基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法
【專利摘要】一種基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到谷氨酰胺合成酶編碼基因；然后將該基因插入大腸桿菌表達(dá)載體pET‐22b(+)中得到含有谷氨酰胺合成酶編碼基因的重組表達(dá)載體；再將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株，篩選得到谷氨酰胺合成酶的工程菌。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的由于谷氨酰胺合成酶在生物體內(nèi)多為胞內(nèi)酶且表達(dá)量較低導(dǎo)致的應(yīng)用范圍和效果嚴(yán)重受限等不足，應(yīng)用基因工程手段實(shí)現(xiàn)其體外的大量表達(dá)合成。
【專利說(shuō)明】基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及的是一種生物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實(shí)現(xiàn)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一。目前，維持或提高作物產(chǎn)量的 主要方法是大量施肥，然而氮肥的大量施用，不僅增加了農(nóng)民的生產(chǎn)成本，而且會(huì)加劇水體 的富營(yíng)養(yǎng)化及溫室氣體的排放。
[0003] 對(duì)作物而言，能夠吸收同化N〇r、NH4+及氨態(tài)N等不同氮素形態(tài)，但是一般以 Ν0Γ為主要氮源。植物以Ν0Γ為氮源時(shí)，氮同化可以分為3個(gè)階段：（1)氮的無(wú)機(jī)同化 (Ν0Γ - N02 - NH4+) ; (2)氨的同化，即NH4+經(jīng)過(guò)谷氨酰胺合成酶（GS)合成谷氨酰胺，再由谷 氨酰胺經(jīng)谷氨酸合酶（G0GAT)合成谷氨酸；（3)氨的有機(jī)同化，即由谷氨酰胺和谷氨酸合成 其它氨基酸，進(jìn)而合成蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)。由此可見，谷氨酰胺合成酶在氮同化通路中起著 十分關(guān)鍵的作用。
[0004] 生物體對(duì)氮元素的同化是十分重要的生理過(guò)程，無(wú)機(jī)氮必須同化為谷氨酰胺形式 的有機(jī)氮才能被生物體吸收利用。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS)是氮同化 途徑的關(guān)鍵酶，它與谷氨酸合成酶共同作用，催化NH4+同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺又在谷氨 酸合酶的催化下，將其酰胺轉(zhuǎn)移到α -酮戊二酸上，從而生成兩分子谷氨酸。谷氨酰胺在生 物體含氮有機(jī)物的生物合成中作為氮供體，而外界無(wú)機(jī)氮也必須通過(guò)這個(gè)途徑才能進(jìn)入生 物體內(nèi)的氮循環(huán)。因此谷氨酰胺合成酶在生物體氮同化過(guò)程中起到十分重要的作用。
[0005] 土壤中含有十分豐富的細(xì)菌群體。細(xì)菌谷氨酰胺合成酶涵蓋目前發(fā)現(xiàn)的三大類谷 氨酰胺合成酶GS I、GS II和GS III，且相比植物谷氨酰胺合成酶基因具有種類多、易克隆等 優(yōu)勢(shì)。灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)是一種常見的土壤細(xì)菌，其谷氨酰胺 合成酶基因的克隆及功能鑒定對(duì)于鑒定氮高效基因并應(yīng)用于逆境條件下土壤理化性質(zhì)的 改善具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出一種基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實(shí) 現(xiàn)方法，通過(guò)本發(fā)明所述的方法能夠高效表達(dá)一種克隆自灰略紅鏈霉菌谷氨酰胺合成酶， 可以克服谷氨酰胺合成酶在原始菌株內(nèi)表達(dá)量較低等缺點(diǎn)，有助于解決肥料利用率較低等 問題，此外對(duì)于實(shí)現(xiàn)土壤中銨鹽的快速轉(zhuǎn)化進(jìn)而培肥土壤，最終實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)具有重大意 義。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明涉及一種谷氨酰胺合成酶的工程菌，該工程菌為外源表達(dá)谷氨酰胺合成酶 的大腸桿菌。
[0009] 所述的胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1谷氨酰胺合成酶大亞基基因 SG - GE，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列為1377bp，編碼453個(gè)氨基酸。
[0010] 所述的谷氨酰胺合成酶編碼基因通過(guò)全基因組測(cè)序和PCR擴(kuò)增的方式克隆獲得。
[0011] 所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國(guó)普通 微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所郵編100101。
[0012] 本發(fā)明涉及上述工程菌的實(shí)現(xiàn)方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到谷氨酰胺合成酶編碼基因；然后將該基因插入大腸桿菌 表達(dá)載體PET - 22b (+)中得到含有谷氨酰胺合成酶編碼基因的重組表達(dá)載體；再將重組表 達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株，篩選得到谷氨酰胺合成酶的工程菌。
[0013] 所述的含有酶切位點(diǎn)的引物包括：
[0014] GE - Msc I - F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC
[0015] GE _ EcoR I _ R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC
[0016] 所述的PCR擴(kuò)增的條件為：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延 伸2min ;30個(gè)循環(huán)后68°C終延伸5min。
[0017] 所述的大腸桿菌表達(dá)菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0018] 本發(fā)明涉及一種谷氨酰胺合成酶的工程菌的應(yīng)用，將其應(yīng)用于谷氨酰胺合成酶的 體外高效表達(dá)，并最終實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。 技術(shù)效果
[0019] 現(xiàn)有谷氨酰胺合成酶在灰略紅鏈霉菌內(nèi)為胞內(nèi)酶且表達(dá)量很低，因此嚴(yán)重限制了 其使用范圍和效果；與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種全新的谷氨酰胺合成酶基因序列； 在特殊條件下（如高溫以及堿性）具有更穩(wěn)定的生物學(xué)活性；本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建外源表達(dá)載 體，實(shí)現(xiàn)了谷氨酰胺合成酶的體外過(guò)表達(dá)，并通過(guò)在表達(dá)重組蛋白C端添加聚組氨酸標(biāo)簽 的方法，維持蛋白活性的同時(shí)也最大程度的保證了蛋白純度。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為基于KEGG的灰略紅鏈霉菌硝酸鹽代謝通路預(yù)測(cè)圖；
[0021] 圖2為不同濃度硝酸鹽培養(yǎng)下谷氨酰胺酶合成酶表達(dá)量變化圖；
[0022] 圖3為灰略紅鏈霉菌谷氨酰胺合成酶信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖；
[0023] 圖4為灰略紅鏈霉菌谷氨酰胺合成酶氨基酸序列對(duì)比圖；
[0024] 圖5為灰略紅鏈霉菌谷氨酰胺合成酶3D結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。 實(shí)施例1
[0026] 本實(shí)施例包括以下步驟：
[0027] 1)灰略紅鏈霉菌的分離及培養(yǎng)
[0028] 灰略紅鏈霉菌分離自上海市浦江鎮(zhèn)收集的腐爛秸桿，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5706。 將該菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，32 °C培養(yǎng)48h。
[0029] 上述LB液體培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCllO. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養(yǎng)基中加入15. 0 - 20. 0g/L瓊脂即得LB固體培養(yǎng)基。
[0030] 2)基因組DNA提取
[0031] 收集2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180 μ L溶菌酶 (20mg/mL)和20μLEDTA溶液（0·5M，pH8·0)，37°C處理45min，加入4μLRNaseA(100mg/ mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細(xì)菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作說(shuō)明完成 剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過(guò)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質(zhì)量，確保 無(wú)明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無(wú)降解、無(wú)污染。
[0032] 3)基因組測(cè)序
[0033] 確定全基因組鳥槍法（WGS)策略，采用第二代測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建不同插入片段長(zhǎng)度 的文庫(kù)，采用Illumina Miseq(2X250bp)平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。收集測(cè)序的原始數(shù)據(jù)，對(duì)帶接頭、 低質(zhì)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，隨后采用Newbler v2. 8對(duì)去除接頭的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼接，構(gòu) 建contig及scaffold,最后使用GapCloser程序進(jìn)行缺口填補(bǔ)得到鏈霉菌基因組草圖。
[0034] 4)蛋白編碼基因功能預(yù)測(cè)
[0035] 采用Glimmerf. 0軟件對(duì)全基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)?；蝾A(yù)測(cè)模型選取自我訓(xùn) 練基因預(yù)測(cè)模型，即提取拼裝序列中最長(zhǎng)的序列，以該序列作為基因預(yù)測(cè)模型訓(xùn)練的序列。 然后以該序列構(gòu)建的基因預(yù)測(cè)模型，對(duì)所有序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，設(shè)定開放閱讀框的長(zhǎng)度為 ll〇bp，其余參數(shù)為Glimmer3. 0的默認(rèn)設(shè)置。
[0036] 基于 KEGG 的硝酸鹽代謝通路圖：KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)，是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫(kù)。KEGG注釋的主要目的包括兩個(gè)：K0(KEGG Ortholog)注釋，即將分子網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)信息進(jìn)行跨物種注釋；KEGG Pathway注釋，即代謝通 路注釋，獲得物種內(nèi)分子間相互作用和反應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)。
[0037] 蛋白編碼基因的K0及Pathway注釋主要采用KEGG的KAAS自動(dòng)化注釋系統(tǒng)完 成，其中基因集選擇"For Prokaryote"，基因 K0的傳遞規(guī)則選取bi - directional best hit (BBH)。K0注釋完成后，將K0映射到相應(yīng)的KEGG Pathway通路上，得到灰略紅鏈霉菌內(nèi) 硝酸鹽代謝通路（圖1)。
[0038] 5)總RNA的提取
[0039] 將鏈霉菌接種于以KN03S唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，32°C、150rpm條件下培養(yǎng) 72h。每ia取樣，離心收集菌體沉淀，并按細(xì)菌總RNA提取試劑盒要求（TIANGEN)提取高 純度的鏈霉菌總RNA。
[0040] 上述無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基組分為：葡萄糖 20g/L，ΚΗ2Ρ041· 0g/L，NaClO. 5g/L，MgS040. 25g/ L，CaCl2 · 2H200. lg/L，F(xiàn)eS04 · 7H200. Olg/L 及 KN03(10mM, 30mM, 50mM，lOOmM)。
[0041] 6)谷氨酰胺合成酶表達(dá)水平測(cè)定
[0042] 根據(jù)谷氨酰胺合成酶基因序列，通過(guò)DNAMAN6.0軟件設(shè)計(jì)特異性PCR引物，引物序 列如下：
[0043] GE - F:GCTGAGCCTGATGGAACGCA
[0044] GE - R:GCCTCCCACTCCTGCTTCT
[0045] 同樣的，根據(jù)16S rRNA的特異性序列設(shè)計(jì)引物，并作為內(nèi)參基因，引物序列如下：
[0046] 16S rRNA - F:CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0047] 16S rRNA - R:GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0048] 以鏈霉菌總RNA模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA文庫(kù)，并按照熒光定量PCR試劑盒 (TaKaRa)要求進(jìn)行相關(guān)操作。設(shè)置三個(gè)重復(fù)，待實(shí)驗(yàn)完成收集處理數(shù)據(jù)，分析在不同濃度 ΚΝ03作用下，谷氨酰胺合成酶的表達(dá)量（如圖2)。結(jié)果表明，在以硝酸鹽為唯一碳源的培 養(yǎng)基中，谷氨酰胺合成酶的表達(dá)量顯著上調(diào)，證明該基因參與硝酸鹽的代謝過(guò)程。
[0049] 上述熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性30s ;95°C變性10s，60°C退火30s， 72°C延伸15s，共40個(gè)循環(huán)。
[0050] 7)序列檢測(cè)：
[0051] 谷氨酰胺合成酶膜定位預(yù)測(cè)：采用SignalP4. 1分別對(duì)谷氨酰胺合成酶進(jìn)行信號(hào) 肽模擬預(yù)測(cè)，如圖3所示。結(jié)果表明谷氨酰胺合成酶不存在明顯的信號(hào)肽序列，推測(cè)該酶為 胞內(nèi)酶。
[0052] 谷氨酰胺合成酶氨基酸序列對(duì)比圖：在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastp搜索，獲取3條 與灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l谷氨酰胺酶合成酶序列最為接近的 氨基酸序列，并通過(guò)ClustalX和BOXshade程序進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果如圖4所示。該谷氨酰 胺酶合成酶序列與已知的谷氨酰胺合成酶氨基酸序列具有較高的相似度，相似度最大可達(dá) 98%。
[0053] 硝酸鹽還原酶3D模型預(yù)測(cè)：運(yùn)用PHYRE2在線程序?qū)劝滨０访负铣擅傅?D空間 模型進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明谷氨酰胺酶合成酶與PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中已有蛋白模型的最高相似度分 別可達(dá)35%，預(yù)測(cè)結(jié)果具有100%可信度。如圖5所示，谷氨酰胺合成酶的C端（已注明） 裸露在蛋白表達(dá)，因此將其設(shè)定為聚組氨酸標(biāo)簽（His6 · Taq)的連接位點(diǎn)。 實(shí)施例2
[0054] 谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體構(gòu)建
[0055] 1)根據(jù)谷氨酰胺合成酶序列，設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物，序列如下：
[0056] GE - Msc I - F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC
[0057] GE - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC
[0058] 2)以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有Msc I和EcoR I酶切位點(diǎn)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得谷氨酰胺合成酶基因序列，使用DNA A -Tailing Kit加 A后連接到T - Vector PMD?19 - T (TaKaRa)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌內(nèi)。 在氨芐（50 μ g/mL)抗性平板上挑選陽(yáng)性克隆，搖菌提取質(zhì)粒測(cè)序。若無(wú)誤，Msc I和EcoR I進(jìn)行雙酶切（37°C )，回收谷氨酰胺合成酶大亞基DNA片段GE。用相同內(nèi)切酶酶切表達(dá)載 體pET - 22b (+)并回收載體DNA片段。將GE與載體片段混合，T4 DNA Ligase (TaKaRa)過(guò) 夜連接（16°C)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)抗性平板及菌落PCR 篩選含有質(zhì)粒PET -22 -GE的陽(yáng)性克隆。挑取陽(yáng)性克隆接種于含有氨芐青霉素（50 μ g/mL) 的LB液體培養(yǎng)基中，180rpm、37°C培養(yǎng)16小時(shí)后提取質(zhì)粒。
[0059] 上述PCR擴(kuò)增條件為：98°C預(yù)變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸lmin ;30個(gè)循環(huán) 后68°C終延伸5min。
[0060] 上述 PCR 反應(yīng)使用的 DNA 聚合酶均為 PrimeSTAR? GXL Polymerase (TaKaRa)。
[0061] 3)谷氨酰胺合成酶過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因菌株的構(gòu)建：將上述谷氨酰胺合成酶表達(dá)載體 pET - 22 - GE轉(zhuǎn)入Transetta (DE3)大腸桿菌，并在含有氨芐青霉素（50 μ g/mL)和氯霉素 (34 μ g/mL)的LB固體培養(yǎng)基上篩選，獲得谷氨酰胺合成酶過(guò)表達(dá)菌株。
[0062] 上述的Transetta (DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對(duì)應(yīng)的tRNA，可有效提高外源基因， 尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。
【權(quán)利要求】
1. 一種谷氨酰胺合成酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達(dá)谷氨酰胺合成酶 的大腸桿菌； 所述的胞內(nèi)谷氨酰胺合成酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1谷氨酰胺合成酶大亞基基因 SG - GE，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列為1377bp，編碼453個(gè)氨基酸。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現(xiàn)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號(hào)為 CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的工程菌的實(shí)現(xiàn)方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉 菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到谷氨酰胺合成酶編碼基因； 然后將該基因插入大腸桿菌表達(dá)載體PET -22b (+)中得到含有谷氨酰胺合成酶編碼基因的 重組表達(dá)載體；再將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)菌株，篩選得到谷氨酰胺合成酶的工 程菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點(diǎn)的引物包括： GE - Msc I - F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC GE - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴(kuò)增的條件為：98°C預(yù)變性 3min ;98°C變性 10s，55°C退火 15s，68°C延伸 2min ;30 個(gè)循環(huán)后 68°C終延伸 5min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達(dá)菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種含有上述任一權(quán)利要求所述的谷氨酰胺合成酶的工程菌及其應(yīng)用，其特征在 于，將其用于谷氨酰胺合成酶的體外高效表達(dá)，并最終實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK104140945SQ201410374683
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】周培, 馮?，|, 孫玉靜, 毛亮, 支月娥, 唐冬, 衛(wèi)星, 羅艷青 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)