e-1 0.208858 22.399 PV 0.07022.45727 4.26771e-1 0.25361Totals968.93161 195.71867圖2為實施例2中涂銀硅膠柱層析—梯度濃度洗脫液，15％丙酮-正己烷第二管洗脫液的氣相色譜圖，其中個峰的保留時間和峰面積如下Peak RetTime Type WidthArea Height Area# [min][min][pA*s][pA]％----|-------|----|-------|----------|----------|--------|1 14.155 PB 0.0659 2.07125 3.90620e-1 0.387162 15.945 BB 0.0682 4.44554 9.56831e-1 0.830973 18.143 PB 0.0714 517.56049 105.23692 96.743044 19.557 BP 0.0857 6.76244 1.014911.264045 21.044 PB 0.0622 1.90134 3.80979e-1 0.355406 22.405 BB 0.0742 2.24367 3.67851e-1 0.41939Totals 534.98472 108.34811Results obtained with enhanced integrator！
圖3為實施例2中涂銀硅膠柱層析—梯度濃度洗脫液，15％丙酮-正己烷第三管洗脫液的氣相色譜圖，其中個峰的保留時間和峰面積如下Peak RetTime Type WidthArea Height Area# [min][min][pA*s][pA] ％----|-------|----|-------|----------|----------|--------|1 15.952 BP0.0648 2.475345.27118e-1 0.865942 18.134 BB0.0774 278.85254 55.68338 97.549863 19.563 BB0.0858 4.528536.54070e-1 1.58420Totals285.85641 56.86457Results obtained with enhanced integrator！圖4為實施例2中涂銀硅膠柱層析—梯度濃度洗脫液，15％丙酮-正己烷第四和第五管洗脫液的氣相色譜圖，其中個峰的保留時間和峰面積如下Peak RetTime Type WidthArea Height Area# [min][min][pA*s][pA]％----|-------|----|-------|----------|----------|--------|1 18.129 PB0.0772 136.59071 27.39506 97.741142 19.570 BP0.1351 3.156702.83150e-1 2.25886Totals 139.74741 27.67821Results obtained with enhanced integrator！具體實施方式
實施例1.藻類培養(yǎng)與收獲單細胞海洋微藻綠色巴夫藻購自青島中科院海洋研究所，經本實驗室復壯培養(yǎng)，保存于21-27℃。培養(yǎng)條件如下6000-9000lux，1212L/D，通氣培養(yǎng)。指數生長末期收獲，4000-8000g離心8-15分鐘收集藻體，蒸餾水洗滌以除去鹽類及其他雜質，冷凍干燥，低溫冷凍保存。
實施例2.涂銀硅膠柱的制備將一定量層析用硅膠加至兩倍體積無水乙醇中，攪拌混合成懸浮液。將硝酸銀溶解于適量70％乙醇中，加入上述層析硅膠充分混合均勻。硝酸銀與硅膠的重量比為1∶10。然后蒸去乙醇，將所得的涂銀硅膠置于烘箱中，于120℃高溫活化(12h以上)，冷卻后，于暗處保存。
實施例3.從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯，它包括下列步驟步驟1.將綠色巴夫藻凍干藻粉1.0克，裝入螺口試管中，加入20毫升5％氯乙酰—甲醇(即1∶20v/v)，充氮氣后密閉，于80℃下反應2小時，冷卻至室溫，步驟2.在步驟1所得的反應混合物中分別加入同等體積的重蒸餾水和正己烷，振蕩萃取，吸取上層液體后，再加入等量的正己烷重復萃取，至上清液不再發(fā)黃，步驟3.合并萃取液后，用干燥劑干燥，濾去干燥劑，在氮氣保護下蒸去正己烷，得到脂肪酸甲酯0.046克，步驟4.將步驟3得到的脂肪酸甲酯用涂銀硅膠柱進行層析，分別用丙酮濃度為0.5％，1％，5％，10％，15％(v/v)的丙酮-正己烷溶液各25ml按濃度由低到高依次洗脫，流速控制在1.3～2.0ml/min，每5ml收集一管，分別收集各個不同濃度梯度的流出液做GC分析。發(fā)現當丙酮-正己烷洗脫液的丙酮濃度低于10％時，可將一些飽和和不飽和度低的脂肪酸甲酯及其他雜質基本完全洗脫下來，在10％丙酮-正己烷的最后一管時EPA開始洗脫出來，當洗脫液丙酮濃度達到15％(v/v)時，依次得到純度為95.29％，96.74％、97.55％、97.74％(合并的第4和第5管洗脫液)的EPA甲酯(見氣相色譜圖，圖1-4)。合并15％丙酮-正己烷的洗脫液，可得到純度大于95％的EPA甲酯，得率約為60％。
步驟5.在氮氣保護下，蒸去丙酮和正己烷，即得二十碳五烯酸甲酯0.004克，純度高于95％。
實施例4.從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯，它包括下列步驟步驟1.將綠色巴夫藻凍干藻粉1.0克，裝入螺口試管中，加入30毫升5％氯乙?！状?即1∶20v/v)，充氮氣后密閉，于100℃下反應0.5小時，冷卻至室溫，步驟2.在步驟1所得的反應混合物中分別加入同等體積的重蒸餾水和正己烷，振蕩萃取，吸取上層液體后，再加入等量的正己烷重復萃取，至上清液不再發(fā)黃，步驟3.合并萃取液后，用干燥劑干燥，濾去干燥劑，在氮氣保護下蒸去正己烷，得到脂肪酸甲酯0.07克，步驟4.將步驟3得到的脂肪酸甲酯用涂銀硅膠柱進行層析，同實施例用丙酮-正己烷溶液梯度洗脫，分別收集洗脫液，合并含二十碳五烯酸甲酯純度高于95％的洗脫液，步驟5.在氮氣保護下，蒸去丙酮和正己烷，即得二十碳五烯酸甲酯0.009克，純度高于95％。
權利要求
1.一種從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯的方法，其特征是它包括下列步驟步驟1.將綠色巴夫藻凍干藻粉N克，裝入容器中，加入20N～30N毫升體積百分比濃度為5％的氯乙酰-甲醇，充氮氣后密閉，于80-100℃下反應0.5～2小時，冷卻至室溫，步驟2.在步驟1所得的反應混合物中分別加入同等體積的重蒸餾水和正己烷，振蕩萃取，吸取上層液體后，再加入等量的正己烷重復萃取，至上清液不再發(fā)黃，步驟3.合并萃取液后，用干燥劑干燥，濾去干燥劑，在氮氣保護下蒸去正己烷，得到脂肪酸甲酯，步驟4.將步驟3得到的脂肪酸甲酯用涂銀硅膠柱進行層析，用丙酮-正己烷溶液梯度洗脫，分別收集洗脫液，合并含二十碳五烯酸甲酯純度高于95％的洗脫液，步驟5.在氮氣保護下，蒸去丙酮和正己烷，即得二十碳五烯酸甲酯，純度高于95％。
2.根據權利要求1所述的制備和純化方法，其特征是在步驟4中，丙酮-正己烷溶液梯度洗脫可以分別用丙酮體積百分濃度為0.5％、1％、5％、10％和15％的丙酮-正己烷溶液依次洗脫。
全文摘要
一種從綠色巴夫藻制備和純化二十碳五烯酸甲酯的方法，它是將綠色巴夫藻凍干藻粉加入濃度為5％的氯乙酰－甲醇，充氮氣后密閉，于80－100℃下反應0.5～2小時，冷卻至室溫，分別加入同等體積的重蒸餾水和正己烷，振蕩萃取，萃取數次，合并萃取液后，在氮氣保護下蒸去正己烷，得到脂肪酸甲酯，然后用涂銀硅膠柱進行層析，用丙酮－正己烷溶液梯度洗脫，合并含二十碳五烯酸甲酯純度高于95％的洗脫液，在氮氣保護下，蒸去丙酮和正己烷，即得二十碳五烯酸甲酯，純度高于95％。本發(fā)明的方法簡單易行，成本低，二十碳五烯酸甲酯的純度高
文檔編號C07C67/58GK1544413SQ200310106399
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月24日 優(yōu)先權日2003年11月24日
發(fā)明者劉志禮, 李梅, 曹德華, 徐瑾, 薛仁皓 申請人:南京大學