專利名稱：基于克魯斯假絲酵母的甘油生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種基于克魯斯假絲酵母的甘油生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
甘油，作為化學(xué)產(chǎn)品的重要副產(chǎn)品，又是其他化學(xué)產(chǎn)品的重要原料，主要用途有醫(yī)藥、化妝品、個人護理產(chǎn)品，香煙及食品。隨著我國國民經(jīng)濟的不斷發(fā)展，作為國計民生重要化工產(chǎn)品的甘油市場需求量不斷增長，尤其是在食品、化妝品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的需求在逐年增加。因此，開發(fā)國內(nèi)甘油的生產(chǎn)和應(yīng)用，對我國社會的發(fā)展意義重大。甘油又名丙三醇，為無色粘稠液體，是重要的輕化工原料，用途很廣，常用于個人護理、牙膏、醫(yī)藥、化妝品、食品等品種中。目前甘油來源主要為制皂工業(yè)和生物柴油的副產(chǎn)物、化學(xué)合成甘油、發(fā)酵法生產(chǎn)甘油三方面。但由于制皂工業(yè)的萎縮，皂化甘油的產(chǎn)量也大幅度下降，且化學(xué)合成甘油由于工藝復(fù)雜，技術(shù)難度大及其應(yīng)用范圍受限等因素制約其發(fā)展。隨著人民生活水平不斷的提高，各國對食品、日用品的安全限制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)越來越高， 特別是幾年前美國“毒甘油”事件之后，全球都在致力于不斷的提高食品與藥品的質(zhì)量和安全性。這種社會趨勢之下，發(fā)酵法生產(chǎn)甘油這種方法應(yīng)該重新被人們認識和重視，發(fā)酵法生產(chǎn)甘油是以淀粉類物質(zhì)作為原料，通過糖化后經(jīng)微生物菌種發(fā)酵后提取制得。首先其原料來源廣泛、價格低廉，其次經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中安全性比化學(xué)合成和皂化甘油更高，生產(chǎn)出的甘油產(chǎn)品應(yīng)用面更廣，因此可以作為解決我國高品質(zhì)甘油短缺狀況的一條重要的工藝路線。但近年來，發(fā)酵法生產(chǎn)的成品甘油質(zhì)量普遍不高、且生產(chǎn)成本和污染較大，在市場中逐漸地失去了其應(yīng)有的競爭力。主要為以下幾點首先，沒有穩(wěn)定的高產(chǎn)甘油菌株作為發(fā)酵生產(chǎn)的堅實基礎(chǔ)，現(xiàn)有發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的菌種主要包括細菌、酵母、霉菌、原生動物和藻類等，已經(jīng)被研究過的甘油生產(chǎn)菌株很多， 但酵母菌居多。亞硫酸鹽法發(fā)酵生產(chǎn)甘油的菌種為釀酒酵母S. cerevisiae，28°C發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化率為20% -25%，發(fā)酵液中亞硫酸鹽法含量高，使得甘油提取困難。堿性法發(fā)酵生產(chǎn)甘油使用的菌種為粉狀畢赤酵母Pichia farinosa，30°C發(fā)酵甘油轉(zhuǎn)化率38% -45%，發(fā)酵時間少于120h，發(fā)酵液中含鹽量多，影響甘油提取。耐高滲酵母法發(fā)酵生產(chǎn)甘油，耐高滲透壓假絲酵母發(fā)酵，甘油轉(zhuǎn)化率為40% -50%，發(fā)酵時間96h，發(fā)酵液中含鹽量少，利于甘油提取。除酵母菌之外，Rohr利用黑曲霉Aspergillus niger發(fā)酵甘油的轉(zhuǎn)化率僅為 6%。Neish報道枯草芽胞桿菌B. subtilis發(fā)酵生產(chǎn)甘油的轉(zhuǎn)化率為30%左右。Ben-Amotzl 報道利用藻類Dimalielle經(jīng)光合作用藻內(nèi)積累的甘油可達4. 4mol/L，但甘油很少向外分泌，生產(chǎn)角度并無優(yōu)勢。其次，甘油發(fā)酵過程中的較高能耗也一直是發(fā)酵法甘油成本居高不下的原因之一，主要表現(xiàn)在發(fā)酵過程中的動力系統(tǒng)和冷熱系統(tǒng)使用，動力系統(tǒng)包括壓縮空氣和攪拌系統(tǒng)的使用，發(fā)酵時間越長，動力系統(tǒng)的能耗越大。冷熱系統(tǒng)包括蒸汽和冷卻水的使用，發(fā)酵培養(yǎng)溫度要求越低，所使用的冷卻水越多，生產(chǎn)成本越高。再次，與其他甘油生產(chǎn)方法相比，發(fā)酵法生產(chǎn)的甘油發(fā)酵液中含有膠體物質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖及單糖等物質(zhì)，使得減壓蒸餾過程中會出現(xiàn)嚴重結(jié)焦、變黑情況，成品甘油質(zhì)量不高。其提取工藝一般是將成熟發(fā)酵液通過板框壓濾后，進行適當(dāng)?shù)臐饪s得到粗甘油，進而減壓條件下進行蒸餾，脫色脫臭后得到成品甘油。此法得到的成品甘油質(zhì)量一般只能達到工業(yè)甘油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利文獻號CN101658M3，
公開日2010_3_3，記載了一種用于調(diào)控牛羊圍產(chǎn)期能量代謝障礙的微生物飼料添加劑，該技術(shù)通過將無機硒源加入到菌劑生產(chǎn)培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中硒濃度為2 10mg/kg，將克魯斯假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和嗜熱鏈球菌種子液按13 1 2接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液與適量的玉米粉混合， 35 40°C烘干即得。但是該現(xiàn)有技術(shù)具有以下特點(1)在200g/L初糖的基礎(chǔ)上發(fā)酵后得甘油含量為67. 26g/L-71. 75g/L，發(fā)酵轉(zhuǎn)化率為34% -36%，糖甘轉(zhuǎn)化率較低，( 發(fā)酵培養(yǎng)溫度為 33°C，時間為120h，培養(yǎng)時間略顯較長，發(fā)酵過程中的水電成本較高，( 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了 40g/L的NaCl，對提高甘油產(chǎn)量會有一定的幫助，但如需對甘油提純，則會嚴重影響甘油的提取收率，(4)此技術(shù)的最終產(chǎn)品并非成品甘油，發(fā)酵后甘油不需要提取，對甘油品質(zhì)無要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種基于克魯斯假絲酵母的甘油生產(chǎn)工藝，除提高發(fā)酵過程中甘油的轉(zhuǎn)化率及最終成品甘油的質(zhì)量外，還可做到生產(chǎn)過程中節(jié)約能源消耗、減少污染物的排放，從而做到節(jié)能、減排地生產(chǎn)安全性更高的高品質(zhì)甘油。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明涉及一種耐高溫的克魯斯假絲酵母菌株TS1008 (Candida krusei TS1008)，于2011年8月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No: M2011285。保藏地址為中國武漢大學(xué)430072。本發(fā)明涉及上述突變菌株的獲得方式，通過誘變與訓(xùn)育方法的結(jié)合，經(jīng)篩選得到。所述的誘變是指采用紫外燈照射進行誘變，具體步驟為將IOOmL種子培養(yǎng)基 /250mL三角瓶中，挑斜面培養(yǎng)基上保存的克魯斯假絲酵母菌1環(huán)，30-350C，90-120r/min培養(yǎng)16-20h，離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌數(shù)次，稀釋后備用，取4mL菌懸液，15-20W紫外燈功率，照射10-20s。所述的種子培養(yǎng)基的組分含量為葡萄糖30_45g/L，酵母10_16g/L，植物蛋白 12-22mL/L，余量為水，pH 4. 0-5. 5。所述的訓(xùn)育是指將誘變后的菌懸液接入含400_500g/L葡萄糖和70_90g/L滲透劑的篩選培養(yǎng)基中，黑紙包皿，350C -45°C恒溫培養(yǎng)46-52h，重復(fù)3次。所述的篩選培養(yǎng)基的組分含量為400-500g/L葡萄糖或70_90g/L滲透劑，麥芽汁 200-300mL，瓊月旨 15_20g/L，余量為水，pH 5. 0-6. 5。所述的篩選是指挑選大菌落搖瓶發(fā)酵，測定生物量、糖甘轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵時間以及殘?zhí)橇?，綜合篩選確定甘油高產(chǎn)突變菌株，用斜面培養(yǎng)基上進行菌種短期保藏。
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所述的斜面培養(yǎng)基的組分含量為麥芽汁200_300mL/L，瓊脂15_20g/L，余量為水；本發(fā)明涉及上述耐高溫克魯斯假絲酵母突變菌株的甘油生產(chǎn)應(yīng)用，通過將所述突變菌株好氧發(fā)酵得以實現(xiàn)。所述的好氧發(fā)酵是指通過培養(yǎng)突變菌株得到成熟發(fā)酵液后通過膜過濾系統(tǒng)逐級除去雜質(zhì)，再使用反滲透進行脫水濃縮，得到粗甘油，經(jīng)減壓蒸餾提取，脫味、脫色得到成品甘油。所述的培養(yǎng)是指將突變菌株接種于種子培養(yǎng)基中在35°C _45°C的環(huán)境下培養(yǎng) 16h得到種子液，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中好氧發(fā)酵50-80h，得到成熟發(fā)酵液。所述的接種是指接種量8% -15% (ν/ν)。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分含量為葡萄糖200_400g/L，酵母6_12g/L，植物蛋白 200-300mL/L，余量為水，pH 4. 0-5. 5。所述的好氧發(fā)酵是指在20%-40%糖液濃度，通風(fēng)比0. 5-l，35°C_45°C溫度下發(fā)酵 50-80h。所述的減壓蒸餾是指真空度為2mmHg-120mmHg的減壓蒸餾提取。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明所使用菌種為耐高溫克魯斯假絲酵母 (Candidakrusei TS1008)，為獨立開發(fā)菌種，該菌種具有耐高溫、耐高滲透，在低糖的情況下對甘油的同化作用不強等優(yōu)良特性。(2)發(fā)酵工藝35°C _45°C溫度下發(fā)酵培養(yǎng)，不易發(fā)生染菌，發(fā)酵時間降低為50-80h，同時發(fā)酵過程有效的節(jié)約了用電量和冷卻水用量。成熟發(fā)酵液中甘油含量達到10%-16%，糖甘轉(zhuǎn)化率為45%-65%，殘?zhí)墙禐?.2%以下，甘油基本無同化現(xiàn)象出現(xiàn)。(3)后提取工段膜過濾濃縮過程無廢水排放，降低了環(huán)境成本；濃縮溫度為室溫，無化學(xué)反應(yīng)，成熟發(fā)酵液殘?zhí)墙禐?.2%以下，減少了蒸餾結(jié)焦現(xiàn)象，對成品甘油品質(zhì)有保障。成品甘油的質(zhì)量符合美國和歐洲藥典級甘油標(biāo)準(zhǔn)(甘油含量不低于99.7%)， 較以往發(fā)酵法生產(chǎn)的甘油質(zhì)量更高。


圖1傳代次數(shù)對TS1008生產(chǎn)甘油發(fā)酵性能的影響示意圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1 耐高溫克魯斯假絲酵母的獲得高產(chǎn)甘油突變菌株的篩選(1)菌懸液制備與誘變處理100mL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶中，挑斜面菌1環(huán)， 30-35 V，90-120r/min培養(yǎng)16_20h，離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌數(shù)次，稀釋后備用。 取4mL菌懸液，15-20W紫外燈功率，照射10_20s。(2)初篩與復(fù)篩將誘變后的菌懸液接入含400_500g/L葡萄糖和70_90g/L滲透劑的篩選培養(yǎng)基中，黑紙包皿，35°C _45°C恒溫培養(yǎng)46-52h，重復(fù)3次。挑選大菌落搖瓶發(fā)酵，測定生物量、糖甘轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵時間以及殘?zhí)橇?，綜合篩選確定甘油高產(chǎn)突變菌株。(3)突變菌株的遺傳穩(wěn)定性對選擇出的突變株傳代10代，分別測定1、2、4、6、8、10代的糖甘轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵時間以及殘?zhí)橇浚源_定其遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果如圖1所示，Candida krusei TS1008的發(fā)酵性能
遺傳穩(wěn)定?？疾斐霭l(fā)菌株與突變菌株的生產(chǎn)甘油的發(fā)酵性能(糖甘轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵時間及殘?zhí)橇?。結(jié)果如表1所示，突變株的產(chǎn)甘油能力要強于出發(fā)菌株，糖甘轉(zhuǎn)化率提高了 25%，且發(fā)酵時間大大降低，殘?zhí)橇恳步禐樾∮?. 5%。表1出發(fā)菌株與突變菌株發(fā)酵甘油性能比較
權(quán)利要求
1.一種克魯斯假絲酵母菌株TS1008 (Candida krusei TS1008)，其特征在于，于2011 年8月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No :M2011285。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐高溫克魯斯假絲酵母菌株的制備方法，其特征在于， 通過誘變與訓(xùn)育方法的結(jié)合，經(jīng)篩選得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的誘變是指采用紫外燈照射進行誘變。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征是，所述的誘變?yōu)閷OOmL種子培養(yǎng)基/250mL三角瓶中，挑斜面培養(yǎng)基上保存的克魯斯假絲酵母菌1環(huán)，30-350C，90-120r/min 培養(yǎng)16-20h，離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌數(shù)次，稀釋后備用，取4mL菌懸液，15-20W紫外燈功率，照射10-20s。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述的訓(xùn)育是指將誘變后的菌懸液接入含400-500g/L葡萄糖和70-90g/L滲透劑的篩選培養(yǎng)基中，黑紙包皿，35°C _45°C恒溫培養(yǎng)46-52h，重復(fù)3次。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，所述的篩選培養(yǎng)基的組分含量為 400-500g/L葡萄糖或70-90g/L滲透劑，麥芽汁200_300mL，瓊脂15_20g/L，余量為水，pH 5. 0-6. 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，所述的種子培養(yǎng)基的組分含量為葡萄糖 30-45g/L，酵母 10-16g/L，植物蛋白 12_22mL/L，余量為水，pH 4. 0-5. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征是，所述的篩選培養(yǎng)基的組分含量為 400-500g/L葡萄糖或70-90g/L滲透劑，麥芽汁200_300mL，瓊脂15_20g/L，余量為水，pH 5. 0-6. 5。
9.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的制備方法，其特征是，所述的斜面培養(yǎng)基的組分含量為 麥芽汁200-300mL/L，瓊脂15_20g/L，余量為水。
10.一種根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述耐高溫克魯斯假絲酵母突變菌株的應(yīng)用，其特征在于，將該突變菌株用于甘油生產(chǎn)，通過將所述突變菌株好氧發(fā)酵得以實現(xiàn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征是，所述的好氧發(fā)酵是指通過培養(yǎng)突變菌株得到成熟發(fā)酵液后通過膜過濾系統(tǒng)逐級除去雜質(zhì)，再使用反滲透進行脫水濃縮，得到粗甘油，經(jīng)減壓蒸餾提取，脫味、脫色得到成品甘油。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征是，所述的培養(yǎng)是指將突變菌株接種于種子培養(yǎng)基中在35°C _45°C的環(huán)境下培養(yǎng)16h得到種子液，然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中好氧發(fā)酵 50-80h，得到成熟發(fā)酵液。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征是，所述的接種是指接種量8%-15%(ν/ν) O
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征是，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分含量為葡萄糖 200-400g/L，酵母 6-12g/L，植物蛋白 200_300mL/L，余量為水，pH 4.0-5.5。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其特征是，所述的好氧發(fā)酵是指在20%-40%糖液濃度，通風(fēng)比0. 5-1, 350C _45°C溫度下發(fā)酵50_80h。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的應(yīng)用，其特征是，所述的減壓蒸餾是指真空度為 2mmHg-120mmHg的減壓蒸餾提取。
全文摘要
一種微生物甘油生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域的基于克魯斯假絲酵母的甘油生產(chǎn)工藝，該克魯斯假絲酵母菌株TS1008(Candida krusei TS1008)于2011年8月10日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC No.M2011285；本發(fā)明除提高發(fā)酵過程中甘油的轉(zhuǎn)化率及最終成品甘油的質(zhì)量外，還可做到生產(chǎn)過程中節(jié)約能源消耗、減少污染物的排放，從而做到節(jié)能、減排地生產(chǎn)安全性更高的高品質(zhì)甘油。
文檔編號C12N13/00GK102277307SQ20111025567
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者史其峰, 姜耀明 申請人:上海天源植物制品有限公司