專利名稱：利用重組大腸桿菌高效表達Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脫羧酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
利用重組大腸桿菌高效表達Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脫羧酶屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
α -乙酰乳酸脫羧酶(a-acetolactate decarboxylase,簡稱為ALDC)能催化雙乙酰的前體物α -乙酰乳酸脫羧形成乙偶姻，避免雙乙酰的生成，它可以縮短啤酒熟化周期，提高生產(chǎn)效率，對啤酒工業(yè)來說極有經(jīng)濟價值。α-乙酰乳酸脫羧酶主要應(yīng)用于啤酒釀造工業(yè)。在啤酒酵母代謝過程中，α-乙酰乳酸是亮氨酸一纈氨酸生物合成過程的中間產(chǎn)物。大部分α-乙酰乳酸在酵母細胞內(nèi)代謝形成纈氨酸和亮氨酸，小部分滲漏到細胞外，進入發(fā)酵液中，在胞外經(jīng)非酶氧化生成雙乙酰。在啤酒釀造過程中，雙乙酰是影響啤酒質(zhì)量的關(guān)鍵因素，也是決定啤酒成熟與否的重要指標(biāo)，雖然雙乙酰賦予了啤酒特殊的風(fēng)味，但是其口味閾值比較低(O. 02 O. 10mg/L)，當(dāng)含量超過O. 15mg/L時就會給啤酒帶來不愉快的餿飯味，因此在整個發(fā)酵過程中嚴格控制雙乙酰的產(chǎn)生量是至關(guān)重要的。α-乙酰乳酸脫羧酶能將啤酒生產(chǎn)過程中雙乙酰的前驅(qū)物質(zhì)α -乙酰乳酸迅速分解為乙偶姻，從而快速地降低啤酒中雙乙酰的含量。釀酒酵母不含ALDC，很多細菌中含有該酶。Godtfredsen等測試的34個屬79個種(325株)細菌中，有ALDC活性的占20個屬40個種。α -乙酰乳酸脫羧酶首次于1952年從產(chǎn)氣腸桿菌中分離得到，之后有關(guān)該酶在生物界中的分布及菌種選育得到了廣泛研究。a-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)存在于多種細菌中，它參與α -乙酰乳酸代謝，將α -乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為乙偶姻。目前還未在真菌、海藻和原生動物等真核生物中發(fā)現(xiàn)該酶的存在。細菌中天然存在的ALDC產(chǎn)量很低，要想將該酶應(yīng)用于啤酒工業(yè)，研究ALDC的分子結(jié)構(gòu)以及ALDC基因，進行基因的克隆和表達，提高酶的產(chǎn)量，是一種必然的選擇。隨著對ALDC分子水平研究的深入，α -乙酰乳酸脫羧酶基因已經(jīng)從多種細菌中克隆得到，并在大腸桿菌、枯草桿菌和酵母中獲得了不同程度的表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要研究內(nèi)容本發(fā)明利用分子技術(shù)克隆了來自金黃色葡萄球菌的α -乙酰乳酸脫羧酶基因在本發(fā)明中簡稱saald,構(gòu)建重組表達載體pET-28a(+)_saald,并將其轉(zhuǎn)化E. coliBL21，成功構(gòu)建了基因工程菌pET-28a-saald/BL21，利用親和層析法對表達的ALDC進行了純化，得到了酶活可達到469. 85U/mg的純酶液，并對該酶的酶學(xué)性質(zhì)進行了研究，以便為以后該酶的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。將發(fā)酵獲得的α-乙酰乳酸脫羧酶運用在啤酒發(fā)酵中，初步探討了其降低雙乙酰含量的能力。本發(fā)明的技術(shù)方案La-乙酰乳酸脫羧酶引物設(shè)計
根據(jù)NCBI金黃色葡萄球菌的全基因組核酸序列中saald基因序列，設(shè)計α -乙酰乳酸脫羧酶的PCR引物Pl和Ρ2。Pl :5，-ATCGAATTCATGACGAATGTCTTGTATC-3’ (EcoR I)Ρ2 :5’ -TGACTGCGGCCGCCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’ (Not I)2.重組菌的構(gòu)建從金黃色葡萄球菌中抽提染色體DNA作為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的引物、PCR擴增條件和擴增體系進行PCR。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回收，電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度。采用下共同的限制性內(nèi)切酶對載體pET-28a和純化的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，電泳檢驗酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行純化和回收。將載體和PCR產(chǎn)物 用T4DNA連接酶過夜連接。取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli BL21的感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化，挑取陽性轉(zhuǎn)化子于IOmL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗證正確后，將菌液加 入甘油于_40°C冰箱保存。3.重組菌α -乙酰乳酸脫羧酶的表達純化取凍管保藏的菌種接入IOmL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日轉(zhuǎn)接，誘導(dǎo)表達，將誘導(dǎo)液通過親和層析純化得到純酶液。粗酶液蛋白質(zhì)含量采用Bradford法測定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。經(jīng)測定粗酶液比酶活是56U/mg，純酶液比酶活是469. 85U/mg。純酶液進行酶學(xué)性質(zhì)的初步研究。4. α -乙酰乳酸脫羧酶在啤酒發(fā)酵中的應(yīng)用將發(fā)酵獲得的α -乙酰乳酸脫羧酶運用在啤酒發(fā)酵中，初步探討了其降低雙乙酰含量的能力。在冷麥汁中加入按照O. 05mg/L的量添加所得的純酶，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中雙乙酰的峰值比不添加的情況下明顯降低，且加速了雙乙酰的還原，使發(fā)酵周期縮短了約3天。啤酒發(fā)酵結(jié)束后，其中的乙酰乳酸幾乎完全生成雙乙酰而得到還原，這樣就有效避免了成品啤酒中雙乙酰的回升現(xiàn)象。本發(fā)明的有益效果α -乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)能催化雙乙酰的前體物α _乙酰乳酸脫羧形成乙偶姻，避免雙乙酰的生成，它可以縮短啤酒熟化周期，提高生產(chǎn)效率，對啤酒工業(yè)來說極有經(jīng)濟價值。鑒于α-乙酰乳酸脫羧酶的應(yīng)用價值，獲得該酶的高表達和高酶活一直以來是研究的熱點。因此，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建高表達載體達到α-乙酰乳酸脫羧酶的高效表達和比較高的酶活水平具有重要意義。以本實驗室保藏的一株金黃色葡萄球菌為出發(fā)菌株，測得較為可觀的α -乙酰乳酸脫羧酶活性，克隆其基因saald并在大腸桿菌中得以高效表達。此外，通過研究其酶學(xué)性質(zhì)也為ALDC的應(yīng)用打下了良好的理論基礎(chǔ)。


圖I 質(zhì)粒 pET-28a_saald 的酶切驗證。I :DNA Marker λ -Hind III ；2 pET-28a_saald/EcoR I+Not I；3 :pET-28a_saald/EcoR I；4 :pET_28a/EcoR I；5 saald/EcoR I ；6 DNA Marker :DL_2000圖2a-乙酰乳酸脫羧酶的表達與純化。l:E.coli BL21 ；2 purified ALDC ；
3E.coli BL21 withrecomb inant plasmid pET28a_saaldD/BL21with IPTG ；4 E. coli BL21with recombinant plasmid pET28a-saald/BL2lwithout IPTG ；5 ProteinMarker(kDa)
具體實施例方式實施例I :重組質(zhì)粒pET-28a_saald的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化[I]從金黃色葡萄球菌抽提染色體DNA作為模板，抽提方法如下用接種環(huán)從新鮮的金黃色葡萄球平板上挑取單菌落懸浮于O. 5mL的滅菌雙蒸水中，沸水煮5-10min，8000r/min離心lOmin，取上清裝入一只干凈的I. 5mL離心管中，_20°C冰箱保存?zhèn)溆?。[2]以金黃色葡萄球菌總DNA為模板，利用實施例I提供的引物做PCR擴增，擴增條件為94 V預(yù)變性，5min，一個循環(huán);94 V變性，Imin，56 °C退火，Imin，72 °C延伸，lmin30s，30個循環(huán);72°C，lOmin，一個循環(huán);15°C，lOmin，一個循環(huán)。PCR擴增體系模板(金黃色葡萄球菌染色體DNA)2y L，上下游引物各(λ 5μ L，dNTP Mix 4yL,IOXEx TaqBuffer 5 μ L，滅菌的雙蒸水37 μ L，Ex Taq DNA聚合酶I μ L。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回收，電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度?；厥债a(chǎn)物存放在I. 5mL的離心管中，-20°C 冰箱保存?zhèn)溆?。[3]構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T_saald，導(dǎo)入感受態(tài)E. coli JM109。連接體系PCR膠回收產(chǎn)物4. 8L，solution I 5L，pMD18_T質(zhì)粒0. 5L，16°C過夜連接。轉(zhuǎn)化方法將連接好的10L pMD18-T-saald加入到 1201 感受態(tài)E. coil JM109 中，于冰上放置45min，42°C熱擊90s，放置冰上2min，加入800 I LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)lh，離心，倒掉大部分上清液，留150L與沉淀混勻，涂布到氨芐青霉素平板(Amp+LB)上，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)9h左右，挑去平板上的陽性菌落到IOml液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切驗證連接成功后，將菌液加入終濃度17% (w/v)的甘油，_40°C冰箱保藏。[4]將[3]中提取的質(zhì)粒和質(zhì)粒pET_28a分別用EcoR I和Not I進行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收后進行連接，連接體系目的基因酶切產(chǎn)物7. 7L，pET-28a酶切產(chǎn)物0. 3L，T4DNA連接酶buffer 1L，T4DNA連接酶1L，16°C過夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pET-28a-saald轉(zhuǎn)化到感受態(tài)E. coil BL21，轉(zhuǎn)化方法參照實施例2[3]，用卡那霉素平板(Kana+LB)挑取陽性菌落。37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗證正確后加入甘油，_20°C冰箱保藏備用。實施例2 : α -乙酰乳酸脫羧酶表達及酶活測定[I]將實施例I [4]凍管保藏的菌種接入IOmL液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日按I %的接種量轉(zhuǎn)接，37°C培養(yǎng)至OD6c 約0.6 0.8時加入終濃度為ImmoI/L的IPTG，置于30°C搖床過夜誘導(dǎo)表達。取所得菌液ImL于1.5mL離心管中，8000r/min離心2min，倒掉上清，加入100L pH6. 8的Tris-HCl緩沖液將菌體混勻，加入30L蛋白膠上樣緩沖液，沸水浴30min，使蛋白質(zhì)變性，8000r/min離心2min，取上清進行SDS-PAGE檢測，其中SDS-PAGE使用5%的分離膠和15%的濃縮膠，采用不連續(xù)垂直電泳，用考馬斯亮藍R250染色，以含有空載質(zhì)粒pET-28a的E. coil BL21做空白對照。[2]將過夜誘導(dǎo)表達的菌液于8000r/min，4°C離心lOmin，用ρΗ6· O的MES I緩沖液(2-馬啉乙磺酸 0. 05mol/L, brij-350. 05%, NaCl 0. 6mol/L, ρΗ6· 0)洗滌兩次，最后用ρΗ6. O的MESI緩沖液懸浮菌體，超聲波破碎(300W，工作IS停3S，工作4min)，10000r/min離心30min，上清即為粗酶液。采用400L的酶活測定體系(200L酶液，200L底物)，30°C反應(yīng)lOmin，用4. 6mL顯色劑終止，30°C顯色30min。測得粗酶液的比酶活為56U/mg，其中，酶液的蛋白含量采用Bradford法測定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。實施例3 : α -乙酰乳酸脫羧酶的純化及酶學(xué)性質(zhì)[I]粗酶液經(jīng)Ni-NTA柱純化后得到純的ALDC，純化后的純酶液的比酶活是469. 85U/mg,純化倍數(shù)達8. 36倍，回收率為87. 65 %。[2]最適pH及pH穩(wěn)定性用底物緩沖液MES II配制不同pH(2 12)的底物溶液，將酶液用MES I稀釋一定倍數(shù)，然后將不同pH的底物380 μ L與稀釋好的酶液20 μ L反應(yīng)，測定不同PH條件下酶的活性，并進行比較，確定酶反應(yīng)的最適pH值。配制不同pH(5 10)的酶活測定緩沖液MES I，用它們來稀釋酶液得到不同pH的酶液。讓酶處于不同pH環(huán)境中，每隔一定時間取樣，測定酶的剩余活性，觀察該酶在不同PH下的穩(wěn)定性，反應(yīng)體系為20 μ L 酶液，180 μ LMES I，200 μ L 底物。[3]最適溫度和熱穩(wěn)定性在20°C 80°C設(shè)置11個反應(yīng)溫度20°C、25°C、30°C、 35 V、40°C、45 V、50°C、55 V、60°C、70 V、80°C，測定不同溫度條件下酶的活力，確定酶合適的反應(yīng)溫度。將適當(dāng)稀釋的酶液分別在-20°C、(TC、30°C、35°C、45°C、55°C、65°C保溫，每隔2h取樣，測定不同溫度下酶的剩余活力，從而研究該酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。[4]不同金屬離子以及EDTA對酶活的影響分別在反應(yīng)體系中加入終濃度為Immol /I,的 Ca2+、Sn2+、Ni+、Zn2+、Li+、Mn2+、K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+離子以及 EDTA,以不添加任何金屬離子的酶活為100 %，研究各金屬離子對酶活的影響。[5]Km值及Vmax的測定配置不同濃度的底物，進行酶促反應(yīng)，反應(yīng)時間控制在2min。采用雙倒數(shù)作圖法確定ALDC的Km及Vmax值。其中反應(yīng)最適pH為6. 0，在pH值7. 0-9. O的范圍內(nèi)溫度，反應(yīng)最適溫度為45°C，在35°C以下酶的穩(wěn)定性較好。Sn2+、Zn2+對ALDC有明顯的抑制作用，其中Zn2+和Fe3+的添加幾乎使酶完全失去活性。而Ca2+、K+、Mg2+和EDTA對酶的影響非常小。沒有發(fā)現(xiàn)對該酶有明顯激活作用的金屬離子。酶動力學(xué)參數(shù)以α-乙酰乳酸為底物的Km值為0.0177mmol/L，Vmax 為 2. 06 μ mol/ (ml,/mi η) 0
權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒pET-28a_saald,其特征是以Staphylococcus aureus基因組DNA為模板，擴增得到編碼α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)的基因，將其克隆到大腸桿菌表達載體pET-28a 上，獲得重組質(zhì)粒 pET-28a-saald。
2.權(quán)利要求I所述的基因saald的擴增方法，其特征是基因的克隆根據(jù)saald基因的特異性設(shè)計引物，Pl :5’ -ATCGAATTCATGACGAATGTCTTGTATC-3> (EcoR I) ；P2 :5’ -TGACTGCGGCCGCCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3，(Not I);擴增條件94°C預(yù)變性，5min，一個循環(huán)；94°C變性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，lmin30s，30 個循環(huán)；72°C,10min, 一個循環(huán)；15°C,IOmin, 一個循環(huán)。PCR擴增體系金黃色葡萄球菌染色體DNA 2 μ L，上下游引物各O. 5 μ L，dNTP Mix 4 μ L，10 X Ex Taq Buffer 5 μ L，滅菌的雙蒸水 37 μ L，Ex Taq DNA 聚合酶 I μ L，擴增saald基因，大小為705bp。
3.一種高效表達Staphyloccocus aureus α -乙酰乳酸脫羧酶的重組菌Ε· coliBL21/pET-28a_saald,其特征是構(gòu)建方法如下 (1)將含saald基因的重組質(zhì)粒pET-28a_saald通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，在含卡那霉素的抗性平板上挑取抗性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切驗證，得到重組菌E.coliBL21/pET-28a_saald ； (2)對上述重組菌進行誘導(dǎo)表達，超聲波破碎后測定ALDC的酶活力，并與對照菌株進行比較，重組菌E. coli BL21/pET-28a-saald的酶活力相對較高，經(jīng)測定其粗酶的比酶活可達 56U/mg。
4.如權(quán)利要求3所述的重組菌，其特征在于該菌高效表達的α-乙酰乳酸脫羧酶具有如下酶學(xué)性質(zhì)，該酶的最適反應(yīng)PH為6. O ;反應(yīng)最適溫度為45°C，在35°C以下酶的穩(wěn)定性較好；Sn2+、Zn2+對ALDC有明顯的抑制作用，其中Zn2+和Fe3+的添加幾乎使酶完全失去活性，而Ca2+、K+、Mg2+和EDTA對酶的影響非常小，沒有發(fā)現(xiàn)對該酶有明顯激活作用的金屬離子；酶動力學(xué)參數(shù)以α -乙酰乳酸為底物的Km值為O. 0177mmol/L,Vmax為2. 06 μ mol/(mL/min)。
全文摘要
以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，擴增得到編碼α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC)的基因saald，將其克隆到大腸桿菌表達載體pET-28a上，在E.coli BL21中用IPTG誘導(dǎo)表達，利用表達載體pET-28a上的6·His-Tag標(biāo)簽，選用Ni柱親和層析純化表達具有活性的α-乙酰乳酸脫羧酶。粗酶液的比酶活為56U/mg，純化后比酶活達到469.85U/mg，純化倍數(shù)達8.36倍，回收率為87.65％。
文檔編號C12N9/88GK102816787SQ201210210440
公開日2012年12月12日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者饒志明, 李靜靜, 張顯, 徐美娟 申請人:江南大學(xué)