一種直接測定厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性的方法與裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶活性測定領域，公開一種直接測定厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性的方法與裝置。先向反應體系內(nèi)連續(xù)通氣至少2min，測定氫化酶和一氧化碳脫氫酶活性時對應的氣體分別為氫氣和一氧化碳，然后將0.5mL待測厭氧微生物的菌液注射入反應體系內(nèi)，再連續(xù)通氣至少2min，接著于37℃條件下保持6min，反應過程結束時冰浴終止反應，取0.2mL反應液測定吸光度值，經(jīng)換算即得酶活。裝置包括氣體供給裝置、酶活反應裝置和酶標儀。本發(fā)明步驟簡單，操作簡便，無需對樣品進行處理，檢測時間短，取樣量小，酶活穩(wěn)定有效，設備要求較低，避免酶活必須在厭氧操作箱內(nèi)操作，減少氮氣耗用量，靈活性好，適用于對厭氧微生物樣品中的氫化酶和一氧化碳脫氫酶活性測定。
【專利說明】一種直接測定厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性 的方法與裝置
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性測定【技術領域】，具體涉及一種直接測定 厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性的方法與裝置。
【背景技術】
[0002] 厭氧菌是一類在無氧條件下比在有氧環(huán)境中生長好的微生物，且不能直接暴露在 含氧量大于或等于18%的空氣里，對氧氣敏感，一般可分為絕對厭氧菌和兼性厭氧菌兩類。 厭氧菌屬于較為古老的原核菌進化而來，目前不斷發(fā)現(xiàn)較多的厭氧菌特別是絕對厭氧菌具 有很大的發(fā)酵應用和工業(yè)生產(chǎn)價值，如ClostridiumcarboxidivoransP7、Clostridium strainPll、Clostridiumljungdahlii和ClostridiumautoethanogenumDSM10061 等。 此類厭氧菌能夠利用乙酰CoA/Wood-Ljungdahl代謝途徑行使生命活動進行生長繁殖，另 外研究證明該類菌的代謝物還可作為人類所需要的生物燃料或原料，如乙醇、丁醇和脂類 等。
[0003] 氫化酶（hydrogenase，簡稱H2ase)是一類存在于微生物尤其是厭氧菌體內(nèi)的重要 生物酶，是一種催化伴有氫分子釋放或分子氫轉化質子的氧化還原反應酶，它通過控制微 生物體內(nèi)氫的代謝來調節(jié)細菌的其他生理活動。
【權利要求】
1. 一種直接測定厭氧微生物內(nèi)氫化酶或一氧化碳脫氫酶活性的方法，其特征在于：先 向反應體系內(nèi)連續(xù)通氣至少2min，測定氫化酶和一氧化碳脫氫酶活性時對應的氣體分別為 氫氣和一氧化碳，然后將〇. 5mL待測厭氧微生物的菌液注射入反應體系內(nèi)，再連續(xù)通氣至 少2min，接著于37°C條件下保持6min，反應過程結束時冰浴終止反應，取0. 2mL反應液測定 吸光度值，經(jīng)換算即得酶活。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：測定氫化酶活性時，對應的反應體系組成 為：0? 4mL1M、pH=7. 5 的Tris-HCl緩沖液，0? 2mL0? 04M的甲基紫精溶液，0? 2mL0? 04M 的二硫蘇糖醇溶液，〇.lmL5v%的Trit〇n-X100溶液，2mL脫氣去離子水；測定一氧化碳 脫氫酶活性時，對應的反應體系組成為：〇. 8mL0. 5M、pH=6. 8的Tris-HCl緩沖液，0. 2mL 0. 04M的甲基紫精溶液，0. 2mL0. 04M的二硫蘇糖醇溶液，0.lmL5v%的Triton-X100溶液， 1. 2mL脫氣去離子水；以上反應體系中，Tris-HCl緩沖液、甲基紫精溶液、二硫蘇糖醇溶液、 Trit〇n-X100溶液配制時采用的水均為脫氣去離子水。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：涉及的兩處通氣，其流速范圍均控制在 1 ~10mT,/min〇
4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：采用酶標儀測定反應液的吸光度值，測定波 長為578nm，同時以未加待測厭氧微生物的菌液的反應體系作為對照液。
5. 如權利要求1或4所述的方法，其特征在于：所述待測厭氧微生物的菌液為待測厭 氧微生物的種子液或發(fā)酵液。
6. -種實現(xiàn)如權利要求1-3任一所述方法的裝置，其特征在于：該裝置包括氣體供給 裝置、酶活反應裝置和酶標儀；所述氣體供給裝置的結構構造為：包括氣體儲罐、帶鐵夾的 鐵架臺、多通管，多通管固定在鐵夾上，氣體儲罐的罐頂設有氣罐閥，氣體儲罐的氣體出管 上依次設有安全閥和流量調節(jié)閥，安全閥上連接有低壓表和高壓表，流量調節(jié)閥上連接有 氣體流量計，氣體出管的末端通過第一輸氣管路連接至多通管其中的一個管口，多通管的 剩余管口則分別各連接一個第二輸氣管路，第二輸氣管路又與連接導管連接；所述酶活反 應裝置的結構構造為：包括固定座板，固定座板上設有至少一個反應管，反應管頂部設有密 封墊，密封墊上針頭朝下插入有進氣針頭和出氣針頭，并且進氣針頭插入密封墊直至反應 管底部，出氣針頭插入密封墊直至漏出部分的長度為〇. 5-2cm;氣體供給裝置和酶活反應 裝置之間通過連接導管連接至進氣針頭的尾部實現(xiàn)連接，酶標儀則相對氣體供給裝置和酶 活反應裝置獨立設置。
7. 如權利要求6所述的裝置，其特征在于：所述酶標儀型號為MultisuanGo1510,酶 標儀采用96孔板，每孔上樣量均為0. 2mL，掃描震動10s。
8. 如權利要求6所述的裝置，其特征在于：所述反應管為5mLEP管；所述密封墊為一 次性醫(yī)用10mL注射器橡膠活塞且凸面朝下放置；所述進氣針頭和出氣針頭的規(guī)格型號分 別為麻醉用 〇? 5X100SB與 0? 45X16RWLB。
9. 如權利要求6所述的裝置，其特征在于：所述多通管為四通管，所述反應管的數(shù)量為 三個。
10. 如權利要求6所述的裝置，其特征在于：所述第一輸氣管路和第二輸氣管路均為橡 膠管；所述連接導管由lmL無菌醫(yī)用注射器切除尾部制成。
【文檔編號】G01N33/573GK104515851SQ201510008457
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2015年1月8日 優(yōu)先權日:2015年1月8日
【發(fā)明者】宋安東, 張炎達, 彭華, 王風芹, 謝慧, 楊森, 任天寶 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學, 河南省環(huán)境監(jiān)測中心