專利名稱：秦川牛FoxO1基因單核苷酸多態(tài)性分子標記的檢測方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學領域，涉及以秦川牛的功能基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)作為分子遺傳標記、特別涉及一種秦川牛FoxOl基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法。
背景技術：
在肉牛育種中，人們期望通過對生長性狀密切相關，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。分子育種，即分子標記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection,MAS),該技術是借助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學和傳統(tǒng)遺傳育種相結合的方法，進行新品種選育?；蚨鄳B(tài)性是指不同物種或者同一物種內的不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失以及重復序列拷貝數(shù)的變化。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是由美國麻省理工學院的人類基因組研究中心的學者Lander(1996)提出的一類遺傳標記系統(tǒng)，就是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。SNP是基因組中存在的一種數(shù)量非常豐富的變異形式，占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%以上。SNP與罕見的變異不同，通常在種群中頻率等于或小于I %的此種變異被稱為突變，而只有頻率大于I %時才被稱為單核苷酸多態(tài)性。它的變異形式有:顛換、轉換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型的堿基變異的SNPs約占2/3。根據(jù)基因組中單核苷酸多態(tài)性產生的位置，可分為以下3類:基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性(Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周邊單核昔酸多態(tài)性(Perigenic SNPs,pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(Intergenic SNPs, iSNPs)。研究表明，位于編碼區(qū)內的cSNP比較少，由于它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此，編碼區(qū)內的cSNP的研究更受關注?；蚓幋a區(qū)內的cSNP又可分為2種:一種是編碼區(qū)內的同義cSNP (Synonymous cSNP),即SNP所致編碼序列的改變并不會影響其所翻譯的蛋白質中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區(qū)內的非同義cSNP (Non-SynonymouscSNP)，即堿基序列的改變將導致編碼氨基酸的改變，從而導致蛋白質中氨基酸序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。由于SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被 簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要采用幾種不同的路線來發(fā)現(xiàn)SNPs:即DNA序列測定方法、聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)(Polymerase ChainReaction-Single Strand Conformation Polymorphism, PCR-SSCP)與 DNA 測序結合法、等位特異性PCR(Allele Specific PCR，AS-PCR)方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術人員和經驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用于生產實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也并非理想的SNP檢測手段；AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術檢測SNP位點，需要平板讀數(shù)儀、基因芯片、微球陣列技術和質譜儀等檢測平臺，對于一般的分子實驗室來說可實施性不強。本研究檢測基因SNPs所使用的限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈反應(Restriction Fragment Length Polymorphism-PoIymerase Chain Reaction, RFLP-PCR)方法是一種檢測SNP的有效技術，在發(fā)現(xiàn)SNP位點后設計上下游引物用限制性內切酶進行切割，然后進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑒別SNP位點。RFLP-PCR方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。轉錄因子是控制基因表達的一類蛋白質分子，通過調節(jié)靶基因的表達對機體的發(fā)育和代謝等起重要調控作用。叉頭轉錄因子(FoxOI)是FoxO亞家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員。FoxOl基因在脂肪細胞分化信號通路與轉錄級聯(lián)反應中具有重要作用，其與脂肪細胞代謝及成肌細胞分化有很大關系，能促進脂肪細胞的分化、負調控骨骼肌的生成和I型肌纖維基因的表達，且對肝細胞、胰島β細胞及脂肪細胞中胰島素作用的發(fā)揮起重要作用。為此，F(xiàn)oxOl基因遺傳變異或SNP位點在動物生產實踐中對肌肉脂肪性狀、生長發(fā)育性狀具有重要的作用。關于動物FoxOl基因遺傳變異的研究國內外多見于人、鼠等動物，而少見秦川牛FoxOl基因遺傳變異或SNP研究的報道。由于目前中`國秦川牛FoxOl基因遺傳變異領域的研究匱乏，使該基因位點的功能研究及該基因遺傳變異與經濟性狀(如:產肉、生長發(fā)育等性狀)關聯(lián)的研究成為空白。

發(fā)明內容
本發(fā)明解決的問題在于提供秦川牛FoxOl基因單核苷酸多態(tài)性檢測方法及其應用，利用PCR-RFLP方法針對其基因位點上的錯義突變可能導致編碼蛋白構象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，提前淘汰產生錯義突變的個體，加快具有優(yōu)質經濟性狀黃牛種
群的建立。本發(fā)明通過以下技術方案來實現(xiàn):一種秦川牛FoxOl基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因單核苷酸多態(tài)性包括:秦川牛FoxOl基因第178132位為G或A的單核苷酸多態(tài)性。上述秦川牛FoxOl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法為:
以包含F(xiàn)oxOl基因的待測秦)11牛全基因組DNA為模板，以弓丨物對P為引物，PCR擴增秦川牛FoxOl基因；用限制性內切酶HhaI消化PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結果鑒定秦川牛FoxOl基因第178132位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為:上游 引物:5，-GACTCTCCTCCGCACAACGAC-3，2Int；下游引物:5’-GTCCAAGTCACTGGGGAGCTTC-3，22nt。所述的PCR擴增反應程序為:94°C 預變性 5min ;94°C變性 30s，68°C退火 30s，每個循環(huán)-1°C，72°C 延伸 30s，18個循環(huán)；941:變性308，501:退火30s，72。。延伸30s, 20個循環(huán)；72°C延伸IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度為3%的瓊脂糖凝膠電泳。所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果FoxOl基因第178132位堿基多態(tài)性為:GG型表現(xiàn):316bp 和 89bp ；GA 型表現(xiàn):405bp、316bp 和 89bp ；AA 型表現(xiàn):405bp。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果:本發(fā)明利用RFLP-PCR方法對黃牛FoxOl基因第178132位點上的錯義突變可能產生編碼蛋白構象發(fā)生變化的單核苷酸多態(tài)性進行檢測，當位點由G突變?yōu)锳時，在轉錄過程相應位置的蛋白質編碼氨基酸發(fā)生改變(肽鏈578位的丙氨酸變蘇氨酸，Ala 578Thr)，使具有重要生理功能的叉頭轉錄因子FoxOl基因所編碼蛋白的空間二、三級構型發(fā)生變化，以至影響蛋白的生物學功能。本發(fā)明公開了與秦川牛生長性狀相關的功能基因FoxOl的核苷酸多態(tài)性，該核苷酸多態(tài)性能夠作為一個分子遺傳標記，利用標記位點信息和數(shù)量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。針對上述FoxOl基因的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其檢測方法，通過設計特定的PCR引物擴增片段，能夠用RFLP-PCR方法簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明對FoxOl基因的SNP進行了基因分型和基因頻率分析，以及與秦川牛生長性狀之間進行了關聯(lián)分析；結果顯示FoxOl基因的核苷酸多態(tài)位點能夠成為分子遺傳輔助育種的標記。本發(fā)明提供的檢測方法為FoxOl基因的SNP與生長性狀關系的建立奠定了基礎，以便用于中國秦川牛生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的秦川牛種群。


圖1為秦川牛血樣基因組DNA電泳檢測圖；圖2為秦川牛FoxOl基因PCR擴增的405bp片段的電泳圖；圖3為秦川牛FoxOl基因第3外顯子405bp PCR產物的HhaI酶切電泳檢測FoxOl基因多態(tài)性的電泳結果圖；泳道2，4:AA基因型個體(405bp);泳道1:GA基因型個體(405bp，316bp，89bp);泳道3，5:GG 基因型個體(316bp，89bp) ；M =Marker (600bp, 500bp,400bp, 300bp, 200bp, IOObp)另外，由于89bp較小，故在瓊脂糖電泳分析中不可見,但405bp和316bp片段能鑒別GA型和GG型；
圖4為秦川牛FoxOl基因178132位SNP的不同基因型測序峰圖。
具體實施例方式本發(fā)明以FoxOl基因保守序列設計引物擴增FoxOl基因第3外顯子405bp片段，以秦川牛基因組為模板，進行PCR擴增，擴增產物經測序后尋找該擴增片段的單核苷酸多態(tài)；針對發(fā)現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)進行性狀關聯(lián)性分析，并提供其檢測方法，使得FoxOl基因的核苷酸多態(tài)性成為一種能夠快速、方便檢測的分子遺傳標記，為加快建立具有優(yōu)質經濟性狀的秦川牛種群提供依據(jù)。a、秦川牛FoxOl基因多態(tài)性的檢測1、秦川牛血樣的采集及處理取秦川牛血樣10mL，加入0.5mol/L的EDTA 500 μ L抗凝，緩慢顛倒3次后放入冰盒，-80°C保存?zhèn)溆?。本發(fā)明采用秦川牛品種，具體如表I所示。表I秦川牛樣品來源表
權利要求
1.一種秦川牛FoxOl基因的單核苷酸多態(tài)性，其特征在于，其基因單核苷酸多態(tài)性包括: 秦川牛FoxOl基因第178132位為G或A的單核苷酸多態(tài)性。
2.一種秦川牛FoxOl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: 以包含F(xiàn)oxOl基因的待測秦)11牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增秦川牛FoxOl基因；用限制性內切酶HhaI消化PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結果鑒定秦川牛FoxOl基因第178132位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為: 上游引物:5 ’ -GACTCTCCTCCGCACAACGAC-3， 2 Int ; 下游引物:5’ -GTCCAAGTCACTGGGGAGCTTC-3’ 22nt。
3.如權利要求2所述的秦川牛FoxOl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的PCR擴增反應程序為: 94°C預變性5min ;94°C變性30s，68。。退火30s，每個循環(huán)_1°C，72°C延伸30s, 18個循環(huán)；94°C變性 30s, 50°C退火 30s, 72°C延伸 30s, 20 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
4.如權利要求2所述的秦川牛FoxOl基因的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法，其特征在于，所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度為3%。
5.如權利要求2所述的秦川牛FoxOl基因的單核苷酸多態(tài) 性的檢測方法，其特征在于，所述的根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結果FoxOl基因第178132位堿基多態(tài)性為:GG型表現(xiàn):316bp和 89bp ；GA 型表現(xiàn):405bp、316bp 和 89bp ；AA 型表現(xiàn):405bp。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃牛FoxO1基因的單核苷酸多態(tài)性及其檢測方法，其基因單核苷酸多態(tài)性包括以包含F(xiàn)oxO1基因的待測秦川牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增秦川牛FoxO1基因；用限制性內切酶HhaI消化PCR擴增產物之后，再對酶切后的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)電泳結果鑒定秦川牛FoxO1基因第178132位的堿基多態(tài)性。由于FoxO1基因對動物肌肉脂肪性狀、生長發(fā)育性狀具有重要作用。所以，該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與秦川牛生長性狀密切相關的分子遺傳標記，以用于秦川牛的輔助選擇和分子育種，加快秦川牛良種繁育速度。
文檔編號C12Q1/68GK103233001SQ20121021046
公開日2013年8月7日 申請日期2012年6月25日 優(yōu)先權日2012年6月25日
發(fā)明者陳宏 , 孫雨佳, 郭文嬌, 潘虹, 薛璟, 藍賢勇, 雷初朝 申請人:西北農林科技大學