專利名稱：添加兩性霉素發(fā)酵液提高耐高滲酵母發(fā)酵甘油濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于甘油制備技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及采用耐高滲酵母發(fā)酵生產(chǎn)甘油過程中的一種添加兩性霉素發(fā)酵液提高發(fā)酵甘油濃度的方法。
背景技術(shù)：
發(fā)酵法生產(chǎn)甘油源于第一次世界大戰(zhàn)期間，當(dāng)時(shí)德國需要大量甘油制造炸藥，首先發(fā)明了向酵母發(fā)酵醪液中添加亞硫酸鹽生產(chǎn)甘油的工藝，并建廠進(jìn)行大批量生產(chǎn)。由于該工藝不合理、環(huán)境污染嚴(yán)重、生產(chǎn)水平低、生產(chǎn)成本高未能繼續(xù)進(jìn)行生產(chǎn)，戰(zhàn)后就停止了。之后，許多國家特別是發(fā)達(dá)國家對發(fā)酵甘油的研究十分重視，進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究工作，但因發(fā)酵產(chǎn)率低、成本高，難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。隨著甘油需求量的日益增加，五十年代中期，研究者開發(fā)出了利用耐高滲酵母在高糖濃度和通氣的條件下發(fā)酵生產(chǎn)高濃度甘油的工藝。該工藝與常規(guī)發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝過程相似，與添加亞硫酸鹽的發(fā)酵工藝相比，基本不造成環(huán)境污染，發(fā)酵液中的甘油含量有了較大的提高，因而受到人們的高度青睞。
用耐高滲酵母發(fā)酵甘油，其細(xì)胞膜透性影響底物和產(chǎn)物的運(yùn)輸，而細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)又影響了細(xì)胞膜透性。在文獻(xiàn)1).Son Tran-Dinh，Martine Herve，OdetteLebourguais，Muriel Jerome and Jaime Wietzerbin，1991，Effects ofamphotericin B on the glucose metabolism in Saccharomyces cerevisiae cells，European Journal of Biochemistry，197(1)271-279)和文獻(xiàn)2).H.Ramos，A.Attias de Murciano，B.E.Cohen and J.Bolard，1989，The polyene antibioticamphotericin B acts as a Ca2+ionophore in sterol-containing liposomes，Biochimica et Biophysica Acta，982303-306.和文獻(xiàn)3).Wilfred N.Arnoldand Brenda P.Johnson，1982，Effects of polyenes，Detergents，and OtherPotential Membrane Perturbants on an Osmotolerent Yeast，Saccharomycesrouxii，Applied and Environmental Microbiology，43(2)311-318分別報(bào)道了兩性霉素對細(xì)胞膜透性的影響。利用兩性霉素與細(xì)胞膜脂質(zhì)成分結(jié)合形成膜分子通道，可改善細(xì)胞的膜透性，提高發(fā)酵產(chǎn)物的濃度。然而，由于兩性霉素藥用級試劑價(jià)格昂貴，在工業(yè)化生產(chǎn)中使用會增加生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種添加兩性霉素發(fā)酵液提高耐高滲酵母發(fā)酵甘油濃度的方法。其特征在于在耐高滲酵母發(fā)酵甘油的過程中，添加兩性霉素發(fā)酵液來改善耐高滲酵母細(xì)胞的膜透性，調(diào)節(jié)滲透壓，使胞內(nèi)甘油分泌到胞外，進(jìn)而提高發(fā)酵甘油的濃度。具體實(shí)施過程是在三角瓶中添加50-100ml的甘油發(fā)酵培養(yǎng)基，接入體積百分比5-10％的耐高滲酵母菌種，在溫度30-35℃、搖床轉(zhuǎn)速140-160r/min下發(fā)酵生產(chǎn)甘油，同時(shí)，在甘油發(fā)酵過程中，在0-％小時(shí)之間加入體積百分比0.5-2％的兩性霉素發(fā)酵液繼續(xù)進(jìn)行甘油發(fā)酵。
所述發(fā)酵生產(chǎn)甘油的培養(yǎng)基成份包括斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖20％，玉米漿0.3％，尿素0.3％，瓊脂2％，pH4.0-4.5、種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖10％，玉米漿0.4％，尿素0.3％，pH4.0-4.5和發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖30％，玉米漿0.25％，尿素0.25％，pH4.0-4.5；以上各培養(yǎng)基均于110℃，滅菌20分鐘。
所述發(fā)酵生產(chǎn)甘油的菌種為耐高滲酵母。
所述添加兩性霉素發(fā)酵液發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基成分包括斜面培養(yǎng)基組成為酵母提取物5g、葡萄糖5g、CaCO30.05g、K2HPO40.25g、瓊脂7.8g、pH7.2-7.4、種子培養(yǎng)基組成為酵母提取物5g、葡萄糖5g、CaCO30.05g、pH7.2-7.4和發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖25g、蛋白胨5g、CaCO30.5g、MnCl2·4H2O0.005g、FeSO4·7H2O0.005g、pH7.2-7.4。以上各培養(yǎng)基均于110℃，滅菌20分鐘。
所述添加兩性霉素發(fā)酵液發(fā)酵生產(chǎn)的菌種為結(jié)節(jié)鏈霉菌。
所述添加兩性霉素發(fā)酵液發(fā)酵生產(chǎn)的溫度為28-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為220-250r/min。
本發(fā)明的有益效果是添加兩性霉素發(fā)酵液后可增加發(fā)酵甘油的濃度。該工藝過程簡單、易于控制、成本較低。易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明為添加兩性霉素發(fā)酵液提高耐高滲酵母發(fā)酵甘油濃度的方法。在耐高滲酵母發(fā)酵甘油的過程中，添加兩性霉素發(fā)酵液來改善耐高滲酵母細(xì)胞的膜透性，調(diào)節(jié)滲透壓，使胞內(nèi)甘油分泌到胞外，進(jìn)而提高發(fā)酵甘油的濃度。具體實(shí)施過程是在三角瓶中添加50-100ml的甘油發(fā)酵培養(yǎng)基，接入體積百分比5-10％的耐高滲酵母菌種，在溫度30-35℃、搖床轉(zhuǎn)速140-160r/min下發(fā)酵生產(chǎn)甘油，同時(shí)，在甘油發(fā)酵過程中，在0-96小時(shí)之間加入體積百分比0.5-2％的兩性霉素發(fā)酵液繼續(xù)進(jìn)行甘油發(fā)酵。發(fā)酵生產(chǎn)甘油的菌種為耐高滲酵母。發(fā)酵生產(chǎn)甘油的培養(yǎng)基包括斜面培養(yǎng)基為葡萄糖20％，玉米漿0.3％，尿素0.3％，瓊脂2％，pH4.0-4.5、種子培養(yǎng)基為葡萄糖10％，玉米漿0.4％，尿素0.3％，pH4.0-4.5和發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30％，玉米漿0.25％，尿素0.25％，pH4.0-4.5；以上各培養(yǎng)基均于110℃，滅菌20分鐘。
上述添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基成分包括斜面培養(yǎng)基組成為酵母提取物5g、葡萄糖5g、CaCO30.05g、K2HPO40.25g、瓊脂7.8g、pH7.2-7.4、種子培養(yǎng)基組成為酵母提取物5g、葡萄糖5g、CaCO30.05g、pH7.2-7.4和發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖25g、蛋白胨5g、CaCO30.5g、MnCl2·4H2O0.005g、FeSO4·7H2O0.005g、pH7.2-7.4。以上各培養(yǎng)基均于110℃，滅菌20分鐘。發(fā)酵生產(chǎn)接入結(jié)節(jié)鏈霉菌菌種，再在溫度為28-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為220-250r/min下發(fā)酵生產(chǎn)。
下面再舉實(shí)施例對本發(fā)明予以進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1將50ml甘油發(fā)酵培養(yǎng)基置于三角瓶中，接5ml的耐高滲酵母菌種，在溫度35℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min下發(fā)酵培養(yǎng)至24小時(shí)，加入0.25ml的兩性霉素發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至36小時(shí)，與不添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度相比，添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度增加了41％。
實(shí)施例2將50ml甘油發(fā)酵培養(yǎng)基置于三角瓶中，接5ml的耐高滲酵母菌種，在溫度34℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min下發(fā)酵培養(yǎng)至24小時(shí)，加入0.5ml的兩性霉素發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至72小時(shí)，與不添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度相比，添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度增加了43％。
實(shí)施例3將50ml甘油發(fā)酵培養(yǎng)基置于三角瓶中，接5ml的耐高滲酵母菌種，在溫度33℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min下發(fā)酵培養(yǎng)至24小時(shí)，加入1ml的兩性霉素發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至36小時(shí)，與不添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度相比，添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度增加了34％。
實(shí)施例4將50ml甘油發(fā)酵培養(yǎng)基置于三角瓶中，接5ml的耐高滲酵母菌種，在溫度32℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min下發(fā)酵培養(yǎng)至24小時(shí)，加入0.5ml的兩性霉素發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至60小時(shí)，與不添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度相比，添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度增加了55％。
實(shí)施例5將50ml甘油發(fā)酵培養(yǎng)基置于三角瓶中，接5ml的耐高滲酵母菌種，在溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min下發(fā)酵培養(yǎng)至60小時(shí)，加入0.5ml的兩性霉素發(fā)酵液繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)至96小時(shí)，與不添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度相比，添加兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵甘油濃度增加了13％。
權(quán)利要求
1.一種添加兩性霉素發(fā)酵液提高耐高滲酵母發(fā)酵甘油濃度的方法，其特征在于在耐高滲酵母發(fā)酵甘油的過程中，添加兩性霉素發(fā)酵液來改善耐高滲酵母細(xì)胞的膜透性，調(diào)節(jié)滲透壓，使胞內(nèi)甘油分泌到胞外，進(jìn)而提高發(fā)酵甘油的濃度；具體實(shí)施過程是在三角瓶中添加50-100ml的甘油發(fā)酵培養(yǎng)基，接入體積百分比5-10％的耐高滲酵母菌種，在溫度30-35℃、搖床轉(zhuǎn)速140-160r/min下發(fā)酵生產(chǎn)甘油，同時(shí)，在甘油發(fā)酵過程中，在0-96小時(shí)之間加入體積百分比0.5-2％的兩性霉素發(fā)酵液繼續(xù)進(jìn)行甘油發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述添加兩性霉素發(fā)酵液提高耐高滲酵母發(fā)酵甘油濃度的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)甘油的培養(yǎng)基包括斜面培養(yǎng)基組成為葡萄糖20％，玉米漿0.3％，尿素0.3％，瓊脂2％，pH4.0-4.5、種子培養(yǎng)基組成為葡萄糖10％，玉米漿0.4％，尿素0.3％，pH4.0-4.5和發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖30％，玉米漿0.25％，尿素0.25％，pH4.0-4.5；以上各培養(yǎng)基均于110℃，滅菌20分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述添加兩性霉素發(fā)酵液提高耐高滲酵母發(fā)酵甘油濃度的方法，其特征在于所述發(fā)酵生產(chǎn)甘油的菌種為耐高滲酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述添加兩性霉素發(fā)酵液提高耐高滲酵母發(fā)酵甘油濃度的方法，其特征在于所述兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基成分包括斜面培養(yǎng)基組成為酵母提取物5g、葡萄糖5g、CaCO30.05g、K2HPO40.25g、瓊脂7.8g、pH7.2-7.4、種子培養(yǎng)基組成為酵母提取物5g、葡萄糖5g、CaCO30.05g、pH7.2-7.4和發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖25g、蛋白胨5g、CaCO30.5g、MnCl2·4H2O0.005g、FeSO4·7H2O0.005g、pH7.2-7.4；以上各培養(yǎng)基均于110℃，滅菌20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述添加兩性霉素發(fā)酵液提高耐高滲酵母發(fā)酵甘油濃度的方法，其特征在于所述兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵生產(chǎn)的菌種為結(jié)節(jié)鏈霉菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述添加兩性霉素發(fā)酵液提高耐高滲酵母發(fā)酵甘油濃度的方法，其特征在于所述兩性霉素發(fā)酵液的發(fā)酵生產(chǎn)的溫度為28-30℃，搖床轉(zhuǎn)速為220-250r/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于甘油制備技術(shù)領(lǐng)域一種添加兩性霉素發(fā)酵液提高發(fā)酵甘油濃度的方法。在甘油發(fā)酵培養(yǎng)基中接入耐高滲酵母菌種，同時(shí)，在甘油發(fā)酵過程中，加入兩性霉素發(fā)酵液繼續(xù)進(jìn)行甘油發(fā)酵。添加兩性霉素發(fā)酵液改善了耐高滲酵母細(xì)胞的膜透性，調(diào)節(jié)滲透壓，使胞內(nèi)甘油分泌到胞外，進(jìn)而提高發(fā)酵甘油的濃度10－90％。該工藝過程簡單、易于控制、成本較低。易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。
文檔編號C12P7/20GK1528908SQ20031010027
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者張建安, 楊燕鷗, 劉德華, 謝東明, 楊海榮 申請人:清華大學(xué), 中國科學(xué)院過程工程研究所