專利名稱：一種微氧-厭氧連續(xù)流加甘油多罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種微生物連續(xù)流加甘油發(fā)酵生產(chǎn)1，3_丙 二醇的方法，特別涉及一種微氧-厭氧連續(xù)流加甘油多罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方 法。
背景技術(shù)：
1，3_丙二醇(l，3-Propanediol，簡稱1，3_PD)作為一種重要的化工原料廣泛應(yīng)用 于油墨、印染、涂料、潤滑劑、抗凍劑等行業(yè)，還可用作醫(yī)藥和有機合成的中間體。1，3-PD還 可作為聚合物單體合成高分子材料，特別是合成性能優(yōu)異的新型聚酯纖維聚對苯二甲酸丙 二酯(PTT)。PTT被認(rèn)為是一種兼具聚對苯二甲酸乙二酯(PET)的高性能和聚對苯二甲酸 丁二酯(PBT)的易加工性的新型聚酯材料，并且具有自然循環(huán)的可生物降解特性，是目前 合成纖維新品種開發(fā)的熱點，具有廣闊的應(yīng)用前景。因此，開發(fā)低成本的1，3-PD已經(jīng)成為 目前科研工作者關(guān)注的焦點。近年來，1，3_PD的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)法和微生物發(fā)酵法。與化學(xué)法相比，微生物 發(fā)酵法具有操作條件溫和、副產(chǎn)物少、操作簡單安全及環(huán)境污染小等優(yōu)點。能以甘油為底物 生物轉(zhuǎn)化1，3_PD的菌種中克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)具有較高的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn) 能力，因而受到更多的關(guān)注?？死撞畻U菌是一種兼性厭氧菌，目前研究結(jié)果表明，該菌在微 氧和厭氧的條件下都能夠生成1，3-PD。微氧條件能夠促進(jìn)菌體的生長和提高生產(chǎn)強度，厭 氧條件有利于積累1，3_PD并提高轉(zhuǎn)化率。在生成1，3-PD的過程中，菌體生長和催化是耦 聯(lián)的，因此在發(fā)酵過程中必須控制條件使菌體在較佳環(huán)境中得到生長。細(xì)胞生長還與底物 濃度密切相關(guān)，底物濃度過高會對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制，濃度過低則生成較多的副產(chǎn)物，兩種 情形都不利于1，3-PD的生產(chǎn)，為此需要將底物甘油濃度控制在一個合理的范圍內(nèi)。目前，微生物發(fā)酵生產(chǎn)1，3_PD的工藝主要包括間歇發(fā)酵、批式流加發(fā)酵和連續(xù)發(fā) 酵。其中間歇發(fā)酵可以得到較高的產(chǎn)物濃度，但生產(chǎn)強度較低；批式流加是目前微生物發(fā) 酵生產(chǎn)1，3-PD的主要方式，可以得到較高的產(chǎn)物濃度和生產(chǎn)強度，但是批式流加發(fā)酵與間 歇發(fā)酵一樣，由于需要頻繁的放罐、滅菌等操作，導(dǎo)致非生產(chǎn)時間長、儀器使用壽命短、生產(chǎn) 成本高，不利于進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；而連續(xù)發(fā)酵有利于提高生產(chǎn)強度，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定， 非生產(chǎn)時間短，并且可以實現(xiàn)有規(guī)律的自動化生產(chǎn)，容易實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，但是連續(xù)發(fā)酵存在的 突出問題是產(chǎn)物濃度低。為了提高1，3-PD的濃度，研究人員通過提高發(fā)酵培養(yǎng)基中甘油的 濃度來實現(xiàn)，例如Menzel等人在初始甘油濃度為145g/L的條件下，厭氧連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)1， 3-PD 的濃度可達(dá) 48. 5g/L(Enzyme Microbiol Technol. 1997,20(2) :82_86)，但是由于強 烈的底物抑制作用，菌體干重僅為0. 7g/L，而且發(fā)酵液中的殘余甘油濃度高達(dá)48g/L，造成 極大的原料浪費，并且加重了后續(xù)產(chǎn)物分離的難度。為了降低發(fā)酵液中殘余甘油的濃度， Seraphim等人利用兩個罐串聯(lián)的方式進(jìn)行厭氧連續(xù)發(fā)酵，可以將發(fā)酵液中殘余甘油的濃度 降低至 8. 6g/L，但是生產(chǎn)強度較低，僅為 3. 4g/L h(J. Biotechnol. 2000，77 =191-208)。
為了解決連續(xù)發(fā)酵中存在的細(xì)胞密度低、產(chǎn)物濃度低、殘留甘油濃度高等問題，本 發(fā)明采用微氧-厭氧聯(lián)合連續(xù)流加甘油的多罐串聯(lián)發(fā)酵方式生產(chǎn)1，3-PD。在整個連續(xù)發(fā)酵 過程中至少采用三個串聯(lián)發(fā)酵罐，第一個發(fā)酵罐采用微氧發(fā)酵方式促進(jìn)菌體生長旺盛，保 證菌體活力；第二個發(fā)酵罐采用厭氧連續(xù)發(fā)酵方式，流加甘油將罐中殘余甘油的濃度控制 在合理范圍內(nèi)，以利于1，3-PD的生成，提高1，3-PD濃度和轉(zhuǎn)化率；串聯(lián)的其它發(fā)酵罐采用 厭氧連續(xù)發(fā)酵，主要任務(wù)是消耗掉第二個罐中殘余的甘油。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用克雷伯氏菌、檸檬菌等兼性厭氧菌通過微氧-厭氧聯(lián)合連續(xù)流加甘油 的多罐串聯(lián)培養(yǎng)模式，提高連續(xù)發(fā)酵過程中1，3-PD的濃度和生產(chǎn)強度，降低最終發(fā)酵液中 的甘油濃度。本發(fā)明的技術(shù)方案是在整個連續(xù)流加發(fā)酵的過程中至少采用三個串聯(lián)發(fā)酵罐。第 一個發(fā)酵罐采用微氧發(fā)酵方式連續(xù)培養(yǎng)，第二個罐中厭氧連續(xù)流加甘油，將罐中殘余甘油 的濃度控制在有利于1，3-丙二醇形成的范圍內(nèi)，串聯(lián)的其它發(fā)酵罐采用厭氧連續(xù)發(fā)酵，用 來消耗掉第二個罐中殘余的甘油。實現(xiàn)本發(fā)明的步驟如下1)微生物培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基中必須具備微生物生長所需要的營養(yǎng)成分，如葡 萄糖或甘油等碳源，尿素、銨鹽、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸鹽(磷源)和硫酸鹽 (硫源)等。此外還需要鈉、鉀、鎂、鈣等陽離子以及鋅、鐵、錳、銅、鈷、硼和鉬等微量元素， 每種微量元素的含量大約在0.01mg/L 50mg/L的范圍內(nèi)。培養(yǎng)基在121°C下滅菌15 20min后使用。2)種子培養(yǎng)在搖瓶中進(jìn)行，搖床轉(zhuǎn)速為100 300r/min，溫度為27 40°C，培 養(yǎng)時間為10 15h。3)發(fā)酵培養(yǎng)在多個發(fā)酵罐中進(jìn)行，發(fā)酵罐接種量為5% 20%，攪拌漿轉(zhuǎn)速為 100 300r/min，溫度為27 40°C，pH值為6 8。在發(fā)酵過程中向發(fā)酵罐中分別通入氮 氣和空氣，通氣量為0. 02 0. lvvm，發(fā)酵方式為連續(xù)發(fā)酵或連續(xù)流加發(fā)酵。具體發(fā)酵操作 過程如下(1)第一發(fā)酵罐用10 60g/L甘油培養(yǎng)基進(jìn)行間歇培養(yǎng)，通入空氣維持微氧環(huán) 境以保證菌體生長旺盛，待發(fā)酵液中的菌體達(dá)到一定密度(0D65CI為2 5)時，再以0. 1 0. 31T1的稀釋速率流加發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油濃度為20 110g/L)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程 中調(diào)整稀釋速率和發(fā)酵培養(yǎng)基甘油濃度，以防止底物濃度過高或過低而抑制或限制菌體生長。(2)將第一發(fā)酵罐中的發(fā)酵液泵入第二發(fā)酵罐，通入氮氣維持厭氧環(huán)境以提高1， 3-PD的濃度和轉(zhuǎn)化率；以一定速率流加甘油，保持該第二發(fā)酵罐中殘余甘油濃度為15 30g/L，以促進(jìn)1，3-PD的積累。(3)將第二發(fā)酵罐中的發(fā)酵液泵入第三個發(fā)酵罐，通入氮氣維持厭氧環(huán)境以利于 生成1，3-PD，并且進(jìn)一步消耗殘余的甘油。可以通過調(diào)整第三個發(fā)酵罐的稀釋速率或繼續(xù) 增加新的發(fā)酵罐的方式將殘余甘油消耗至理想的水平，如小于lg/L。通過這種多罐串聯(lián)連續(xù)流加發(fā)酵工藝，最終1，3_PD的濃度可以達(dá)到37 46g/L，生產(chǎn)強度為4 8g/L h，終產(chǎn)物殘余甘油的濃度僅為1 13g/L。 本發(fā)明的效果和益處在于利用兼性厭氧菌生長和產(chǎn)物積累的特點，充分發(fā)揮微氧
條件對細(xì)胞生長有利和厭氧條件下適度的甘油濃度對產(chǎn)物形成有利的規(guī)律，解決連續(xù)發(fā)酵
中存在的細(xì)胞生長與產(chǎn)物積累的矛盾，在提高菌體密度的同時提高1，3-PD的終濃度和生
長強度，降低殘余甘油的濃度，節(jié)省產(chǎn)物與甘油分離的費用，降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。


附圖是本發(fā)明微氧_厭氧連續(xù)流加甘油多罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的工藝流 程示意圖。Fp F2、F3分別是三個串聯(lián)的發(fā)酵罐，其中Fi是微氧連續(xù)發(fā)酵的第一發(fā)酵罐，F(xiàn)2是 厭氧連續(xù)發(fā)酵的第二發(fā)酵罐，F(xiàn)3是厭氧連續(xù)發(fā)酵的第三發(fā)酵罐。
具體實施例方式
菌。

酵母粉 CuCl2
以下結(jié)合技術(shù)方案和附圖詳細(xì)敘述本發(fā)明的具體實施例。 1)菌種克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)CGMCC 2028，是-
-種兼性厭氧
2)培養(yǎng)基
A.種子培養(yǎng)基(1L)
甘油:20g, KH2P04 :1. 3g, K2HP04 3H20 :4. 56g, (NH4) 2S04 :2. Og, MgS04 7H20 :0. 2g, :lg, CaC03 :2g。微量元素 A :2mL，F(xiàn)e2+溶液lmL，Ca2+溶液lmL。
微量元素 A(1L) :ZnCl2 :70mg,MnCl2 .4H20 :100mg，H3B03 :60mg，CoCl2 .6H20 :200mg， 6H20 :20mg, NiCl2 6H20 :25mg，Na2Mo04 2H20 :5mg，HC1 (12M) :0. 9mL。 Fe2+溶液(1L) :FeS04 7H20 :5g，HC1 (12M) :4mL Ca2+溶液(1L) :CaCl2 :20g。
B.發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)甘油40g，KH2P04:1. 36g, (NH4)2S04 :6. 61g，MgCl2 6H20 : 0. 26g，CaCl2 :0. 29g，檸檬酸0. 42g，酵母粉2g。微量元素 B :5mL。微量元素B (1L) :ZnCl2 :0. 68g, MnCl2 4H20 :0. 17g, H3B03 : 0 . 06g, CuCl2 2H20 0. 47g, Na2Mo04 2H20 :0. 005g, FeCl2 4H20 :3. 97g, CoCl2 6H20 :0. 47g, HC1 (12M) :10mL。3)種子培養(yǎng)在250mL的三角瓶中進(jìn)行，裝液量為100mL，接種量為1 %，于37°C、 150r/m搖床培養(yǎng)12h。實例1在全自動發(fā)酵罐中進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，工作體積為5L，實際裝液量為1. 5L，接種量為 10%，轉(zhuǎn)速控制為150r/m，空氣或氮氣的通氣量為0. 04vvm，用5mol/LNa0H溶液調(diào)節(jié)pH值 為7. 0，溫度控制在37°C。發(fā)酵罐1、2和3中的初始甘油濃度分別為40、20和20g/L。發(fā)酵罐1 通入空氣維持微氧環(huán)境，先進(jìn)行間歇培養(yǎng)，待菌體0D65(I達(dá)到3. 0時，再以 0. 21T1的稀釋速率流加發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行恒化培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的甘油濃度為40g/L，達(dá)到穩(wěn)態(tài) 時菌體0D65(1值為5. 1，殘余甘油濃度為0. 9g/L，1,3-PD的濃度和摩爾轉(zhuǎn)化率分別為15. 2g/ L 禾口 0. 47mol/moL
發(fā)酵罐2 將罐1中的發(fā)酵液泵入發(fā)酵罐2中，通入氮氣維持厭氧環(huán)境，勻速流加 95%甘油使殘余甘油維持在30. 9g/L。達(dá)到穩(wěn)態(tài)時，罐2中1，3-PD的濃度和摩爾轉(zhuǎn)化率均 有所提高，分別為32. 2g/L和0. 54mol/mol0發(fā)酵罐3 將罐2中的發(fā)酵液泵入發(fā)酵罐3中，通入氮氣維持厭氧環(huán)境，消耗殘余 的甘油濃度。最終1，3-PD的濃度可以達(dá)到37. 3g/L，生產(chǎn)強度為7. 5g/L *h，殘余甘油的濃 度僅為3. 7g/L。實例2發(fā)酵過程同實例1，進(jìn)入發(fā)酵罐1的培養(yǎng)基中甘油濃度為70g/L，稀釋速率0. 11T1， 發(fā)酵罐2中控制殘余甘油濃度為18. 9g/L。實驗結(jié)果，最終1，3_PD的濃度可以達(dá)到39. 5g/L，生產(chǎn)強度為4. Og/L h，殘余甘 油的濃度僅為1.4g/L。實例3發(fā)酵過程同實例1，發(fā)酵罐1的培養(yǎng)基中甘油濃度為90g/L，稀釋速率0. lh—1，發(fā)酵 罐2中控制殘余甘油濃度為18. 4g/L。實驗結(jié)果，最終1，3_PD的濃度可以達(dá)到41. lg/L，生產(chǎn)強度為4. lg/L h，殘余甘 油的濃度為10. lg/L。實例 4發(fā)酵過程同實例1，發(fā)酵罐1的培養(yǎng)基中甘油濃度為110g/L，稀釋速率0. 11T1，發(fā) 酵罐2中控制殘余甘油濃度為21. 2g/L。實驗結(jié)果，最終1，3_PD的濃度可以達(dá)到45. 7g/L，生產(chǎn)強度為4. 6g/L h，殘余甘 油的濃度為13. 3g/L。
權(quán)利要求
一種微氧-厭氧連續(xù)流加甘油多罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，其特征在于利用兼性厭氧菌連續(xù)轉(zhuǎn)化甘油生成1，3-丙二醇，在整個發(fā)酵過程中至少使用三個發(fā)酵罐；其中第一個發(fā)酵罐采用微氧連續(xù)發(fā)酵方式，促進(jìn)細(xì)胞生長；第二個發(fā)酵罐采用厭氧連續(xù)流加甘油的方式，將殘余甘油的濃度控制在有利于1，3-丙二醇形成的范圍內(nèi)；串聯(lián)的其余發(fā)酵罐采用厭氧連續(xù)發(fā)酵方式，消耗第二個罐中殘余的甘油；第一個發(fā)酵罐接種量為5％～20％；各個發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為100～300r/min、溫度為27～40℃、pH值為6～8；向各個發(fā)酵罐中分別通入空氣和氮氣維持微氧或厭氧條件，通氣量為0.02～0.1vvm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微氧-厭氧連續(xù)流加甘油多罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)1，3_丙二 醇的方法，其特征在于第一個發(fā)酵罐先用10 60g/L甘油培養(yǎng)基進(jìn)行間歇培養(yǎng)，通入空氣 維持微氧環(huán)境，待發(fā)酵液中的菌體達(dá)到OD65tl為2 5時，再以0. 1 0. 31Γ1的稀釋速率流 加甘油濃度為20 110g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種微氧-厭氧連續(xù)流加甘油多罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)1，3_丙二 醇的方法，其特征在于將第一個發(fā)酵罐中的發(fā)酵液泵入第二個發(fā)酵罐，通入氮氣維持厭氧 環(huán)境；流加甘油，保持殘余甘油濃度為15 30g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種微氧_厭氧連續(xù)流加甘油多罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)1， 3_丙二醇的方法，其特征在于將第二個發(fā)酵罐中的發(fā)酵液泵入串聯(lián)的下一級發(fā)酵罐，通 入氮氣維持厭氧環(huán)境，消耗殘余的甘油濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種微氧-厭氧連續(xù)流加甘油多罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)1，3_丙二 醇的方法，其特征還在于通過調(diào)整第三個發(fā)酵罐的稀釋速率或繼續(xù)增加新的發(fā)酵罐的方 式促進(jìn)第二個發(fā)酵罐中殘余甘油的消耗。
全文摘要
一種微氧-厭氧連續(xù)流加甘油多罐串聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。其特征在于根據(jù)微生物發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇的微氧及厭氧特性，利用至少三個發(fā)酵罐串聯(lián)的方式，在不同的發(fā)酵罐中采用不同的通氣方式和甘油流加策略。第一個發(fā)酵罐微氧發(fā)酵促進(jìn)菌體生長旺盛；第二個發(fā)酵罐厭氧流加甘油提高1，3-丙二醇的濃度和轉(zhuǎn)化率；其它發(fā)酵罐厭氧發(fā)酵進(jìn)一步提高1，3-丙二醇的濃度，同時消耗掉殘余甘油。本發(fā)明的效果和益處是充分發(fā)揮每一步發(fā)酵的特點，提高菌體濃度、1，3-丙二醇的終濃度和生產(chǎn)強度；降低甘油的終濃度和生產(chǎn)成本；實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1，3-丙二醇提供一種經(jīng)濟(jì)可行的方法。
文檔編號C12R1/22GK101851642SQ201010192158
公開日2010年10月6日 申請日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者修志龍, 滕虎, 王元好 申請人:大連理工大學(xué)