專利名稱：治療或預防癌癥的多肽或其衍生產品及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及多肽及其用途，尤其涉及能治療或預防癌癥的多肽以及由該肽所衍生 的具有治療或預防癌癥功效的產品，本發(fā)明還涉及上述多肽或其衍生產品在制備抗腫瘤藥 物中的用途，屬于多肽抗腫瘤領域。
背景技術：
世界衛(wèi)生組織發(fā)表的一項研究報告表明，全球癌癥狀況將日益嚴重，今后20年新 患者人數(shù)將由目前的每年1000萬增加到1500萬，因癌癥而死亡的人數(shù)也將由每年600萬 增至1000萬，腫瘤已經成為嚴重威脅著人類安全和健康的主要疾病之一。中國衛(wèi)生部的統(tǒng) 計資料表明目前中國每年新生腫瘤患者總數(shù)約220萬人左右，其中，每年有121萬左右的 惡性腫瘤新生患者，占中國每年新生腫瘤患者總數(shù)的55% ；同時，全國約有310萬左右的腫 瘤現(xiàn)有患者，其中，惡性腫瘤現(xiàn)有患者約182萬左右，占中國現(xiàn)有腫瘤患者總數(shù)58%，惡性 腫瘤已成為我國居民的主要死因，占死亡原因20%以上。目前惡性腫瘤的治療方法主要有手術治療、化療、放療三種，其中化療是近年來在 腫瘤治療中進步最快的治療方法。但是化療藥物?！笆欠遣磺濉薄ⅰ皵澄也环帧?，在殺傷腫瘤細 胞的同時，也殺傷了人體正常細胞，治療劑量下對正常組織器官毒副作用大，給患者帶來極 大痛苦且療效欠佳，如骨髓抑制，消化道反應、心、腎等器官的損傷等。因此，新型抗腫瘤藥 物研究勢在必行，而在腫瘤細胞信號通路上尋找選擇性的調節(jié)分子可能是新型化療藥物的 研究方向。

發(fā)明內容
本發(fā)明人根據(jù)與腫瘤發(fā)生密切相關的G3BP蛋白的一級序列，以及該蛋白的同源 蛋白(pdbID:lgy5，lgy6)，通過計算機同源模建的方法，模建了該蛋白的三維立體結構模 型?；谠摰鞍着c其結合蛋白RasGAP的相互作用模式，運用分子動力學原理，蛋白質對接、 分子動力學模擬、結合自由能預測、能量分解等分子模擬方法，經合理藥物設計獲得了一系 列能特異性促進癌細胞凋亡的活性多肽(中國專利申請?zhí)枺?00910163852. 1)。本發(fā)明人繼續(xù)以G3BP蛋白為靶點，應用上述分子模擬方法結合多肽合成、細胞生 物檢測方法，設計合成并篩選新肽段。具體是基于此前的能量分解計算結果，確定與蛋白相 互作用有重要貢獻的關鍵殘基，設計出抗癌活性多肽序列。開展抗癌多肽序列與G3BP的蛋 白質對接計算，以確定多肽一蛋白復合物三維結構，并應用前述方法(分子動力學、自由能 預測等)開展模擬計算，根據(jù)自由能計算提供的信息開展對多肽序列的虛擬突變和虛擬活 性評價，在此基礎上設計出了抗癌活性更好的一系列多肽.這些肽單獨使用時對癌細胞有 著明顯的殺傷力，當它們與臨床上常用的化療藥物如順鉬、奧沙利鉬等合用，顯著地增加化 療藥物對癌細胞的敏感性，增強其對癌細胞的殺傷力，降低它的使用劑量，而且我們已經在 動物腫瘤模型上證明該肽具有抗腫瘤效應。本發(fā)明人經過深入的研究后發(fā)現(xiàn)，一種具有下述技術方案中的所列的特征的肽可以達到上述目的。一種能治療或預防癌癥的多肽，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所示。一種能治療或預防癌癥的多肽，其氨基酸序列通式1為IVHNX1X2X3X4GX5X6WX7X8一種能治療或預防癌癥的多肽，其氨基酸序列通式2為
mfivhnx9x10rrgx11mwx12x13上述肽鏈中單字母符號代表的氨基酸殘基定義如下m為蛋氨酸，f為苯丙氨酸，i 為異亮氨酸，v為纈氨酸，h為組氨酸，n為天冬酰胺，g為甘氨酸，w為色氨酸，x1,為可變
的氨基酸殘基。x1是酸性氨基酸或酰胺類氨基酸，其中優(yōu)選為谷氨酸或甘氨酸；x2是脂肪族氨基 酸殘基，優(yōu)選為亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸；x3是極性氨基酸殘基，優(yōu)選為谷氨酸或精氨酸； x4是極性氨基酸殘基，優(yōu)選為天冬氨酸或精氨酸 ’ X5是芳香類氨基酸、酸性氨基酸、酰胺類 氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或亮氨 酸 ’Xe是含硫氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為甲硫氨酸或亮氨酸；x7是脂肪族氨基酸殘 基，優(yōu)選為纈氨酸、甘氨酸或丙氨酸；x8是羥基類氨基酸或脂肪族氨基酸、酸性性氨基酸殘 基，優(yōu)選為蘇氨酸、甘氨酸或谷氨酸。X9是酸性或脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為谷氨酸或甘氨 酸兩種氨基酸殘基；Xltl是脂肪族或芳香族氨基酸殘基，優(yōu)選為苯丙氨酸、亮氨酸或纈氨酸； X11S芳香類氨基酸、酸性氨基酸、酰胺類氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為色氨酸、苯丙 氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸；X12是脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為丙氨酸或纈氨 酸；X13是羥基氨基酸或酸性氨基酸殘基，優(yōu)選為蘇氨酸或谷氨酸。一種分離和純化的核苷酸序列，其能編碼氨基酸序列為SEQ ID NO. 1的肽。一種分離和純化的核苷酸序列，其能編碼氨基酸序列為通式1的肽。一種分離和純化的核苷酸序列，其能編碼氨基酸序列為通式2的肽。一種表達載體，包括至少一個拷貝的編碼氨基酸序列為seq id no. 1所示肽的核 苷酸序列。一種表達載體，包括至少一個拷貝的編碼氨基酸序列為通式1所示肽的核苷酸序 列。一種表達載體，包括至少一個拷貝的編碼氨基酸序列為通式2所示肽的核苷酸序 列。一種原核或真核宿主細胞，該宿主細胞含有上述表達載體。本發(fā)明還進一步提供了將氨基酸序列為SEQ ID NO. 1所述肽及通式1或通式2所 述的肽與能增加其在細胞中積累的制劑相綴合或混合后所得到的產品。上述與所述肽綴合的制劑是能協(xié)助所述肽穿透細胞膜的載體。SEQ IDN0. 1、通式 1或通式2所述的肽和能協(xié)助肽穿透細胞膜的載體，如HIV48-57肽，F(xiàn)HV-外被35-49肽， HTLV-II Rex 4_16肽或BMV gag7_25肽綴合，綴合后生成的化合物可以有效的通過細胞膜， 在癌細胞局部起作用，因此具有更強的殺傷癌細胞的效果。能與SEQ ID NO. 1、通式1或通式2所述的肽綴合的制劑還可以是納米材料、脂質 體或油性化合物。SEQ ID N0. 1、通式1或通式2所述的肽和納米材料、脂質體等高分子材料綴合，綴合后生成的化合物可以使本發(fā)明涉及的肽在機體內更穩(wěn)定地被運輸?shù)桨屑毎?。本發(fā)明涉及 的肽也可以和油性化合物或多種油性化合物的混合物相混合，所得到的混合物也可以使本 發(fā)明涉及的肽在機體內更穩(wěn)定地被運輸?shù)桨屑毎?。一種治療或預防癌癥的藥用組合物，包括作為活性物質的藥用有效量的SEQID NO. 1、通式1或通式2所述肽，及藥用載體、稀釋劑和/或佐劑。本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO. 1、通式1或通式2所述肽用于制備治療或預防癌癥的 藥物中的用途。所述癌癥包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、食管癌、乳腺癌、白血 病、膀胱癌、子宮頸癌或鼻咽癌等。本發(fā)明還提供了將SEQ ID NO. 1、通式1或通式2所述肽用于制備增強基因毒素選 擇性地殺傷癌細胞的藥物中的用途。所述癌細胞包括但不限于肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、食管癌、乳腺癌、白 血病、膀胱癌、子宮頸癌或鼻咽癌等的癌細胞。所述基因毒素包括但不限于順鉬、奧沙利鉬、紫杉醇、表柔比星、多柔比星、吡柔 比星、柔紅霉素、絲裂霉素、達卡巴嗪、環(huán)磷酰胺、吉西他濱或卡培他濱等。本發(fā)明的肽可以和基因毒素混合，再添加藥學上可接受的輔料或載體制成新型的 更有效的抗癌藥物。本發(fā)明的肽通常是以能實現(xiàn)預期目的的用量使用。在用于預防和治療癌癥時，所 述肽或它的藥用組合物是以治療有效量服用或使用的。對于系統(tǒng)性用藥來說，可以根據(jù)體 外實驗估算治療有效量或用量，還可以應用本領域的常用方法通過動物模型估算出體內的 起始劑量。當然，本發(fā)明肽的具體有效量要取決于具體的治療對象、治療對象的體重、疾病 的嚴重程度、用藥方式以及主治醫(yī)生的臨床判斷。本發(fā)明人經過深入的研究以后發(fā)現(xiàn)上述可用于治療或預防癌癥的多肽。該肽不 僅在單獨使用時對癌細胞有著明顯的殺傷力，而且可以和臨床上常用的化療藥物如順鉬 合用，顯著地增加化療藥物對癌細胞的敏感性，增強其對癌細胞的殺傷力，降低它的使用劑 量。本發(fā)明肽能對肺癌，肝癌，胃癌，結腸癌，直腸癌，食管癌，乳腺癌，白血病等多種癌細胞 起殺傷作用。本發(fā)明涉及的肽對正常細胞無明顯的毒性增強作用，且本發(fā)明涉及的肽可以 采用化學合成的方法制備得到，純度高，分子量小，特異性強，無免疫原性，安全可靠。本發(fā)明肽可以單獨用于癌癥的治療和預防且有良好的效果，該肽還可以和化療藥 物(如順鉬、紫杉醇等)合用，能選擇性增強化療藥物對腫瘤細胞的敏感性，明顯降低了化 療藥物的起效劑量，而對正常細胞的毒性作用小，從而降低了化療藥物的毒性和副作用。


圖1 SEQID NO. 5、SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8肽分別對人結腸癌細胞的抑制作
用結果。圖2 SEQID N0. 8肽對人肺癌細胞的抑制作用結果。圖3 SEQID NO. 1肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用結果。圖4 SEQID N0. 2肽、SEQ ID N0. 3肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用結果。圖5 SEQID N0. 4肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用結果。
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圖6 SEQ ID NO. 5肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用結果。圖7 SEQ ID NO. 6肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用結果。圖8 SEQ ID NO. 7肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用結果。圖9 SEQ ID NO. 8肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用結果。圖10 SEQ ID NO. 9肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用結果。圖11 SEQ ID N0. 5肽和奧沙利鉬合用對腫瘤細胞的作用結果。氨基酸序列
SEQIDN0.1IVHN
SEQIDNO.2IVHNGFRRGWM WGG
SEQIDNO.3IVHNGFRRGWM WAE
SEQIDNO.4IVHNGFRRGWM WVE
SEQIDNO.5MFIVHNELRRGWM WAE
SEQIDNO.6MFIVHNGFRRGWM WAE
SEQIDNO.7MFIVHNELRRGWM WVE
SEQIDNO.8MFIVHNELRRGWM WVT
SEQIDNO.9MFIVHNGFRRGEM WAE
SEQIDNO.10 MF]VHNEF RRGEM WAE
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術 人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。實施例1本發(fā)明多肽的合成1)實驗儀器與材料二甲基甲酰胺(DMF)，哌啶，樹脂，二氯甲烷(DCM)，Kaiser試劑盒，1_羥基苯并三 唑(HOBt)，四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，二異丙基乙胺(DIEA)，甲醇，各種氨基酸，多肽固 相合成管。2)實驗步驟稱量樹脂并投入到多肽固相合成管(以下簡稱反應器)中，加入適量的DMF溶脹 10分鐘。抽掉DMF進行Fmoc去保護反應，即加適量含20%哌啶的DMF溶液，充分攪拌，5分 鐘后抽掉溶液，重新加入20%哌啶的DMF溶液去保護7分鐘。抽掉去保護液，用DMF洗滌 樹脂4-5次，抽掉DMF，用DCM洗滌1_2次，從反應器中取少量樹脂(約5 IOmg)于試管 中，用乙醇洗滌2次，Kaiser法檢測并記錄顏色，準備投料，進入氨基酸縮合反應。分別按 照SEQ. 1-SEQ. 9肽的氨基酸序列順序取相應氨基酸、HOBt于適當?shù)娜萜髦校肈MF溶解，溶 解完全后加入DIEA活化5分鐘，加入稱量好的HBTU，冰水浴下溶解活化5分鐘，投入到反 應器中，攪拌反應。90分鐘后，從反應器中取少量樹脂于試管中，用乙醇洗滌2次，Kaiser 法檢測。抽掉反應器中的液體，用DMF洗滌2次，抽掉DMF，得到第一個氨基酸縮合后的肽 樹脂。對所得肽樹脂重復進行以上“Fmoc去保護——氨基酸縮合”反應步驟，至最后一個號為SEQ ID NO. 1-10的肽。采用上述方法，按照HIV48-57肽 的序列分別在SEQ IDN0. 1-10肽上繼續(xù)化學合成連接對應的氨基酸，得到綴合了 HIV48-57 的SEQ IDN0.1-10肽。反應完畢后，DCM洗滌樹脂2_3次，抽掉溶劑，加入甲醇攪拌收縮 (5min+5min)，抽掉甲醇，繼續(xù)抽干15-20min。反應器中取出合成完的肽樹脂，轉移到圓底燒 瓶，于干燥器中抽干，在室溫下裂解兩小時。將樹脂過濾后溶液在真空下濃縮凍干。粗肽使 用島津LC-6AD制備型反相HPLC純化，使用HPLC檢測純度> 90%。所得到的純肽使用質譜 (MS, electrospray)鑒定，SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 10肽的有關理化性狀如表1所示。表1 SEQ ID NO. I-SEQ ID NO. 10肽的有關理化性狀 實驗例1 MTT法檢測SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8肽分別對人結腸 癌細胞的抑制作用一、實驗方法將人結腸癌細胞株HCT_116(購于中國科學院上海細胞庫)懸浮于含10%熱滅活 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小 時后，分別加入順鉬、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8肽，其中每種藥物的濃度梯 度均為 90 μ mol/L、30 μ mol/L、10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、1. 1 μ mol/L、0 μ mol/L,每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %二、實驗結果由圖1可以看出，SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 7及SEQ ID NO. 8肽單獨作用于人結 腸癌HCT-116細胞時對細胞有明顯的抑制作用，且當藥物濃度小于ΙΟμπιοΙ/L，上述肽的作 用強于使用順鉬。說明本發(fā)明的肽單獨使用對腫瘤細胞有作用，可以作為治療和預防癌癥 的藥物。實驗例2MTT法檢測SEQ ID NO. 8肽對人肺癌細胞的抑制作用一、實驗方法將人肺癌細胞株A549(購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心)懸浮于含10%熱滅活胎 牛血清的F-12K培養(yǎng)液中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后， 分別加入順鉬和SEQ ID NO. 9肽，其中每種藥物的濃度梯度均為90ymol/L,30ymol/L, 10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、1. 1 μ mol/L、0 μ mol/L,每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后 每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使 紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100%二、實驗結果由圖2可以看出，SEQ ID N0. 8肽單獨作用于人肺癌A549細胞時對細胞有明顯的 抑制作用，說明本發(fā)明的肽單獨使用對腫瘤細胞有作用，可以作為治療和預防癌癥的藥物。實驗例3MTT法檢測SEQ ID NO. 1肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用一、實驗方法將人結腸癌細胞株HCT-116懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入順鉬、順鉬和 SEQ ID NO. 1所述肽混合液。其中每種混合液中順鉬濃度梯度為10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽終濃度均為 20 μ mol/L,每個濃度 設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %二、實驗結果由圖3可以看出，當順鉬與SEQ ID NO. 1合用，它們對HCT-116細胞的抑制作用明 顯強于單獨使用順鉬，說明本發(fā)明肽可以增加順鉬對人結腸癌細胞HCT-116的敏感性，增 強其對HCT-116細胞的抑制作用。實驗例4MTT法檢測SEQ ID N0. 2肽、SEQ ID N0. 3肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作 用一、實驗方法
將人結腸癌細胞株HCT-116懸浮于含10 %熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中， 以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入順鉬、順鉬和SEQ ID NO. 2所述肽混合液、順鉬和SEQ ID NO. 3所述肽混合液。其中每種混合液中順鉬濃度梯度 為 10ymol/L、3. 3ymol/L、l. Iymol/L、0. 37ymol/L、0. 12 μ mol/L、0 μ mol/L，各肽終濃度 均為20ymol/L，每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1， 4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀 570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %二、實驗結果由圖4可以看出，當順鉬與SEQ ID NO. 2合用以及順鉬與SEQ ID NO. 3合用，它們 對HCT-116細胞的抑制作用明顯強于單獨使用順鉬，說明本發(fā)明的SEQID N0. 2肽或SEQ ID N0. 3肽可以增加順鉬對人結腸癌細胞HCT-116的敏感性，增強其對HCT-116細胞的抑制作用。實驗例5MTT法檢測SEQ ID N0. 4肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用一、實驗方法將人結腸癌細胞株HCT-116懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入順鉬、順鉬和 SEQ ID N0. 4所述肽混合液。其中每種混合液中順鉬濃度梯度為10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽終濃度均為 20 μ mol/L,每個濃度 設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100%二、實驗結果由圖5可以看出，當順鉬與SEQ ID N0. 4合用，它們對HCT-116細胞的抑制作用明 顯強于單獨使用順鉬，說明本發(fā)明肽可以增加順鉬對人結腸癌細胞HCT-116的敏感性，增 強其對HCT-116細胞的抑制作用。實驗例6MTT法檢測SEQ ID N0. 5肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用一、實驗方法將人結腸癌細胞株HCT-116懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入順鉬、順鉬和 SEQ ID N0. 5所述肽混合液。其中每種混合液中順鉬濃度梯度為10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽終濃度均為 20 μ mol/L,每個濃度 設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100%二、實驗結果
由圖6可以看出，當順鉬與SEQ ID NO. 5合用，它們對HCT-116細胞的抑制作用明 顯強于單獨使用順鉬，說明本發(fā)明肽可以增加順鉬對人結腸癌細胞HCT-116的敏感性，增 強其對HCT-116細胞的抑制作用。實驗例7MTT法檢測SEQ ID NO. 6肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用一、實驗方法將人結腸癌細胞株HCT-116懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入順鉬、順鉬和 SEQ ID NO. 6所述肽混合液。其中每種混合液中順鉬濃度梯度為10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽終濃度均為 20 μ mol/L,每個濃度 設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %二、實驗結果由圖7可以看出，當順鉬與SEQ ID N0. 6合用，它們對HCT-116細胞的抑制作用明 顯強于單獨使用順鉬，說明本發(fā)明肽可以增加順鉬對人結腸癌細胞HCT-116的敏感性，增 強其對HCT-116細胞的抑制作用。實驗例8MTT法檢測SEQ ID N0. 7肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用一、實驗方法將人結腸癌細胞株HCT-116懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入順鉬、順鉬和 SEQ ID NO. 1所述肽混合液。其中每種混合液中順鉬濃度梯度為10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽終濃度均為 20 μ mol/L,每個濃度 設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %二、實驗結果由圖8可以看出，當順鉬與SEQ ID N0. 7合用，它們對HCT-116細胞的抑制作用明 顯強于單獨使用順鉬，說明本發(fā)明肽可以增加順鉬對人結腸癌細胞HCT-116的敏感性，增 強其對HCT-116細胞的抑制作用。 實驗例9MTT法檢測SEQ ID N0. 8肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用一、實驗方法將人結腸癌細胞株HCT-116懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入順鉬、順鉬和 SEQ ID N0. 8所述肽混合液。其中每種混合液中順鉬濃度梯度為10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽終濃度均為 20 μ mol/L,每個濃度 設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。
細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %二、實驗結果由圖9可以看出，當順鉬與SEQ ID NO. 8合用，它們對HCT-116細胞的抑制作用明 顯強于單獨使用順鉬，說明本發(fā)明肽可以增加順鉬對人結腸癌細胞HCT-116的敏感性，增 強其對HCT-116細胞的抑制作用。實驗例10MTT法檢測SEQ ID NO. 9肽和順鉬合用對腫瘤細胞的作用一、實驗方法將人結腸癌細胞株HCT-116懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入順鉬、順鉬和 SEQ ID NO. 9所述肽混合液。其中每種混合液中順鉬濃度梯度為10 μ mol/L、3. 3 μ mol/L、 1. 1 μ mol/L,0. 37 μ mol/L,0. 12 μ mol/L,0 μ mol/L,各肽終濃度均為 20 μ mol/L,每個濃度 設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ml) 20μ 1,4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔 加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。酶標儀570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100 %二、實驗結果由圖10可以看出，當順鉬與SEQ ID N0. 9合用，它們對HCT-116細胞的抑制作用 明顯強于單獨使用順鉬，說明本發(fā)明肽可以增加順鉬對人結腸癌細胞HCT-116的敏感性， 增強其對HCT-116細胞的抑制作用。實驗例IlMTT法檢測SEQ ID N0. 5肽和奧沙利鉬合用對腫瘤細胞的作用一、實驗方法將人結腸癌細胞株HCT-116懸浮于含10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液 中，以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。培養(yǎng)24小時后，分別加入奧沙利鉬、奧沙 利鉬和SEQ ID N0. 5所述肽混合液。其中每種混合液中奧沙利鉬濃度梯度為90 μ mol/L、 30ymol/LU0ymol/L、3. 3ymol/LU. Iymol/L、0. 37ymol/L、0. 12 μ mol/L、0 μ mol/L，各 肽終濃度均為20 μ mol/L,每個濃度設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)20小時后每孔加入MTT (5mg/ ml) 20 μ 1，4小時后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μ 1，震蕩10分鐘使紫色結晶充分溶解。 酶標儀570nm測定吸光度。細胞抑制率按下式計算細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值X 100%二、實驗結果由圖11可以看出，當奧沙利鉬與SEQ ID N0. 5合用，它們對HCT-116細胞的抑制作 用明顯強于單獨使用奧沙利鉬，說明本發(fā)明肽可以增加奧沙利鉬對人結腸癌細胞HCT-116 的敏感性，增強其對HCT-116細胞的抑制作用。實驗例12SEQ ID N0. 5肽體內抗腫瘤作用實驗用18-22克重的BALB/c種雄性小鼠(購于北京維通利華實驗動物技術有限 公司)。結腸癌26腫瘤組織(中國醫(yī)學科學院)與0.85%生理鹽水按1 10研磨成細 胞懸液，無菌操作在動物右側腋窩皮下接種腫瘤，每只動物接種0. 2ml。接種腫瘤24小時腔給藥，每天1次，共10次。順鉬經腹腔給藥，隔天1次，共5次；SEQ ID NO. 5肽和順鉬用0. 85%生理鹽水溶解，腹腔給藥量為0. 2ml/20g體重。實驗設對照組 (0. 85%生理鹽水)、SEQ ID NO. 5肽不同劑量組、順鉬組及SEQ ID NO. 5肽不同劑量與順鉬 聯(lián)合用藥組。接種腫瘤后11天結束實驗，稱體重，處死動物，剝取腫瘤，稱重量。按下式計 算腫瘤抑制率，并經統(tǒng)計學處理，判斷有無顯著性差異。腫瘤抑制率=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重X 100%藥 物聯(lián)合作用評價兩藥聯(lián)合指數(shù)(combine index,Cl)CI = AB/(AXB)。AB為兩藥聯(lián)合作用組的T/ C比值，A和B是藥物單獨作用的T/C比值(理論上當CI < 1時兩藥有協(xié)同作用)。實驗結果SEQ ID N0. 5肽和順鉬聯(lián)合用藥對結腸癌26顯示劑量依賴性腫瘤抑制作用。SEQ ID N0. 5肽劑量10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg與順鉬劑量lmg/kg聯(lián)合用藥均有不同程度的抑 瘤作用。SEQ ID N0. 5肽10mg/kg，20mg/kg，40mg/kg與順鉬lmg/kg聯(lián)合用藥的抑瘤率分別 為51%，61%和66% (P <0.01)；兩藥聯(lián)合指數(shù)(Cl)分別為0. 88，0. 73和0. 79，顯示有協(xié) 同作用，20mg/kg聯(lián)合用藥組顯示顯著協(xié)同作用(表2)。體內試驗結果表明，SEQ ID N0. 5肽和順鉬聯(lián)合用藥對小鼠移植性腫瘤結腸癌26 腫瘤生長有劑量依賴性抑制作用，SEQ ID N0. 5肽和順鉬聯(lián)合用藥顯示有協(xié)同作用。表2. SEQ ID N0. 5肽與順鉬聯(lián)合用藥對小鼠結腸癌26的作用
權利要求
一種具有殺傷癌癥細胞效應的肽，其特征在于，所述肽的氨基酸序列為SEQ ID NO.1所示。
2.一種具有殺傷癌癥細胞效應的肽，其特征在于，其通式為IVHNX1X2X3X4GX5X6WX7X8其中，I為異亮氨酸，V為纈氨酸，H為組氨酸，N為天冬酰胺，G為甘氨酸，W為色氨酸， Xm為可變的氨基酸殘基。
3.根據(jù)權利要求2所述的肽，其特征在于=X1是酸性氨基酸或酰胺類氨基酸，優(yōu)選為谷 氨酸或甘氨酸；x2是脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為亮氨酸、苯丙氨酸或纈氨酸；x3是極性氨基 酸殘基，優(yōu)選為谷氨酸或精氨酸-J4是極性氨基酸殘基，優(yōu)選為天冬氨酸或精氨酸；x5是芳 香類氨基酸、酸性氨基酸、酰胺類氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為色氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；x6是含硫氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為甲硫氨酸 或亮氨酸；x7是脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為纈氨酸、甘氨酸或丙氨酸；x8是羥基類氨基酸或 脂肪族氨基酸、酸性性氨基酸殘基，優(yōu)選為蘇氨酸、甘氨酸或谷氨酸。
4.根據(jù)權利要求2所述的肽，其特征在于，其氨基酸序列為SEQID NO. 2,SEQ ID NO. 3 或 SEQ ID NO. 4 所示。
5.一種具有殺傷癌癥細胞效應的肽，其特征在于其通式為MFIVHNX9X10RRGX11MWX12X13其中，M為蛋氨酸，F(xiàn)為苯丙氨酸，I為異亮氨酸，V為纈氨酸，H為組氨酸，N為天冬酰 胺，R為精氨酸，G為甘氨酸，W為色氨酸，X9_13為可變的氨基酸殘基。
6.根據(jù)權利要求5所述的肽，其特征在于X9是酸性或脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為谷氨酸或甘氨酸；X10是脂肪族或芳香族氨基酸殘基，優(yōu)選為苯丙氨酸、亮氨酸或纈氨酸；X11為芳香類氨 基酸、酸性氨基酸、酰胺類氨基酸或脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、 谷氨酸、谷氨酰胺或亮氨酸；X12是脂肪族氨基酸殘基，優(yōu)選為丙氨酸或纈氨酸；X13是羥基氨 基酸或酸性氨基酸殘基，優(yōu)選為蘇氨酸或谷氨酸。
7.根據(jù)權利要求5或6所述的肽，其特征在于，其氨基酸序列為SEQID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 或 SEQ ID NO. 10 所示。
8.編碼權利要求1、2、5所述肽的核苷酸序列。
9.一種表達載體，其特征在于含有至少一個拷貝的如權利要求8所述的核苷酸序列。
10.含有權利要求9所述表達載體的宿主細胞。
11.權利要求1、2、5所述的肽與能增加該肽在細胞中積累的制劑相綴合或混合所得到 的產品。
12.如權利要求11所述的產品，其特征在于所述的制劑是能協(xié)助肽穿透細胞膜的載體。
13.如權利要求12所述的產品，其特征在于所述的能協(xié)助肽穿透細胞膜的載體選自 下列富含精氨酸的肽Η ν48_57肽，F(xiàn)HV-外被35_49肽，HTLV-II Rex4^16肽或BMV gag7_25肽。
14.如權利要求12所述的產品，其特征在于所述制劑選自納米材料，脂質體或油性化 合物，或者由多種油性化合物所組成的混合物。
15.一種治療或預防癌癥的藥用組合物，其特征在于由治療或預防上有效量的權利2要求1、2、5所述的肽和藥學上可接受的輔料或載體所組成。
16.權利要求1、2、5所述的肽在制備治療或預防癌癥的藥物中的用途。
17.如權利要求16所述的用途，其特征在于所述癌癥選自肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、 直腸癌、食管癌、乳腺癌、白血病、膀胱癌、子宮頸癌或鼻咽癌。
18.權利要求12所述的產品在制備治療或預防癌癥的藥物中的用途。
19.權利要求1、2、5所述的肽在制備用于增強基因毒素選擇性地殺傷癌細胞的藥物中 的用途。
20.如權利要求19所述的用途，其特征在于所述基因毒素選自順鉬、奧沙利鉬、紫杉 醇、表柔比星、多柔比星、吡柔比星、柔紅霉素、絲裂霉素、達卡巴嗪、環(huán)磷酰胺、吉西他濱或 卡培他濱。
全文摘要
本發(fā)明公開了治療或預防癌癥的多肽或其衍生產品及應用。所述肽的氨基酸序列可以為SEQ ID NO.1所示，或選自以下兩個通式(1)IVHNX1X2X3X4GX5X6WX7X8；(2)MFIVHNX9X10RRGX11MWX12X13；本發(fā)明多肽在單獨使用時對癌細胞有著明顯的殺傷力，當其和臨床上常用的化療藥物如順鉑合用，能顯著地增加化療藥物對癌細胞的敏感性，增強其對癌細胞的殺傷力，降低使用劑量。本發(fā)明肽能對多種癌細胞起殺傷作用，對正常細胞無明顯的毒性增強作用，且本發(fā)明涉及的肽可以采用化學合成的方法制備得到，純度高，分子量小，特異性強，無免疫原性，安全可靠。
文檔編號A61K38/10GK101921313SQ20101014003
公開日2010年12月22日 申請日期2010年4月7日 優(yōu)先權日2010年4月7日
發(fā)明者熊俊宇, 陳建華, 陳彩虹, 黃毅 申請人:武漢凱泰新生物技術有限公司