熱帶假絲酵母在利用不飽和油脂產(chǎn)十二碳二元酸的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及熱帶假絲酵母在利用不飽和油脂產(chǎn)十二碳二元酸的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]長(zhǎng)鏈二元酸是指碳鏈中含有7個(gè)以上碳原子的脂肪族二羧酸，它們是一類有著重要和廣泛工業(yè)用途的精細(xì)化工產(chǎn)品，是化學(xué)工業(yè)中合成高級(jí)香料、高性能尼龍工程塑料、高檔尼龍熱熔膠、高溫電介質(zhì)、高級(jí)油漆和涂料、高級(jí)潤(rùn)滑油、耐寒性增塑劑、樹脂、醫(yī)藥和農(nóng)藥等的重要原料。
[0003]長(zhǎng)鏈二元酸在早期主要依賴于化學(xué)法進(jìn)行生產(chǎn)，但由于制備過(guò)程中存在高污染、高耗能等缺點(diǎn)，并且對(duì)生產(chǎn)設(shè)備有較高的要求，因此目前主要依賴微生物發(fā)酵法獲取長(zhǎng)鏈二元酸。微生物發(fā)酵法主要依賴于微生物特有的氧化能力及其胞內(nèi)酶的作用，通過(guò)α及ω氧化的方法，在常溫常壓下將烷烴或一元羧酸轉(zhuǎn)化為二元羧酸的技術(shù)。該技術(shù)自20世紀(jì)60年代興起，隨后日本、美國(guó)和德國(guó)等國(guó)家開始由相關(guān)技術(shù)的基礎(chǔ)理論研究轉(zhuǎn)入應(yīng)用開發(fā)研究，主要涉及十二碳二元酸(DC12)、十三碳二元酸(DC13)、十四碳二元酸(DC14)和十六碳二元酸(DC16)的生產(chǎn)。
[0004]我國(guó)對(duì)長(zhǎng)鏈二元酸的研究開發(fā)和利用工作是從70年代后期開始的，由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所、清華大學(xué)、中國(guó)石油化工股份有限公司及上海凱賽生物技術(shù)有限公司等研究機(jī)構(gòu)和公司完成了利用單一或混合烷烴發(fā)酵獲取C1。?C 18長(zhǎng)鏈二元酸或長(zhǎng)鏈混合二元酸產(chǎn)品的開發(fā)研究，涉及中國(guó)專利CN200410018255、CN20061003833U CN200710195842、CN200910256590、CN200910256589、CN200910256587、CN200910256586、CN201010160310 和CN201210439799，其中十五碳二元酸(DC15)、十二碳二元酸(DC12)、十三碳二元酸(DC13)和十四碳二元酸(DC14)已進(jìn)入中試和20?50t罐規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)試驗(yàn)及鑒定階段。
[0005]上述方法生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸特別是十二碳二元酸的原料均為烷烴，而原油儲(chǔ)量的下降，長(zhǎng)鏈二元酸生產(chǎn)所需石化原料資源的緊缺，導(dǎo)致了二元酸生產(chǎn)成本的增加，因此尋找新的可持續(xù)的替代物已刻不容緩，而目前尚未有利用微生物催化長(zhǎng)鏈不飽和油脂生產(chǎn)十二碳二元酸的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種熱帶假絲酵母在利用不飽和油脂產(chǎn)十二碳二元酸的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0008]熱帶假絲酵母在利用不飽和油脂生產(chǎn)十二碳二元酸中的應(yīng)用，所述熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)為CICC 1798。
[0009]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述不飽和油脂中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的質(zhì)量百分含量合計(jì)為50%以上，所述飽和脂肪酸為硬脂酸(十八烷酸)、軟脂酸(十六烷酸)和/或肉豆蔻酸(十四烷酸)，不飽和脂肪酸為油酸(順式-9-十八碳烯酸)、亞油酸(順，順_9，12-十八碳二烯酸)和/或亞麻酸(全順式9、12、15十八碳三烯酸)。
[0010]能滿足上述不飽和油脂要求的原料可來(lái)源于花生油、大豆油、玉米油、橄欖油、菜籽油等油料作物榨取的植物油，以及包含地溝油、餐余油在內(nèi)的回收油脂。
[0011]上述應(yīng)用，步驟如下:
[0012](I)將熱帶假絲酵母種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度25?35°C、通風(fēng)比1:0.3?0.7vvm、罐壓0.08?0.12Mpa的條件下，流加葡萄糖溶液，使葡萄糖質(zhì)量濃度為5.5?6.5%，控制發(fā)酵液ρΗ4.0?6.0，發(fā)酵20?28h ;然后，流加不飽和油脂，使油脂質(zhì)量濃度為8?12%，控制發(fā)酵液pH6.5?8.5，發(fā)酵100?150h，制得發(fā)酵液；
[0013](2)將步驟(I)制得的發(fā)酵液經(jīng)提純，制得十二碳二元酸。
[0014]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的熱帶假絲酵母種子液，制備步驟如下:
[0015]將熱帶假絲酵母接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度28?30°C、轉(zhuǎn)速200?250轉(zhuǎn)/分的條件下，搖床培養(yǎng)10?15小時(shí)，制得熱帶假絲酵母種子液；
[0016]所述種子培養(yǎng)基組分如下:
[0017]酵母浸粉5?10g/L、蛋白胨10?20g/L、葡糖糖20?30g/L，水配制，pH自然。
[0018]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的發(fā)酵培養(yǎng)基，組分如下:
[0019]葡萄糖40 ?60g/L、(NH4)2SO4 0.5 ?lg/L、玉米楽 I ?2g/L、酵母膏 I ?2g/L、VBi
0.1 ?0.2g/L、NaCl I ?2g/L、KH2PO4 4 ?8g/L、Na2HPO4.12H20 5 ?10.08g/L、尿素 2 ?3g/L、Mg2SO4.7H20 5 ?6.15g/L、乳化劑 0.02 ?0.5g/L、消泡劑 3g/L，水配制，pH 6.0 ?7.0。
[0020]進(jìn)一步優(yōu)選的，所述的乳化劑為吐溫60，消泡劑為泡敵。
[0021]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(I)中的接種量為3?10%。
[0022]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的提純，步驟如下:
[0023]調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至10?12，加熱至85?95°C，高溫處理10?60min，經(jīng)離心除菌體，降溫，調(diào)節(jié)pH至2.5?3.0，然后加熱至85?95°C保持10?60min，然后降至室溫，離心，取沉淀，制得十二碳二元酸。
[0024]有益效果
[0025]1、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)CICC 1798發(fā)酵時(shí)可以將油脂中長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸成分(十八碳不飽和脂肪酸)中的不飽和雙鍵進(jìn)行斷裂加成獲得十二碳二元酸，從而突破了石化產(chǎn)品作為原料生產(chǎn)長(zhǎng)鏈二元酸的限制，提供了一種合成十二碳二元酸的新途徑；
[0026]2、本發(fā)明采用微生物法生產(chǎn)十二碳二元酸，后續(xù)提純工藝簡(jiǎn)單易實(shí)現(xiàn)，且原材料成本低，為大幅度降低十二碳二元酸的生產(chǎn)成本奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為HPLC分析玉米油發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)果圖；
[0028]圖中:(a)癸二酸和十八碳二元酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖、(b)玉米油發(fā)酵產(chǎn)二元酸液相色譜圖；
[0029]圖2為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析玉米油發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，以使本發(fā)明的特性更清楚，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于本文中列出的實(shí)施例。
[0031]生物材料來(lái)源
[0032]實(shí)施例中所述熱帶假絲酵母購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號(hào)為CICC1798o
[0033]玉米油購(gòu)自山東西王食品有限公司，經(jīng)檢測(cè)，成分為亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸。飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的質(zhì)量百分含量分別為15%和84.9%，油酸購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。
[0034]實(shí)施例1、催化油脂成分中不飽和脂肪酸不飽和鍵斷裂菌種的篩選
[0035]對(duì)購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的清酒假絲酵母CICC 33015、解脂假絲酵母CICC 1457、熱帶假絲酵母CICC 1798及保藏于齊魯工業(yè)大學(xué)酶工程研究所的二元酸高產(chǎn)酵母Candida tropicalis IEE001進(jìn)行活化后，分別接種至篩選培養(yǎng)基中，其中培養(yǎng)基成分為酵母浸粉10g/L、蛋白胨20g/L、葡糖糖20g/L、花生油50ml/L，自來(lái)水配置，自然pH，115°C滅菌30分鐘。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液調(diào)節(jié)pH至12后加熱至90°C，處理30min。趁熱于7000轉(zhuǎn)/分離心5min除菌體。調(diào)節(jié)上述步驟的上清pH值至2.95左右，再次加熱至90°C保持30min ;緩慢降溫至室溫。于7000轉(zhuǎn)/分下離心5min獲得二元酸樣品并采用液相色譜法進(jìn)行分析，高效液相色譜法條件:色譜柱Waters C18、流動(dòng)相(甲醇:乙腈:水)=80:5:15、流速1.0ml/min、柱溫30°C、檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
[0036]結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis)CICC1798在發(fā)酵花生油時(shí)能夠產(chǎn)生碳鏈長(zhǎng)度在10碳左右的二元酸(圖1)。
[0037]實(shí)施例2、在500mL搖瓶中發(fā)酵玉米油生產(chǎn)十二碳二元酸
[0038]熱帶假絲酵母在利用不飽和油脂生產(chǎn)十二碳二元酸中的應(yīng)用，步驟如下:
[0039](I)將5mL熱帶假絲酵母種子液接種于10mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速210r/min的條件下，每12h補(bǔ)加一次葡萄糖溶液，使葡萄糖濃度為6.2%，同時(shí)調(diào)節(jié)一次pH控制發(fā)酵液PH6.0，發(fā)酵24h ;然后，每12h補(bǔ)加一次玉米油，使油脂質(zhì)量濃度為10%，控制發(fā)酵液pH7.5，發(fā)酵120h，制得發(fā)酵液；
[0040]所述步驟(I)中的發(fā)酵培養(yǎng)基，組分如下:
[0041]葡萄糖50g/L、(NH4)2SO4 lg/L、玉米楽 lg/L、酵母膏 2g/L、VB1 0.lg/L、NaCl 2g/UKH2PO4 6g/L、Na2HPO4.12H20 10.08g/L、尿素 3g/L、Mg2SO4.7H20 6g/L、乳化劑 0.02g/L、消泡劑3g/L，水配制，pH 6.2。
[0042](2)調(diào)節(jié)步驟(I)制得的發(fā)酵液pH至12，加熱至90°C，高溫處理30min，經(jīng)7000轉(zhuǎn)/分離心5min除菌體，降溫，調(diào)節(jié)pH至2.95，然后加熱至90°C保持30min，然后降至室溫，7000轉(zhuǎn)/分下離