一種與中國(guó)荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性相關(guān)的snp分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子標(biāo)記，具體地說(shuō)，涉及一種與中國(guó)荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性 相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳房炎主要是由于病原微生物通過(guò)奶牛的乳頭導(dǎo)管或乳頭管以及乳房皮膚外傷 等因素進(jìn)入奶牛的乳房組織，并在組織內(nèi)大量繁殖，引起乳腺發(fā)生炎癥反應(yīng)。另外，飼養(yǎng)管 理時(shí)奶牛的乳腺組織受到機(jī)械刺激或者物理和化學(xué)性損傷也會(huì)引起奶牛乳房炎。
[0003] 金葡菌產(chǎn)生毒素可以破壞細(xì)胞膜，并且可以直接毀壞組織，毒素轉(zhuǎn)移到管道系統(tǒng)， 毀壞泌乳細(xì)胞。金葡菌引起的乳房炎對(duì)奶牛群產(chǎn)生的不利影響包括牛奶產(chǎn)量和品質(zhì)的降低 等，還會(huì)影響奶牛正常生理功能并延長(zhǎng)產(chǎn)后發(fā)情時(shí)間，嚴(yán)重的會(huì)造成奶牛過(guò)早淘汰增加牛 群更替成本。
[0004] 又有前人發(fā)現(xiàn)被有40%被金葡菌感染的奶牛的SCC反而低于未感染時(shí)，因此不能 準(zhǔn)確地?cái)喽ǜ叩蚐CC與金葡菌感染之間的關(guān)系，這也導(dǎo)致在奶牛生產(chǎn)中不能正確排除感染 金葡菌的奶牛。
[0005] 隨著分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)和數(shù)量遺傳學(xué)的發(fā)展，分子遺傳標(biāo)記和標(biāo)記輔 助選擇被廣泛地應(yīng)用到畜禽育種中，并取得了巨大的成就。Snapshot測(cè)序技術(shù)是一種基于 熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，也稱(chēng)小測(cè)序，主要針對(duì)中等通量的SNP分型項(xiàng)目，其 主要原理是將測(cè)序酶、四種熒光標(biāo)記的ddNTP、緊鄰多態(tài)位點(diǎn)的延伸引物和PCR產(chǎn)物模板按 一定體系混合，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)峰的顏色可以得知參與反應(yīng) 的堿基種內(nèi)，從而判斷樣本在該位點(diǎn)的基因型。該方法具有分型準(zhǔn)確、通量高、不受SNP位 點(diǎn)多態(tài)性特性限制和樣本個(gè)數(shù)限制等優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顆粒復(fù)合體9 (TRAPPC9, trafficking protein particle complex 9)基 因是人常染色體隱性精神發(fā)育遲滯智力障礙相關(guān)的基因，其編碼的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顆粒復(fù)合 體9參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的囊泡轉(zhuǎn)移和神經(jīng)細(xì)胞的分化，其編碼的蛋白也叫做NIBP (NIK and IKK β-binding protein)，參與膜泡運(yùn)輸過(guò)程，同時(shí)具有增強(qiáng)TNF-α活化NF-κ B信號(hào) 通路的功能。NF-κ B是重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控大量基因表達(dá)，在細(xì)胞生存、增殖、分化 和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。目前關(guān)于TRAPPC9基因?qū)τ诮鹌暇榉垦卓剐缘?影響還沒(méi)有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種與中國(guó)荷斯坦奶牛金 葡菌乳房炎抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先提供了一種與中國(guó)荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎 抗性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記來(lái)自奶牛TRAPPC9基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，第165bp位點(diǎn)處的堿基為T(mén)或C。
[0009] 本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增所述SNP標(biāo)記的引物對(duì)，所述引物對(duì)中正向引物F如SEQ ID No. 2所示、反向引物R如SEQ ID No. 3所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)所述SNP標(biāo)記的試劑盒，所述試劑盒含有正向引物F如 SEQ ID No. 2所示、反向引物R如SEQ ID No. 3所示和分型延伸引物如SEQ ID No. 4所示。
[0011] 進(jìn)一步地，所述試劑盒包括Premix TaqTM、ExoI、FastAP、ExoI buffer和 Snapshot Mix〇
[0012] 本發(fā)明還提供了所述SNP標(biāo)記在鑒定中國(guó)荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性?xún)?yōu)勢(shì)品 系中的應(yīng)用。
[0013] 具體地，包括如下步驟：
[0014] (1)提取待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛的基因組DNA ;
[0015] (2)以待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛的基因組DNA為模版，利用擴(kuò)增引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò) 增出中國(guó)荷斯坦奶牛TRAPPC9基因345bp片段；
[0016] (3)檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列中165bp處的堿基為C，則待測(cè)中國(guó)荷 斯坦奶牛屬于金葡菌乳房炎抗性高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品系。
[0017] 進(jìn)一步地，步驟（2)中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以15 μ 1計(jì)為：模板DNA 1 μ 1，引 物混合 〇· 151yl，dNTP mix 0.3yl，Taq DNA 聚合酶 0.3yl，10XPCR 反應(yīng)緩沖液 1·5μ1， MgCl2L 5 μ 1，ddH20 10. 25 μ 1。
[0018] F :5' -TTTATCCTGACGATGTCTGCC-3'
[0019] R :5' -CTGCTGTGAGCCCAAAACTAT-3' ；
[0020] PCR 反應(yīng)的條件為：95°C 5 分鐘；94°C 15 秒，60°C 15 秒，72°C 30 秒，72°C 30 秒，11 個(gè)循環(huán)；94°C 15秒，54°C 15秒，72°C 30秒，24個(gè)循環(huán)；72°C 3分鐘。
[0021] 本發(fā)明還提供了所述SNP標(biāo)記在中國(guó)荷斯坦奶牛分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0022] 具體地，包括如下步驟：
[0023] (1)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和測(cè)序技術(shù)篩選到與中國(guó)荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性 相關(guān)的SNP標(biāo)記；
[0024] (2)檢測(cè)待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛的基因型；
[0025] (3)根據(jù)基因型進(jìn)行金葡菌乳房炎抗性高的中國(guó)荷斯坦奶牛優(yōu)勢(shì)品系的選育。
[0026] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0027] 本發(fā)明對(duì)中國(guó)荷斯坦奶牛的TRAPPC9基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并對(duì)該SNP 分子標(biāo)記與奶牛的金葡菌乳房炎抗性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，分析發(fā)現(xiàn)，CC基因型個(gè)體的金葡菌乳 房炎抗性顯著高于TT基因型個(gè)體（P〈0. 05)，GG基因型個(gè)體的體細(xì)胞數(shù)顯著低于AA基因型 個(gè)體（P〈0. 01)。該多態(tài)位點(diǎn)的檢出，為中國(guó)荷斯坦奶牛金葡菌乳房炎抗性的標(biāo)記輔助選擇 提供了科學(xué)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] I. 1提取待測(cè)中國(guó)荷斯坦奶牛血液中的基因組DNA
[0031] 將采自中國(guó)地區(qū)不同奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的共517頭中國(guó)荷斯坦奶牛的牛血樣保存 于-20°C，該牛血樣為凝結(jié)牛全血，全血分為血凝塊和血清，血凝塊為黯紅色，血清呈清亮黃 色，血液中只有白細(xì)胞內(nèi)含有DNA，白細(xì)胞主要存在于血凝塊部分。
[0032] 本試驗(yàn)采用天根血液DNA樣品提取試劑盒從血凝塊中提取基因組DNA，具體步驟 如下：
[0033] 1)用眼科剪剪取0.2-0. 3mL的凝血塊放入已滅菌的2mL圓底離心管中，加入 500 μ 1的細(xì)胞裂解液CL ;
[0034] 2)利用手持勻漿儀將血塊充分勻漿，震蕩15s，12, OOOrpm離心lmin，棄去暗紅色 上清
[0035] 3)再次加入700 μ 1細(xì)胞裂解液CL，振蕩器振蕩使沉淀物散開(kāi)懸浮，12, OOOrpm離 心Imin,棄去上清；
[0036] 4)加入200 μ 1緩沖液GS，用渦旋儀充分懸浮血塊顆粒；
[0037] 5)加入20 μ 1蛋白酶Κ，250 μ 1緩沖液GB，充分晃動(dòng)混勻；
[0038] 6)將離心管用封口膜封號(hào)放入到56°C雜交爐中消化3-4小時(shí)，為確保充分消化， 消化過(guò)程中需要顛倒混勻數(shù)次，最終溶液變成清亮透明，簡(jiǎn)短離心；
[0039] 7)加入200 μ 1冰鎮(zhèn)無(wú)水乙醇，輕輕上下顛倒混勻15s，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉 淀；
[0040] 8)將上一步所得的溶液轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，12, OOOrpm離心 30s,棄去收集管中廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0041] 9)向吸附柱CB3中加入500 μ 1去蛋白緩沖液⑶，靜置2min，12000rmp離心30s， 棄去收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0042] 10)向吸附柱CB3中加入700 μ 1漂洗液PW，12000rmp離心30s，棄去收集管中的 廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0043] 11)向吸附柱CB3中加入500 μ 1漂洗液PW，12000rmp離心30s，棄去收集管中的 廢液，將吸附柱放入收集管中；
[0044] 12)將吸附柱放入收集管中，12000rmp離心2min,棄去廢液，將吸附柱置于室溫放 置數(shù)分鐘，徹底發(fā)揮吸附柱上殘余的乙醇；
[0045] 13)將吸附柱轉(zhuǎn)入至一個(gè)新的離心管中，加入100 μ 156°C預(yù)熱的TE緩沖液，室溫 放置5min，12000rmp離心2min，基因組DNA則存在于離心管中；