專利名稱：一種采用混合培養(yǎng)微生物利用甘油發(fā)酵生產乙醇的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術領域，具體涉及ー種采用混合培養(yǎng)微生物利用甘油發(fā)酵生產こ醇的方法。
背景技術：
目前石化能源日益枯竭，人們致カ于開發(fā)各種新能源，其中生物能源備受人們青睞，其中，こ醇和生物柴油是其中兩種較為突出的生物能源。こ醇的發(fā)酵生產一般是利用淀粉質原料，需消耗大量的谷物，與民爭食；此外，こ醇發(fā)酵還可以以農作物秸桿為原料，雖然原料很充足，但是纖維素酶水解效率低，導致生產成本過高。生物柴油是目前備受重視的可再生生物能源產品，主要是通過酯交換法進行生產，生產過程中有大量粗甘油廢液產生，如何利用這些甘油廢液，是這ー產業(yè)面臨的新問題。由甘油代謝途徑可知，甘油可轉化為1，3-丙ニ醇、丁醇、こ醇、有機酸等。目前國內外有大量研究利用甘油為原料發(fā)酵生產1，3-丙ニ醇、丁醇、こ醇等，利用甘油發(fā)酵生產こ醇，已有的研究多為連續(xù)發(fā)酵，こ醇產量較低。以甘油為原料進行發(fā)酵，甘油雖可作為培養(yǎng)基中的碳源，但高濃度的甘油對微生物的生長十分不利，要提高こ醇的產量，這個問題必須解決。本專利以浸麻芽孢桿菌和紅曲菌為出發(fā)菌株，以甘油為原始材料，對影響こ醇產量的甘油初始濃度、補料中甘油濃度、補料時間間隔、發(fā)酵時間、裝液量進行了研究。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種采用浸麻芽孢桿菌和紅曲菌利用甘油混合發(fā)酵生產こ醇的方法，本專利以浸麻芽孢桿菌和紅曲菌為出發(fā)菌株，以甘油為原始材料，對影響こ醇產量的甘油初始濃度、補料中甘油濃度、補料時間間隔、發(fā)酵時間、裝液量進行了研究。I. 一種采用混合培養(yǎng)微生物利用甘油發(fā)酵生產こ醇的方法，其特征在于往I L三角瓶中裝入一定量的發(fā)酵培養(yǎng)基，將紅曲種子液接入培養(yǎng)基中，接種量5%，320C、180 rpm/min震蕩培養(yǎng)48 h ;按10%接種量將浸麻芽孢桿菌接入紅曲發(fā)酵液中，41 °C靜止培養(yǎng)；每隔一定時間補入100 mL含有一定濃度的甘油的新鮮紅曲發(fā)酵液,發(fā)酵一定時間。2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):—定量的甘油，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸鎂I. 5，磷酸氫ニ鉀5，磷酸ニ氫鉀5，硫酸銨1，pH4. 5。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于最佳甘油初始濃度為20 g/L。4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于最佳裝液量500 mL/Ι L三角瓶。5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于紅曲種子液的制作方法為用無菌水從活化好的斜面上刮洗制成孢子菌懸液，按5%接種量接入紅曲種子培養(yǎng)基中，32°C、180rpm/min震蕩培養(yǎng)48 h。6.根據權利要求5中所述的方法，其特征在干，紅曲種子培養(yǎng)基(g/L):甘油50，蛋白胨5，酵母粉5，氯化鈉2. 5，硫酸鎂I. 5，磷酸氫ニ鉀5，磷酸ニ氫鉀2，硫酸鋅2，pH4. 5。7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于浸麻芽孢桿菌種子液的制作方法為用無菌水從活化好的斜面上刮洗制成孢子菌懸液，按10%接種量接入浸麻芽孢桿菌種子培養(yǎng)基中，41 °C靜置培養(yǎng)36 ho8.根據權利要求7所述的方法，其特征在干，浸麻芽孢桿菌種子培養(yǎng)基(g/L):甘油8，葡萄糖12，蛋白胨5，酵母粉5，pH9. O。9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于最佳補料時間間隔為60 h。10.根據權利要求I所述的方法，補料中甘油最佳濃度為20 g/L。11.根據權利要求I所述的方法，最佳發(fā)酵時長為360 h。


圖I甘油初始濃度對こ醇產量的影響。
圖2補料中甘油濃度對こ醇產量的影響。圖3補料時間間隔對こ醇產量的影響。圖4不同裝液量對こ醇產量的影響。圖5發(fā)酵時間對こ醇產量的影響。
具體實施例方式下面的實施例對本發(fā)明作詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。實施例I
本實施案例說明不同甘油初始濃度對こ醇產量的影響，在I L三角瓶中裝入400 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為蛋白胨2，酵母粉2，硫酸鎂I. 5，磷酸氫ニ鉀5，磷酸ニ氫鉀5，硫酸銨1，PH4. 5，甘油濃度分別為20 g/L,40 g/L、60 g/L、80 g/L。將制作好的紅曲種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，32°C、180 rpm/min震蕩培養(yǎng)48 h ;按10%接種量將制作好的浸麻芽孢桿菌接入紅曲發(fā)酵液中，41 °C靜止培養(yǎng)；每隔60 h補入100 mL含有20 g/L甘油的新鮮紅曲發(fā)酵液，發(fā)酵300 h。發(fā)酵結束后，利用氣象色譜檢測發(fā)酵液中的こ醇濃度。得到結果如圖I所示。有圖I可以看出，不同的甘油濃度導致發(fā)酵過程中こ醇的產量有較大差異，發(fā)酵液中甘油的初始濃度越大，こ醇的產量越低，當甘油濃度為20 g/L吋，こ醇產量最大，最大值為11. 5 g/L，故確定最佳甘油初始濃度為20 g/L。實施例2
本實施案例說明補料中不同甘油濃度對こ醇產量的影響，在I L三角瓶中裝入400 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為甘油20，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸鎂I. 5，磷酸氫ニ鉀5，磷酸ニ氫鉀5，硫酸銨1，ρΗ4. 5。將制作好的紅曲種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，32°C、180 rpm/min震蕩培養(yǎng)48 h ;按10%接種量將制作好的浸麻芽孢桿菌接入紅曲發(fā)酵液中，41 °C靜止培養(yǎng)；每隔60 h補入100 mL含有20 g/L,40 g/L、60 g/L、80 g/L甘油的新鮮紅曲發(fā)酵液，發(fā)酵300 h。發(fā)酵結束后，利用氣象色譜檢測發(fā)酵液中的こ醇濃度。得到結果如圖2所示。有圖2可以看出，補料中不同的甘油濃度導致發(fā)酵過程中こ醇的產量有較大差異，補料中甘油的初始濃度越大，こ醇的產量越低，當甘油濃度為20 g/L時，こ醇產量最大，最大值為12. I g/L,故確定最佳甘油初始濃度為20 g/L。實施例3本實施案例說明補料中不同補料時間間隔對こ醇產量的影響，在I L三角瓶中裝入400mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為甘油20，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸鎂I. 5，磷酸氫ニ鉀5，磷酸ニ氫鉀5，硫酸銨1，PH4. 5。將制作好的紅曲種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，32°C、180 rpm/min震蕩培養(yǎng)48 h ;按10%接種量將制作好的浸麻芽孢桿菌接入紅曲發(fā)酵液中，41°C靜止培養(yǎng)；每隔一定時間補入100 mL含有20 g/L甘油的新鮮紅曲發(fā)酵液，時間間隔分別為30 h、40 h、50 h、60 h、70 h，發(fā)酵300 h。發(fā)酵結束后，利用氣象色譜檢測發(fā)酵液中的こ醇濃度。得到結果如圖3所示。由圖3可知，補料時間間隔短，導致發(fā)酵液中甘油濃度較大，高濃度的甘油可抑制微生物的生長，導致こ醇產量較低；當補料時間間隔為60 h吋，こ醇產量最大；當補料間隔過長時，發(fā)酵液中甘油濃度較小，影響こ醇產量。所以確定最佳補料時間間隔為60 h。實施例4
本實施案例說明不同裝液量對こ醇產量的影響，在I L三角瓶中裝入300 mL、400 mL、500 mL、600 mL、700mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為甘油20，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸鎂I. 5，磷酸氫ニ 鉀5，磷酸ニ氫鉀5，硫酸銨1，ρΗ4. 5。將制作好的紅曲種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%, 320C ,180 rpm/min震蕩培養(yǎng)48 h ;按10%接種量將制作好的浸麻芽孢桿菌接入紅曲發(fā)酵液中，41°C靜止培養(yǎng)；每隔60 h補入100 mL含有20 g/L甘油的新鮮紅曲發(fā)酵液，發(fā)酵300 h。發(fā)酵結束后，利用氣象色譜檢測發(fā)酵液中的こ醇濃度。得到結果如圖4所示。由圖4可知，不同裝液量導致發(fā)酵液中溶氧不同，導致微生物生長及こ醇產量不同。當裝液量為500 mL吋，こ醇產量最大，所以確定最佳裝液量為500 mL。實施例5
本實施案例說明不同發(fā)酵時間對こ醇產量的影響，在I L三角瓶中裝入500 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為甘油20，蛋白胨2，酵母粉2，硫酸鎂I. 5，磷酸氫ニ鉀5，磷酸ニ氫鉀5，硫酸銨1，ρΗ4. 5。將制作好的紅曲種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5%，32°C、180 rpm/min震蕩培養(yǎng)48 h ;按10%接種量將制作好的浸麻芽孢桿菌接入紅曲發(fā)酵液中，41°C靜止培養(yǎng)；每隔60 h補入100 mL含有20 g/L甘油的新鮮紅曲發(fā)酵液進行分批發(fā)酵，分別利用氣象色譜檢測發(fā)酵180 h、240 h、300 h、360 h、420 h時發(fā)酵液中的こ醇濃度，得到結果如圖5所示。由圖5可知，隨著發(fā)酵的進行，こ醇產量逐漸增加，但360 h后こ醇產量變化不大，故選擇發(fā)酵360 h為最佳發(fā)酵時間。
權利要求
1.一種采用混合培養(yǎng)微生物利用甘油發(fā)酵生產乙醇的方法，其特征在于往I L三角瓶中裝入一定量的發(fā)酵培養(yǎng)基，將紅曲種子液接入培養(yǎng)基中，接種量5%，320C、180 rpm/min震蕩培養(yǎng)48 h ;按10%接種量將浸麻芽孢桿菌接入紅曲發(fā)酵液中，41°C靜止培養(yǎng)；每隔一定時間補入100 mL含有一定濃度的甘油的新鮮紅曲發(fā)酵液，發(fā)酵一定時間。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基一定量的甘油，蛋白胨2g/L，酵母粉2 §/1，硫酸鎂1.5 g/L，磷酸氫二鉀5 g/L，磷酸二氫鉀5 g/L，硫酸銨I g/L，pH4. 5。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于甘油初始濃度為20g/L。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于裝液量500mL/1 L三角瓶。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于紅曲種子液的制作方法為用無菌水從活化好的斜面上刮洗制成孢子菌懸液，按5%接種量接入紅曲種子培養(yǎng)基中，32°C、180 rpm/min震蕩培養(yǎng)48 h。
6.根據權利要求5中所述的方法，其特征在于，紅曲種子培養(yǎng)基甘油50g/L，蛋白胨5 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉2. 5 g/L,硫酸鎂I. 5 g/L,磷酸氫二鉀5 g/L,磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸鋅 2 g/L，pH4.5。
7.根據權利要求I所述的方法，其特征在于浸麻芽孢桿菌種子液的制作方法為用無菌水從活化好的斜面上刮洗制成孢子菌懸液，按10%接種量接入浸麻芽孢桿菌種子培養(yǎng)基中，41 °C靜置培養(yǎng)36 h。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，浸麻芽孢桿菌種子培養(yǎng)基甘油8g/L，葡萄糖12 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母粉5 g/L，pH9.0。
9.根據權利要求I所述的方法，其特征在于補料時間間隔為60h。
10.根據權利要求I所述的方法，其特征在于補料中甘油濃度為20g/L。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種采用浸麻芽孢桿菌和紅曲菌利用甘油混合發(fā)酵生產乙醇的方法，本發(fā)明以浸麻芽孢桿菌和紅曲菌為出發(fā)菌株，以甘油為原始材料，對影響乙醇產量的甘油初始濃度、補料中甘油濃度、補料時間間隔、發(fā)酵時間、裝液量進行了研究。
文檔編號C12R1/645GK102703563SQ20121021224
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月26日 優(yōu)先權日2012年6月26日
發(fā)明者周雪琴 申請人:太倉市周氏化學品有限公司