專(zhuān)利名稱(chēng)：多肽和其編碼多核苷酸及它們?cè)谥委熑毖嚓P(guān)醫(yī)學(xué)病癥中的應(yīng)用的制作方法
多狀和其編碼多楊音酸及它們?cè)谥委熑毖嚓P(guān)醫(yī)學(xué)病癥中的應(yīng)用本申請(qǐng)為分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日為2007年7月31日，申請(qǐng)?zhí)枮?00780035863. 0 (PCT/IL2007/000959)，發(fā)明名稱(chēng)為“多肽和其編碼多核苷酸及它們?cè)谥委?br> 缺血相關(guān)醫(yī)學(xué)病癥中的應(yīng)用”。發(fā)明領(lǐng)域及背景本發(fā)明涉及多肽和其編碼多核苷酸及它們?cè)谥委熑毖嚓P(guān)醫(yī)學(xué)病癥中的應(yīng)用。血管生成是從之前存在血管上芽生新的血管。它可在多種生理?xiàng)l件下發(fā)生，例如女性生殖周期，以及包括腫瘤、組織缺血和傷口愈合的病理學(xué)條件。 缺血性心臟病是很多工業(yè)化國(guó)家中死亡率的主要原因，僅在美國(guó)每年引起超過(guò)500000例的死亡。當(dāng)前的治療選擇包括藥物治療、冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)以及更具侵入性的冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)(CABG)。但是，在所有這些案例中，技術(shù)性問(wèn)題包括所涉及動(dòng)脈的大小、缺少恰當(dāng)?shù)哪┥颐}管系統(tǒng)、導(dǎo)致阻塞的動(dòng)脈損傷的復(fù)雜性以及患者的一般臨床病癥經(jīng)常阻止缺血組織的血管再形成。近來(lái)研發(fā)出一種侵入性較小的方法一治療性血管生成。該術(shù)語(yǔ)指弓IA旨在促進(jìn)缺血組織新血管形成的促血管新生因子，從而減輕缺血。已有兩個(gè)主要方法用于治療性血管生成領(lǐng)域；第一個(gè)是以裸露DNA形式或用病毒載體傳遞多種細(xì)胞因子的血管生成基因療法，最常用的是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。另一最新方法是用完全分化的細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞治療。兩種方法均在動(dòng)物模型和初期臨床試驗(yàn)中顯示成功。但是，在治療性血管生成成為缺血病患者的真正臨床選擇之前仍然存在很多障礙需要克服。對(duì)于血管生成基因療法，這些障礙包括轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組織特異性需求、傳遞載體的選擇、劑量和時(shí)間的優(yōu)化、給藥途徑的優(yōu)化以及不良事件例如水腫和發(fā)生腫瘤的可能性。血管生成基因療法成功的另一個(gè)限制是新形成血管不夠成熟以及它們之后的退化，從而阻止顯著而持久的治療效果。這有可能是因?yàn)樗f送的血管生成基因僅在相對(duì)較短的時(shí)間段內(nèi)表達(dá)使得無(wú)法發(fā)生血管成熟和平滑肌細(xì)胞募集，或者因?yàn)檠艹墒煨枰喾N血管生成因子才能發(fā)生。可能的解決辦法是使用能同時(shí)激活多種血管生成因子的上游血管生成調(diào)節(jié)劑，從而與生理學(xué)血管生成更加相似。這一因子是低氧誘導(dǎo)因子I (HIF-I)。低氧誘導(dǎo)因子(HIF-I)是一種轉(zhuǎn)錄因子，是缺氧響應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑，在低氧狀態(tài)下可活化多于40個(gè)基因。它是由兩個(gè)亞單位組成的雜二聚體轉(zhuǎn)錄因子；亞單位a受到氧水平的嚴(yán)密調(diào)節(jié)并在低氧時(shí)被誘導(dǎo)，而亞單位3不論氧張力如何可組成型表達(dá)。HIF-I a包含兩個(gè)轉(zhuǎn)活結(jié)構(gòu)域(N-TAD和C-TAD)和一個(gè)氧-依賴(lài)型降解結(jié)構(gòu)域(ODDD)。在常氧條件下蛋白質(zhì)von-Hippel-Lindau (VHL)與HIF-1 a的ODDD相互作用并作為E3-泛素連接酶復(fù)合物的一部分，因此將HIF-I a送至蛋白體降解。在低氧下，HIF-I a與HIF-I P 二聚體化并活化其核內(nèi)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。
最近已顯示VHL與HIF-I a的相互作用由HIF_1 a蛋白內(nèi)的兩個(gè)特異殘基的脯氨酸輕基化作用促成(Epstein, A. C.等,2001, Cell 107,43-54. Masson, N 等,2001, Embo J20,5197-206)。已發(fā)現(xiàn)有三種脯氨酰羥基化酶(PHD 1-3)可在常氧下羥基化HIF-I a。PHD I和2在殘基402和564處羥基化而PHD 3僅在殘基564處羥基化。HIF-Ia 的第二種調(diào)控機(jī)制發(fā)現(xiàn)于 2002 年(Lando，D 等，2002，Science 295，858-61)并包括殘基803處HIF-I a的天冬酰胺酰羥基化作用，由天冬酰胺酰羥化酶催化，也稱(chēng)作因子抑制HIF-I (FIH-I)。這一羥基化作用阻止HIF-I a與輔因子p300的相互作用，因此妨礙了 HIF-I a的轉(zhuǎn)錄活性。因此，在常氧下有兩種機(jī)制與HIF-I a活性的降低有關(guān)，一種通過(guò)脯氨?；u基 化作用影響其穩(wěn)定性，另一種通過(guò)天冬酰胺?；u基化作用影響其轉(zhuǎn)錄活化。這些脯氨?；吞於０孵；u化酶均為雙加氧酶，它們?yōu)?-酮戊二酸并且不依賴(lài)鐵離子，它們對(duì)細(xì)胞氧的需求可提供它們作為氧傳感器活性的基礎(chǔ)。已驗(yàn)證殘基402和564處兩個(gè)特異位點(diǎn)的突變可破壞HIF_1 a和VHL之間的相互作用，因此使得HIF-I a組成型穩(wěn)定(Masson等，2001，Embo J 20，5197-206)。所得突變體HIF-Ia與驅(qū)動(dòng)HRE-熒光素酶構(gòu)建體表達(dá)中的低氧處理具有相同的活性。殘基564和803的兩處突變顯示可給予HIF-I a完整的轉(zhuǎn)錄活性，與經(jīng)低氧模擬鐵螯合劑2，2'-聯(lián)吡啶處理所得活性相似(Lando 等，2002，Science 295，858-61)。在角蛋白14啟動(dòng)子的調(diào)控下過(guò)表達(dá)缺失殘基401-602的突變體hHIF_l a的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示出皮膚血管化作用增強(qiáng)(Elson, D. A.等，2001，Genes Dev 15，2520-32)。這些小鼠顯示出Glut-I和VEGF的mRNA上調(diào)，它們是HIF-I a的已知靶點(diǎn)。與VEGF過(guò)表達(dá)小鼠比較，這些小鼠血管的易漏性低并且顯示出更大的成熟度。這可由HIF-I a誘導(dǎo)多個(gè)血管生成因子(即促紅細(xì)胞生成素)的活化這一事實(shí)解釋?zhuān)c生理性血管生成反應(yīng)相似，與單獨(dú)VEGF的作用相反。此外，HIF-I a誘導(dǎo)VEGF許多異構(gòu)形式和其它基因的活化，又一次與生理反應(yīng)更相似，這通過(guò)給予單一的異構(gòu)形式無(wú)法完成。2000年第一次在血管生成基因療法中檢測(cè)了 HIF-Ia的組成型活性形式(Vincent, K. A.等，2000，Circulation 102，2255-61)。它包含 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和 HIF-1 a的二聚體化結(jié)構(gòu)域，其在CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下與單純皰疹病毒(HSV)的轉(zhuǎn)活結(jié)構(gòu)域VP16相連。所得突變體可體內(nèi)誘導(dǎo)HIF目標(biāo)基因。當(dāng)以裸露DNA局部給予時(shí)，它可在小鼠后肢缺血模型中引起毛細(xì)血管密度和血液灌注增加。當(dāng)頂注射大鼠MI模型時(shí)相同的構(gòu)建體時(shí)也顯示出治療作用(Shyu, K. G.等，2002，Cardiovasc Res 54,576-83).在CMV啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)缺失殘基401-602的組成型活性突變體HIF-I a的腺病毒也可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜非缺血組織中的血管生成(Kelly，B.D.等，2003 Circ Res 93，1074-81)。上述兩種構(gòu)建體具有HIF-I a分子的大片段缺失，并缺少天然HIF_1 a轉(zhuǎn)活結(jié)構(gòu)域(N-TAD和C-TAD)之一或二者，其可引起活化潛能和HIF-I a特異性降低。此外，這些構(gòu)建體在CMV(通用和非特異性啟動(dòng)子)調(diào)控下表達(dá)HIF-I a，由于非特異性表達(dá)和潛在的副作用，限制了它的應(yīng)用。已使用多種給藥途徑向缺血區(qū)域給予治療基因，包括外周缺血下的血管內(nèi)和肌肉內(nèi)給藥和心肌缺血下的心肌內(nèi)、心包內(nèi)和冠狀動(dòng)脈內(nèi)給藥。靜脈內(nèi)途徑帶來(lái)的優(yōu)點(diǎn)包括易于進(jìn)入而不需侵入性操作，技術(shù)安全性和低成本以及適用于大患者群。然而，盡管有這些明顯的臨床優(yōu)點(diǎn)，這一給藥途徑并不常用，這是由于該載體的全身分布導(dǎo)致目標(biāo)器官中轉(zhuǎn)基因表達(dá)低以及在非目標(biāo)器官中的不必要表達(dá)引起全身副作用，這限制了可給予的劑量。這一限制又接著限制了治療的功效。促血管新生基因的不必要表達(dá)可誘導(dǎo)病理性血管生成，可能導(dǎo)致腫瘤形成和視網(wǎng)膜病，因此是不可接受的。因此，引導(dǎo)缺血目標(biāo)器官中特異的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的能力對(duì)于有效和安全的全身給藥是非常重要的。因此人們廣泛認(rèn)識(shí)到對(duì)將是非常有利的促血管新生因子和安全有效給藥方法的需要。發(fā)明簡(jiǎn)述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面提供了分離的包含編碼具有HIF-I a氨基酸序列的多肽的核酸序列的多核苷酸，該多肽可穩(wěn)定表達(dá)并具有組成型活性。根據(jù)下文所述本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的進(jìn)一步特點(diǎn)，該核酸序列列于SEQ ID NO :1。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中又進(jìn)一步特點(diǎn)，該氨基酸序列列于SEQ ID NO :2。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)，該氨基酸序列至少90%與SEQ ID NO 3同源并包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3的402脯氨酸位點(diǎn)的突變、對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3的564脯氨酸位點(diǎn)的突變和對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3的803天冬酰胺位點(diǎn)的突變。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了分離的包含編碼具有HIF-Ia氨基酸序列的多肽的氨基酸序列的多肽，該多肽可穩(wěn)定表達(dá)并具有組成型活性。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案中又進(jìn)一步特點(diǎn)，該氨基酸序列列于SEQ ID NO :2。
根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)，該氨基酸序列至少90%與SEQ ID NO 3同源并包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3的402脯氨酸位點(diǎn)的突變、對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3的564脯氨酸位點(diǎn)的突變和對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3的803天冬酰胺位點(diǎn)的突變。根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)，該核酸構(gòu)建體進(jìn)一步包含順式-調(diào)控元件。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)，該順式-調(diào)控元件包含啟動(dòng)子元件。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn),該該啟動(dòng)子元件為內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)，該內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件包含至少一個(gè)PPE-I啟動(dòng)子拷貝。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)，該P(yáng)PE-I啟動(dòng)子列于SEQ ID NO :4。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)，該順式-調(diào)控元件進(jìn)一步包含低氧反應(yīng)元件。根據(jù)本發(fā)明又另一方面提供了包含該核酸構(gòu)建體的細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明又另一方面提供了包含作為活性物質(zhì)的該核酸構(gòu)建體和藥學(xué)可接受載體的藥用組合物。根據(jù)本發(fā)明的附加方面提供了治療與低氧或缺血、組織灌注內(nèi)含物減少(reducedtissue perfusion inclusion)或“低血流”相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的方法,該方法包括給予需要治療的受試者治療有效量的可上調(diào)受試者細(xì)胞中本發(fā)明多肽的藥劑，藉此治療血管生成-相關(guān)疾病。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)該藥劑為多肽。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)該藥劑為核酸構(gòu)建體。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)所述給藥具有全身作用。根據(jù)所述優(yōu)選實(shí)施方案的又進(jìn)一步特點(diǎn)該與缺血相關(guān)的疾病或病癥選自創(chuàng)傷愈合、缺血性發(fā)作、缺血性心臟病、外周血管疾病、腎動(dòng)脈疾病、胃腸道損傷、燒傷、皮膚移植、血管移植物、器官修復(fù)、骨修復(fù)病癥、肝病癥、子宮病癥、眼睛血管生成病癥、骨再生病癥、軟骨修復(fù)病癥和平滑肌細(xì)胞病癥。本發(fā)明通過(guò)提供與缺血相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的新穎治療成功克服了目前已知構(gòu)型的缺點(diǎn)。 除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。盡管可使用與本發(fā)明所述者相似或等同的方法和材料實(shí)施或檢測(cè)本發(fā)明，下文描述了適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧?。本文提及的所有出版物、?zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其它參考均以其完整內(nèi)容以參考形式并于本文。如有沖突，以本專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)(包括定義)為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)施例僅為示例性并不具有限制性。附圖簡(jiǎn)述在本文中參考附圖僅舉例描述本發(fā)明?，F(xiàn)具體參考詳細(xì)的附圖，應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是所顯示的詳細(xì)說(shuō)明僅為舉例而言并僅用于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的說(shuō)明性討論，并以提供被認(rèn)為是本發(fā)明原理和概念方面最有用和最易理解的描述為由而展示。就此而言，并未試圖以比基本理解本發(fā)明所需更多的細(xì)節(jié)顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，對(duì)附圖的描述使得本領(lǐng)域技術(shù)人員可顯而易見(jiàn)如何實(shí)施本發(fā)明的數(shù)種形式。在這些圖中圖IA-E為說(shuō)明與P402A P564G和P564A N803A雙突變體相比三突變體HIF-I a轉(zhuǎn)錄活性的線條圖和照片。用p2. I HRE-Iuc和不同的HIF-I a質(zhì)?；騪cDNA3對(duì)照共轉(zhuǎn)染后在HEK293(

圖1A)和BAEC (圖1B)中測(cè)量HRE-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。數(shù)據(jù)以熒光素酶比值表示并標(biāo)準(zhǔn)化至P -gal (平均值土 S. D)。與雙突變體相比*p < 0. 001。圖IC為用HIF-I a質(zhì)?；騪cDNA3對(duì)照轉(zhuǎn)染后48小時(shí)分離自HeLa細(xì)胞的mRNA的RT-PCR分析。2，2'-聯(lián)吡啶{2,2' -DP)處理顯示于圖ID。用p2. I HRE-Iuc和不同的HIF-I a質(zhì)?；騪cDNA3對(duì)照共轉(zhuǎn)染后在VL-缺陷腎細(xì)胞癌細(xì)胞中測(cè)量HRE介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。數(shù)據(jù)以熒光素酶比值表示并標(biāo)準(zhǔn)化至 e -gal (平均值土 S. D)。*p < 0. 001 并且 +P = 0. 003 比 P402A P564G 突變體。用 p2. IHRE-熒光素酶、HIF-Ia質(zhì)粒和所指量的FIH-I反義(圖1E)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。數(shù)據(jù)以熒光素酶比值表示并標(biāo)準(zhǔn)化至P -gal (平均值土 S. D)。圖2A-H為說(shuō)明三突變體HIF-I a比P402A P564G和P564A N803A雙突變體顯示出更大血管生成潛能的照片和條線圖。圖2A-F為在被pcDNA3(圖2A)、wt-HIF-1 a (圖2B)、P402A P564G(圖 2C)、P564A N803A (圖 2D)、三突變體(圖 2E)或 VEGF (圖 2F)轉(zhuǎn)染的HUVECs中體內(nèi)血管生成測(cè)定的代表性照片。圖2G為說(shuō)明已轉(zhuǎn)染HUVECs管形成的條線圖，其通過(guò)計(jì)數(shù)每高倍顯微鏡視野的毛細(xì)血管分支數(shù)量定量。結(jié)果以5個(gè)隨機(jī)顯微鏡視野的平均值土S. D表示。圖2H為說(shuō)明已轉(zhuǎn)染HUVECs的VEGF蛋白濃度的條線圖，用ELISA測(cè)定，結(jié)果以平均值土 s. D表示。*p = 0. 029比P402A P564G。圖3A-H為說(shuō)明PPE1-3X啟動(dòng)子的內(nèi)皮和缺血特異性的熒光顯微鏡切片的照片。圖3A-F顯示了使后肢缺血或進(jìn)行假操作的小鼠腓腸肌的熒光顯微鏡切片，7天后經(jīng)尾靜脈向這些小鼠系統(tǒng)注射生理鹽水(圖3A和3D)、Ad-CMV-GFP (圖3B和3E)或Ad-PPEl-3x_GFP (圖3C和3F)。圖3G-H顯示了用Ad-PPE-1-3X-GFP處理的小鼠腓腸肌的切片，如顯示由表達(dá)GFP的內(nèi)皮細(xì)胞組成的毛細(xì)血管中的紅細(xì)胞(箭頭所指)的熒光顯微鏡(圖3G)下或相差顯微鏡下(圖3H)所見(jiàn)。圖4A-F說(shuō)明了局部Ad-CMV-三突變體和Ad-PPE-三突變體處理可增強(qiáng)缺血后血管生成。圖4A為左股動(dòng)脈結(jié)扎后即刻和第7、14、21和28天缺血肢中血流的條線圖。數(shù)據(jù)以左(缺血)與右(非-缺血)肢灌注的比值表示。生理鹽水，n = 8 ；Ad-CMV-Luc, n = 11 ；Ad-CMV-wt, n = 11 ；Ad-CMV-三突變體，n = 12 ；Ad-PPE-三突變體，n = 11。圖 4B 為手術(shù)28天后缺血(左)和非缺血(右)肢的代表性激光多普勒血流影像。在顏色編碼影像中，紅色表示正常灌注而藍(lán)色表示低和/或無(wú)灌注。圖4C為手術(shù)后21天小鼠后肢的代表性照片。圖4D為說(shuō)明手術(shù)后21天出現(xiàn)趾壞死的小鼠比例的條線圖。圖4E-F顯示股動(dòng)脈結(jié)扎后28天腓腸肌切片的毛細(xì)血管的代表性⑶31染色(圖4E)和定量(圖4F)。*p < 0. 01。圖5A-N說(shuō)明了系統(tǒng)給藥之后Ad-PPE-三突變體的毒性小于Ad-CMV-三突變體。圖5A為說(shuō)明系統(tǒng)注射生理鹽水或腺病毒后一段時(shí)間小鼠體重變化的點(diǎn)狀圖。圖5B-D為說(shuō)明系統(tǒng)注射生理鹽水或腺病毒5和21天后血清膽紅素(圖5B)、AST (圖5C)和ALT (圖5D)水 平的條線圖。圖5E-N為系統(tǒng)注射生理鹽水(圖5E-F) ,AdCMV-Luc (圖5G_H)、AdCMV_wt (圖51-J)、AdCMV-三突變體(圖 5K-L)、AdPPE-三突變體(圖 5M-N) 5 (圖 5E、G、I、K 和 M)和21天(圖5F、H、J、L和N)后小鼠肝的組織切片。圖6A-F說(shuō)明了系統(tǒng)Ad-PPE-三突變體而不是Ad-CMV-三突變體處理可增強(qiáng)缺血后血管生成。圖6為左股動(dòng)脈切除后即刻和7、14、21和28天測(cè)量的缺血肢的血流的點(diǎn)狀圖。數(shù)據(jù)以左(缺血)和右(非缺血)肢灌注的比值表示。鹽水，n = 9 ；Ad-CMV-Luc,n =8 ；Ad-CMV-wt, n = 9 ；Ad-CMV-三突變體，n = 7 ；Ad-PPE-三突變體，n = 8。圖 6B 為顯示手術(shù)后21天出現(xiàn)趾壞死小鼠的百分比的條線圖。圖6C顯示了手術(shù)后21天小鼠后肢的代表性照片。圖6D為手術(shù)后28天缺血(左)和非缺血(右)肢的代表性激光多普勒血流影像。在顏色編碼的影像中，紅色表示正常灌注而藍(lán)色表示低和/或無(wú)灌注。圖6E-F顯示股動(dòng)脈結(jié)扎后28天腓腸肌切片的毛細(xì)血管的代表性CD31染色(圖6E)和定量(圖6F)。*p< 0. 01。圖7A為在BAEC中表達(dá)HIF-I a的腺病毒的HRE-介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的比較。用p2. IHRE-Luc轉(zhuǎn)染BAEC，24小時(shí)后用腺病毒以MOI 20或MOI 200感染。數(shù)據(jù)以熒光素酶光單位(平均值土 S. D)表不。圖7B為HeLa細(xì)胞中HIF-1 a的蛋白質(zhì)印跡分析。用Ad-CMV-GFP、AD-CMV-wtHIF-1 a ,Ad-CMV-三突變體或Ad-PPEl_3x-三突變體或模擬感染對(duì)HeLa進(jìn)行感染。感染后48小時(shí)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。圖7C-G :在HUVEC中表達(dá)HIF_1 a的腺病毒的體外血管生成測(cè)定。模擬感染(C)或用 Ad-CMV-GFP(D)、Ad-CMV-WtHIF-1 a (E)、Ad-CMV-三突變體(F)或 Ad-PPEl_3x-三突變體(G)感染HUVEC。48小時(shí)之后進(jìn)行體外血管生成測(cè)定。圖C-G為管形成的代表性照片。
圖7H :為說(shuō)明經(jīng)ELISA測(cè)定的被感染HUVECs的VEGF蛋白濃度的條線圖，以平均值土 S. D 表示。*p = 0. 01 比 Ad-CMV-wtHIF-1 a。優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及HIF-I a多肽和其編碼多核苷酸，包含它們的藥用組合物及其生產(chǎn)和使用方法。具體而言，本發(fā)明可用于治療與缺血相關(guān)的疾病。在詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)理解的是本發(fā)明的應(yīng)用不受限于下文描述或由實(shí)施例例證的細(xì)節(jié)。本發(fā)明可有其它的實(shí)施方案并以各種方法實(shí)施或進(jìn)行。而且，應(yīng)當(dāng)理解的是本文使用的措辭和術(shù)語(yǔ)僅用于描述性目的并不應(yīng)被認(rèn)為具有限制 性。低氧-誘導(dǎo)因子I a (HIF-1 a )為異二聚體轉(zhuǎn)錄因子和對(duì)低氧水平響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其已被建議作為治療性血管生成的潛在候選物?？赏ㄟ^(guò)點(diǎn)突變P402A和P564G達(dá)到HIF-Ia的穩(wěn)定化[Masson等，2001，Embo J 20，5197-206]，而通過(guò)點(diǎn)突變N803A達(dá)到其C-轉(zhuǎn)活結(jié)構(gòu)域(C-TAD)的組成型活性[Lando 等，2002，Science 295，858-61]。在將本發(fā)明付諸實(shí)踐的過(guò)程中，發(fā)明人通過(guò)基因工程構(gòu)建了結(jié)合三個(gè)點(diǎn)突變P402A P564G N803A的HIF-1 a突變形式(三突變體)，使HIF-1 a既穩(wěn)定又具有組成型活性。令人驚訝的是與兩個(gè)已知的HIF-1 a雙突變體相比三突變體對(duì)與低氧響應(yīng)元件相連的報(bào)告基因的表達(dá)表現(xiàn)出協(xié)同作用，如圖IA-B所示。因此，發(fā)明人表明HIF-1 a C-轉(zhuǎn)活結(jié)構(gòu)域的組成型活化而不僅僅是HIF-1 a分子的穩(wěn)定性對(duì)最佳HIF-介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄和促血管新生作用是必要的。因此，本發(fā)明的三突變體HIF-1 a或其編碼多核苷酸可用于治療與血管生成相關(guān)的疾病或病癥。如圖2G-H所示，如體外血管生成測(cè)定所表明，本發(fā)明的三突變體比P402A P564G和P564A N803A雙突變體顯示出更強(qiáng)的血管生成功效。此外，如圖4A-F所示，在小鼠后肢缺血模型中與表達(dá)野生型HIF-1 a的腺病毒和對(duì)照相比表達(dá)本發(fā)明三突變體HIF-1 a的腺病毒顯示出血液灌注增強(qiáng)和毛細(xì)血管密度增高。經(jīng)修飾的前內(nèi)皮素原-I啟動(dòng)子顯示允許在缺血內(nèi)皮細(xì)胞中的特異表達(dá)(圖3C和3F)。在這一啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)三突變體HIF-1 a比在組成型活性啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)三突變體(圖5A-N和6A-D)降低了異位表達(dá)和全身副作用。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了包含編碼具有HIF-1 a氨基酸序列的多肽的氨基酸序列的分離多肽，該多肽可穩(wěn)定表達(dá)并具有組成型活性。如本文所使用，短語(yǔ)"HIF-Ia "指至少一個(gè)HIF-Ia的活性部分(即，具有HIF-Ia活性的部分)。優(yōu)選本發(fā)明HIF-1 a為人HIF-Ia，例如GenBank登錄號(hào)NM001530。如本文所使用短語(yǔ)“HIF-1 a活性”指至少HIF-1 a的轉(zhuǎn)錄因子活性，即，HIF-1 a轉(zhuǎn)錄性上調(diào)目標(biāo)血管生成基因的能力。為了以轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，HIF-Ia與HIF-13 二聚體化并與輔-因子例如P300結(jié)合。因此本發(fā)明HIF-1 a優(yōu)選包含功能性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和功能性輔-因子和HIF-1 P結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明HIF-1 a不必要包含例如氨基或羧基端氨基酸，因?yàn)檫@些末端序列對(duì)于HIF-1 a活性不是必須的。如本文所使用，短語(yǔ)“組成型活性”指包含不被細(xì)胞低氧狀態(tài)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄活性的HIF-1 a。
如本文所使用，短語(yǔ)“穩(wěn)定表達(dá)”指對(duì)低氧響應(yīng)時(shí)蛋白體降解不增加的多肽。因此該多肽的半衰期不被Von-Hippel-Lindau(VHL)的存在所改變。優(yōu)選地，本發(fā)明多肽的半衰期至少比野生型多肽半衰期(即不包含突變)大約2倍，更優(yōu)選大5倍。根據(jù)本發(fā)明這一方面的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明多肽與SEQ ID NO :3至少50%同源，更優(yōu)選至少60%同源，更優(yōu)選至少70%同源，更優(yōu)選至少80%同源，最優(yōu)選至少90%同源并包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3脯氨酸402位點(diǎn)的突變、對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3脯氨酸564位點(diǎn)的突變和對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :3天冬酰胺803位點(diǎn)的突變。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“突變”指與野生型序列(GenBank登錄號(hào)NM001530(GI 31077212)相比氨基酸序列的改變。突變可包含缺失或替換。示例性突變包括對(duì)應(yīng)于402位脯氨酸的丙氨酸、對(duì)應(yīng)于564位脯氨酸的甘氨酸和對(duì)應(yīng)于803位天冬酰胺的丙氨酸。
因此，根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明多肽列于SEQ ID N0:2。此外，本發(fā)明多肽可包含SEQ ID NO : 3的其它保守改變。本文使用的短語(yǔ)“保守改變”指氨基酸殘基被另一種生物學(xué)相似殘基替換。保守改變的實(shí)例包括親水殘基例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸替換另一親水殘基，或極性殘基替換另一極性殘基，例如精氨酸替換賴(lài)氨酸、谷氨酸替換天冬氨酸或谷氨酰胺替換天冬酰胺。術(shù)語(yǔ)“保守改變”也包括使用被替換的氨基酸取代未被替換的母體氨基酸，只要已替換多肽的抗體也可與未替換多肽發(fā)生免疫反應(yīng)。可使用蛋白質(zhì)工程方法，例如展示技術(shù)發(fā)現(xiàn)其它可使本發(fā)明HIF-Ia以及HIF-1 a活性部分具有穩(wěn)定性和組成型活性的突變。構(gòu)建展示文庫(kù)的方法為本領(lǐng)域已知。這些方法描述于，例如，Young AC等，“多糖結(jié)合抗體至新型隱球菌及其與噬菌體展示文庫(kù)的肽的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)對(duì)鑒定肽模擬位的意義，，(〃 The three-dimensional structures of a polysaccharide binding antibodyto Cryptococcus neoformans and its complex with a peptide from a phage displaylibrary !implications for the identification of peptide mimotopes" )J Mol Biol1997 Dec 12 ；274(4) :622-34 ;Giebel LB等，“篩選環(huán)形肽噬菌體文庫(kù)鑒定以高親和性與抗生物素蛋白鏈菌素結(jié)合的配體”("Screening of cyclic peptide phage librariesidentifies ligands that bind streptavidin with high affinities" )Biochemistry1995 Nov28 ;34(47) :15430-5 ;Davies EL等，“使用衍生自雞免疫球蛋白基因的文庫(kù)篩選特異性嗷菌體展不抗體” ("Selection of specific phage-display antibodies usinglibraries derived from chicken immunoglobulin genes" )J Immunol Methods 1995Oct 12 ；186(1) :125-35 Jones C RT等，“分子識(shí)別和生物分離的現(xiàn)有趨勢(shì)”Currenttrends in molecular recognition and bioseparation" )J Chromatogr A 1995 Jul14；707(1) :3-22 ；Deng SJ等，“從合成基因文庫(kù)中篩選改良的碳水化合物-結(jié)合單鏈抗體的基石出，，(〃 Basis for selection of improved carbohydrate-binding single-chainantibodies from synthetic gene libraries" )Proc Natl Acad Sci USA 1995 May23 ；92(11) :4992-6 ;以及Deng SJ等，“通過(guò)噬菌體展示篩選碳水化合物結(jié)合改進(jìn)的抗體單鏈可變區(qū)片段，，("Selection of antibody single-chain variable fragments withimproved carbohydrate binding by phage display" )J Biol Chem 1994 Apr I;269(13) :9533-8,均以參考形式并于本文。也可使用計(jì)算機(jī)生物學(xué)發(fā)現(xiàn)可使本發(fā)明HIF-Ia具有穩(wěn)定性和組成型活性的其它突變。舉例而言，可使用各種三維計(jì)算機(jī)工具用計(jì)算機(jī)分析各種突變HIF-1 a肽序列賦予穩(wěn)定性和組成型活性的能力?？墒褂每捎糜谡故救S結(jié)構(gòu)模型的軟件程序例如RIBBONS(Carson, M. ,1997. Methods in Enzymology 277,25)、0 (Jones, TA.等，1991. ActaCrystalIogr A47,110)、DINO(DINO !Visualizing Structural Biology(2001)http://www. dino3d. org) ； QUANTA, I NS IGHT、SYBYL、MACR0M0DE、I CM、M0LM0L、RASMOL 和 GRASP (綜述于Kraulis, J. , 1991. Appl Crystallogr. 24,946)建模預(yù)期突變肽序列以鑒定可用突變。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“多肽”涵蓋天然多肽(或是降解產(chǎn)物，或是合成性合成多肽或是重組多肽)和模擬肽(通常為合成型合成多肽)以及類(lèi)肽和半類(lèi)肽(其為多肽類(lèi)似物)，它們具有的一些修飾可使多肽在體內(nèi)更穩(wěn)定或更容易進(jìn)入細(xì)胞。這些修飾包括但不
限于N端修飾、C端修飾、多肽鍵修飾，包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S = 0、0 = C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S = C_NH、CH = CH或CF = CH、骨架修飾和殘基修飾。制備模擬肽化合物的方法為本領(lǐng)域已知并描述于例如Quantitative Drug Design, C. A. Ramsden Gd. , 17. 2章，F(xiàn). Choplin Pergamon Press (1992),其以參考形式并于本文如同完整列于本文。這一方面的進(jìn)一步細(xì)節(jié)提供于下文。該多肽內(nèi)的多肽鍵(-C0-NH-)可通過(guò)以下方式替換，例如N-甲基化鍵(-N (CH3) -CO-)、酯鍵(-C (R) H-C-0-0-C (R) -N-)、酮亞甲基鍵(-C0-CH2-)、a -氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)，其中R為烷基，例如甲基、亞甲基氨基鍵(carba bonds) (-CH2-NH-)、羥亞乙基鍵(-CH(OH)-CH2-)、硫代碳酰胺鍵(-CS-NH-)、烯屬雙鍵(_CH = CH-)、逆酰胺鍵(-NH-C0-)、多肽衍生物(-N(R)-CH2-C0_)，其中R為"正常"側(cè)鏈，天然存在于碳原子上。這些修飾可發(fā)生在沿著多肽鏈的任何鍵上甚至同時(shí)發(fā)生在數(shù)個(gè)鍵上(2-3)。天然芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可替換成合成非天然酸,例如苯胺乙酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的環(huán)甲基化衍生物、Phe的鹵代衍生物或O-甲基-Tyr。除以上所述，本發(fā)明多肽也可包括一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的氨基酸或一個(gè)或多個(gè)非氨基酸單體(例如，脂肪酸、復(fù)合碳水化合物等)。如說(shuō)明書(shū)和下文的權(quán)利要求部分所使用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”或“多個(gè)氨基酸”應(yīng)理解為包括20種天然氨基酸；那些氨基酸常常被體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后修飾，包括例如羥基脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；以及其它罕見(jiàn)氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羥基賴(lài)氨酸、異鎖鏈賴(lài)氨素、原纈氨酸、己氨酸和鳥(niǎo)氨酸。此外，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括D和L-氨基酸二者。以下表I和2列出了可用于本發(fā)明的天然氨基酸(表I)和非常規(guī)或經(jīng)修飾的氨基酸(表2)表I
權(quán)利要求
1.包含編碼具有HIF-Iα氨基酸序列的多肽的核酸序列的分離多核苷酸，所述多肽可穩(wěn)定表達(dá)并具有組成型活性。
2.權(quán)利要求I的分離多核苷酸，其中所述核酸序列列于SEQID NO: I。
3.權(quán)利要求I的分離多核苷酸，其中所述氨基酸序列列于SEQID NO: 2。
4.權(quán)利要求I的分離多核苷酸，其中所述氨基酸序列與SEQID NO: 3至少90%同源并包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的402位脯氨酸的突變，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的564位脯氨酸的突變和對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的803位天冬酰胺的突變。
5.包含編碼具有HIF-Ia氨基酸序列的多肽的氨基酸序列的分離多肽，所述多肽可穩(wěn)定表達(dá)并具有組成型活性。
6.權(quán)利要求5的分離多肽，其中所述氨基酸序列列于SEQID NO: 2。
7.權(quán)利要求5的分離多肽，其中所述氨基酸序列與SEQID NO: 3至少90%同源并包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的402位脯氨酸的突變，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的564位脯氨酸的突變和對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 3的803位天冬酰胺的突變。
8.包含權(quán)利要求I的多核苷酸的核酸構(gòu)建體。
9.權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體，其進(jìn)一步包含順式-調(diào)控元件。
10.權(quán)利要求9的核酸構(gòu)建體,其中所述順式-調(diào)控元件包含啟動(dòng)子元件。
11.權(quán)利要求10的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子元件為內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件。
12.權(quán)利要求11的核酸構(gòu)建體，其中所述內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件包含至少一個(gè)PPE-I啟動(dòng)子拷貝。
13.權(quán)利要求12的核酸構(gòu)建體，其中所述PPE-I啟動(dòng)子列于SEQID NO: 4。
14.權(quán)利要求9的核酸構(gòu)建體，其中所述順式-調(diào)控元件進(jìn)一步包含低氧響應(yīng)元件。
15.包含權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體的細(xì)胞。
16.藥用組合物，包含作為活性物質(zhì)的權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體和藥學(xué)可接受載體。
17.治療與低氧或缺血、組織灌注內(nèi)含物減少或“低血流”相關(guān)的醫(yī)學(xué)病癥的方法，所述方法包括給予需要治療的患者治療有效量的能在受試者細(xì)胞中上調(diào)權(quán)利要求5的多肽的藥劑，藉此治療血管生成相關(guān)疾病。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述藥劑為權(quán)利要求5的多肽。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述藥劑為權(quán)利要求8的核酸構(gòu)建體。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述給藥具有系統(tǒng)作用。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述缺血相關(guān)醫(yī)學(xué)病癥選自創(chuàng)傷愈合、缺血性發(fā)作、缺血性心臟病、外周血管疾病、腎動(dòng)脈疾病、胃腸道損傷、燒傷、皮膚移植、血管移植、器官修復(fù)、骨修復(fù)病癥、肝病癥、子宮病癥、眼睛血管生成病癥、骨再生病癥、軟骨修復(fù)病癥和平滑肌細(xì)胞病癥。
全文摘要
多肽和其編碼多核苷酸及它們?cè)谥委熑毖嚓P(guān)醫(yī)學(xué)病癥中的應(yīng)用。本文公開(kāi)了包含編碼具有HIF-1α氨基酸序列的多肽的核酸序列的分離多核苷酸，該多肽可穩(wěn)定表達(dá)并具有組成型活性。也公開(kāi)了其編碼的分離多肽及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102796741SQ20121021064
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2007年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月31日
發(fā)明者E.布賴(lài)特巴特, L.班喬, R.塔爾 申請(qǐng)人:脈管生物生長(zhǎng)有限公司