專利名稱：一種檢測污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的引物序列及方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及一種檢測污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的引物序列及方法。
背景技術：
抗生素是20世紀最重要的醫(yī)學發(fā)現(xiàn)之一，長期以來，抗生素在醫(yī)療領域的廣泛應用，對控制人類感染性疾病發(fā)揮了巨大的作用。同時，由于獸藥抗生素能夠預防動物疾病和一定程度上促進生長的雙重功效，因此，常以亞治療劑量長期添加于動物飼料中，出現(xiàn)在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中。由于抗生素在畜牧業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)中的長期濫用，在養(yǎng)殖動物腸道內誘導出抗性菌株，這些編碼抗生素抗性基因的菌株是環(huán)境中抗生素抗性基因最重要的來源，攜帶抗性基因的抗性細菌如果在全球傳播，可能導致大范圍的對環(huán)境生物、人類健康和社會經濟的潛在不利影響。環(huán)境中的抗生素抗性基因的污染越來越被人們視為一種生態(tài)性問題。相關研究表明，污水處理廠因為進水中包含重金屬、抗生素、洗滌劑、季銨鹽等物質，這些物質也可以協(xié)同或交叉引起微生物抗藥性，且污水處理廠微生物分布密集，極易誘導微生物產生抗性基因；而污水處理廠出水被認為是受納水體中抗生素抗性基因的主要來源。并且也有相關研究指出，污水處理廠污泥中可以檢出多種四環(huán)素類抗性基因，抗性基因不僅種類豐富，相對含量也較高。近些年來，我國污水處理工作也在高速發(fā)展中，污水處理廠在解決我國水污染問題方面起到了巨大的作用，然而，污水處理廠的高速發(fā)展，產生的污泥問題也日益突出，因此對于污泥中抗性基因進行精確定量意義重大。近年來有許多關于微生物對四環(huán)素和其他類抗生素表型抗性的研究，然而目前研究所采用的方法只能研究可培養(yǎng)微生物的抗性，而對不可培養(yǎng)微生物的抗性及微生物體內導致這些抗性的特定基因無法檢測。因此近年來越來越多的研究采用實時熒光定量PCR(Real-time quantitive PCR)技術作為研究手段，從數(shù)量上更為直觀地探討環(huán)境中抗性基因的變化，而且由于這種方法不依賴于微生物培養(yǎng)，因此也能檢測不可培養(yǎng)微生物所攜帶的抗性基因，使最終得到的量化結果更為全面和可信。目前國外對環(huán)境中四環(huán)素抗性基因的定量研究主要集中于水環(huán)境，國內關于環(huán)境中抗生素抗性基因的研究才剛剛起步，而污水處理廠經常被認為是抗性基因的重要儲存庫，因此對于污泥中四環(huán)素類抗藥基因為精確定量是十分必要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種檢測污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的引物序列及方法，能對城市污水處理廠污泥中四環(huán)素類抗藥基因tetG進行快速精確定量。一種檢測污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的引物序列，包括正向引物和反向引物，其堿基序列為
正向引物TTATCGCCGCCGCCCTTCT；反向引物TCATCCAGCCGTAACAGAAC。本發(fā)明還提供了一種利用所述的引物序列檢測污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的方法，包括(I)提取待測污泥樣品中的DNA，以提取的DNA為模板，用所述的正向引物和反向引物進行定量PCR擴增并記錄達到熒光閾值時的循環(huán)數(shù)；(2)將步驟(I)中得到的循環(huán)數(shù)參照定量PCR測定目的基因tetG質粒標準品的標
準曲線，得到待測污泥樣品中四環(huán)素類抗性基因tetG的含量。所述定量PCR的反應體系為2ul DNA溶液，7.5ul SYBR Premix ExTaq溶液，0. 3ulROX Reference溶液，0. 3ul濃度為IOmM的正向引物，0. 3ul濃度為IOmM的反向引物，4. 6ulddH20。步驟(2)中所述標準曲線的標準品的制備方法為利用所述的正向引物和反向引物做普通PCR擴增；擴增序列用商業(yè)化凝膠回收試劑盒純化；純化后測量DNA含量、純度并調節(jié)至合適濃度；接入載體并轉化入感受態(tài)細胞；將感受態(tài)細胞涂于含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12_16h，通過藍白斑篩選挑取白色重組菌斑，挑選白色陽性克隆子用LB培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)；待菌液混濁后，取Iml菌液送公司測序插入的基因片斷，其余3-4ml菌液用來提取質粒；使用微量核酸蛋白質分析儀檢測提取質粒的含量及純度，確保質粒DNA的A260/A280比值在I. 8左右，符合要求的質粒作為標準品繪制標準曲線。所述DNA的提取方法為用FastDNA Spin Kit for soil試劑盒提取。采用該方法提取DNA具有以下優(yōu)點(I)節(jié)約時間，只需要2個小時即可提取到樣品的DNA，與傳統(tǒng)的有機溶劑抽提法相比可以減少預處理的時間；(2)DNA提取效率穩(wěn)定，且不易發(fā)生DNA降解，提取結果具有很好的重復性；(3)避免使用三氯甲烷等有機溶劑，保障實驗操作人員的工作環(huán)境。本發(fā)明的有益效果(I)本發(fā)明的方法不依賴于微生物培養(yǎng),與傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法相比,也能檢測不可培養(yǎng)微生物所攜帶的抗性基因，使最終得到的量化結果更為全面和可信，并且用FastDNASpin Kit for Soil試劑盒提取的DNA樣品可以保存半年甚至多年，有利于將不同季節(jié)、不同地區(qū)污泥樣品進行對比分析；(2)通過普通PCR反應，可以確定污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的存在與否；通過實時熒光定量PCR反應，可以確定污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG含量，為污泥處置提供技術指導；(3)優(yōu)化了定量PCR實驗的反應液體系，對于反應孔壁上殘留液，通過多次混勻離心以及添加ROX校準染料克服移液誤差，將反應體系減少為15ul，而一般實驗需要20ul甚至更多的反應液才能得出準確的數(shù)據(jù)，大大節(jié)約了檢測成本，使得高通量檢測成為可能。


圖I是本發(fā)明引物序列對四環(huán)素類抗藥基因tetG的PCR擴增結果圖。其中M為maker ; C為陰性對照；I、2、3為3個污泥樣品。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀了本發(fā)明的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請權利要求書所限定的范圍。FastDNA Spin Kit for Soil 試劑盒提取 DNA 的步驟如下I)將0. Ig凍干污泥樣品放入Lysing Matrix E管中，加入978ul SodiumPhosphate緩沖液和122ul MT緩沖液，震蕩混勻；2)將Lysing Matrix E管于14000g的離心力下離心IOmin,然后把上清液轉移到
2.Oml的離心管中，加入250ul PPS ;并上下顛倒10次；3)將2ml離心管于14000g的離心力下離心5min，將上清液轉移至IOml的離心管 中，并且重新懸浮Binding Matrix沉淀物,并取Iml加入到IOml離心管中。4)靜置3min后，去除500ul上清液，并重新懸浮沉淀物，然后轉移600ul懸濁物到SPIN Fliter中，于14000g的離心力下離心lmin，然后將上層離心管置于新的2ml離心管中，繼續(xù)加入懸濁液，重復離心操作。5)SPIN Fliter置于新的2ml離心管中，加入500ul SEWS-M，用槍頭重新懸濁SPIN Fliter內顆粒，然后于14000g的離心力下離心Imin ；6)再次將SPIN Fliter置于新的2ml離心管中，不加入任何溶液，然后于14000g的離心力下離心2min，離心后將SPIN Fliter置于室溫下5min ；7)將SPIN Fliter置于新的I. 5ml離心管中，加入IOOul的DES溶液，靜置I分鐘，然后于14000g的離心力下離心I分鐘，收集下層離心管中的溶液即為提取并純化完成的 DNA。實施例I引物的設計(I)從 http: //www. ncbi. nlm. nih. rov/ 網(wǎng)點的 genbank 中下載四環(huán)素類抗性基因 tetG 基因序列(accession no. FJ411061. I、FJ411063. I、FJ411065. I、FJ411068. 1FJ411072. UFJ411074. UFJ411076. UFJ416863. U FJ950705. UGQ229171. I、GQ229173. UGQ229175. UGQ229177. UGQ229179. UGQ229181. UGQ229183. I、⑶324768. I、HQ399656. UHQ333262. I)；(2)將⑴得到的引物序列導入MEGA5. 0，使用alignment進行序列比對，去除差異性較高的片段，找到不同Accession No.的四環(huán)素類抗性基因tetG保守區(qū)；(3)將(2)得到的保守區(qū)序列輸入到Primer Premier 5. 0，設計出滿足定量PCR要求的引物，由于定量PCR要求擴增產物片段長度為75-200bp，經過篩選，確定一對擴增產物片段長度為 133bp 的引物，即正向引物 tetGF :5' -TTATCGCCGCCGCCCTTCT-3' (SEQ IDNO 1);反向引物 tetGR :5' -TCATCCAGCCGTAACAGAAC-5' (SEQ ID NO :2)。(4)引物特異性的驗證軟件驗證采用NCBI的引物設計和特異性檢驗工具Primer-BLAST驗證引物的特異性，顯示引物特異性很好；實驗驗證驗證結果見實施例2和實施例4。實施例2定性檢測
(I)用FastDNA Spin Kit forsoil試劑盒提取污泥中的DNA,使用實施例I中的引物序列進行普通PCR擴增，PCR產物與1/6體積6X loadingbuffer dye混勻，使用經EB染色的I. 5%的瓊脂糖凝膠，IOObp marker，在100-1IOV電壓下電泳35分鐘，檢測PCR產物，結果如圖I所示，結果顯示有PCR產物存在。 (2) PCR擴增得到的序列以BioSpin膠回收試劑盒純化后，測量DNA含量、純度并調節(jié)至合適濃度(即vector DNA和insert DNA摩爾比為I : 2 10)后，接入pMD19_T載體并轉化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中。(3)將感受態(tài)細胞涂于含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12-16h，通過藍白斑篩選挑取白色重組菌斑，挑選陽性克隆子用LB培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)，待菌液混濁后，取ImL菌液送上?；瞪锛夹g有限公司測序插入的基因片斷，剩余的2-4ml用于提取質粒制備標準品。
測序得到4個DNA序列，序列片段大小均為133bp，其堿基序列分別如SEQ ID NO
3、SEQ ID NO 4, SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6 所示。(4)測序結果通過 NCBI 網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的 BLAST進行序列同源性檢索比對。測序序列對核酸庫的比對，直接比較核酸序列的同源性，同源性良好，證明本發(fā)明設計的引物特異性高。實施例3標準品的準備(I)實施例2中LB培養(yǎng)液擴大培養(yǎng)后的混濁菌液，Iml送去測序，其余的2_4ml菌液使用QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN)提取質粒,使用微量核酸蛋白質分析儀檢測提取質粒的含量及純度，確保質粒DNA的A260/A280比值在I. 8左右，作為標準品。(2)計算出質?？截悢?shù)，質?？截悢?shù)的計算公式為拷貝數(shù)=(質量+分子量)X6. 02X IO230(3)計算得到四環(huán)素類抗性基因tetG的拷貝數(shù)，按10倍為稀釋梯度稀釋為標準曲線，并且使質粒拷貝數(shù)保持在IO8-IO3之間。(4)標準曲線的反應體系為2ul DNA溶液(標準品)，7.5ul SYBRPremix ExTaq 溶液，0.3ul ROX Reference 溶液,0. 3ul IOmM 正向引物,0. 3ul IOmM 反向引物,4. 6ulddH20。每一次定量PCR反應都需要加入標準品進行實驗，標準曲線中橫坐標為四環(huán)素類抗性基因tetG質?？截悢?shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。實施例4定量檢測用實施例I中設計的引物序列進行實時熒光定量PCR檢測待測污泥中四環(huán)素類抗藥基因tetG含量(I)采集城市生活污水處理廠剩余污泥，使用冷凍干燥機凍干后作為待測樣品；(2)取待測樣品0. lg，用FastDNA Spin Kit for Soil按照標準步驟提取DNA，調節(jié)濃度至10ng/ul并保存待測；(3)配制定量PCR反應的反應液體系7. 5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0. 3ul ROXReference溶液,0. 3ul的IOmM濃度的正反引物對,4. 6uIddH2O0每個樣品做三次重復，使用10ul、50ul量程的排槍操作，降低移液槍槍頭殘留溶液的影響；(4)將反應液體系轉移至96孔反應板的反應孔中，將步驟⑴中提取的DNA取2ul,及2ul實施例2中的標準品加入對應的反應孔中通過StepOne Software v2. 0點擊開始實驗。反應條件為95°C下熱變性5分鐘，然后進入40個循環(huán)的擴增階段，95°C變性3秒,55°C擴增30秒,72°C延伸30秒,延伸的同時掃描突光信號,根據(jù)每一輪擴增掃描到的信號強弱對比標準品的信號強弱得出樣品中四環(huán)素類抗藥基因tetG的濃度。 實驗結束后系統(tǒng)即自動生成標準曲線和待測樣品的濃度，三個重復實驗結果拷貝數(shù)分別為 9. 17X106copies/ul、9. 83X 106copies/ul 1、9. 38X 106copies/ul，說明待測污泥樣品中含有四環(huán)素類抗藥基因tetG，證明利用實施例I中設計的引物序列進行定量PCR能有效檢測待測污泥樣品中的四環(huán)素類抗藥基因tetG的含量。
權利要求
1.ー種檢測污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的引物序列，其特征在于，包括正向引物和反向引物，其堿基序列為 正向引物TTATCGCCGCCGCCCTTCT ； 反向引物TCATCCAGCCGTAACAGAAC。
2.ー種利用權利要求I所述的引物序列檢測污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的方法，其特征在于，包括 (1)提取待測污泥樣品中的DNA，以提取的DNA為模板，用權利要求I所述的正向引物和反向引物進行定量PCR擴增并記錄達到熒光閾值時的循環(huán)數(shù)； (2)將步驟⑴中得到的循環(huán)數(shù)參照定量PCR測定目的基因tetG質粒標準品的標準曲線，得到待測污泥樣品中四環(huán)素類抗性基因tetG的含量。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述定量PCR的反應體系為2ulDNA溶液，7.5ul SYBR Premix Ex Taq 溶液，0.3ul ROXReference 溶液，O. 3ul 濃度為 IOmM 的正向引物，O. 3ul濃度為IOmM的反向引物，4. 6ul ddH20。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的引物序列及方法，引物序列包括正向引物和反向引物，其堿基序列為正向引物TTATCGCCGCCGCCCTTCT；反向引物TCATCCAGCCGTAACAGAAC。檢測污泥中四環(huán)素類抗性基因tetG的方法包括(1)提取待測污泥樣品中的DNA，以提取的DNA為模板，用所述的正向引物和反向引物進行定量PCR擴增并記錄達到熒光閾值時的循環(huán)數(shù)；(2)將步驟(1)中得到的循環(huán)數(shù)參照定量PCR測定目的基因tetG質粒標準品的標準曲線，得到待測污泥樣品中四環(huán)素類抗性基因tetG的含量。本發(fā)明的引物序列和方法實現(xiàn)了污泥樣品中四環(huán)素類抗性基因tetG的快速精確定量檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102732627SQ20121021098
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權日2012年6月20日
發(fā)明者張明美, 陳紅 申請人:浙江大學