專利名稱：細(xì)菌銅抗性基因,含其的重組載體和其制備和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及沙雷氏菌編碼銅抗性的基因，DNA序 列和推導(dǎo)的氨基酸序列，以及抗性蛋白的異源表達(dá)，涉及含有該基因的重組質(zhì)粒和 表達(dá)該抗性基因的重組菌株，以及它們的制備和表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
雖然重金屬自然地出現(xiàn)在某些生態(tài)系統(tǒng)中，但其工業(yè)應(yīng)用弓l起許多嚴(yán)重的環(huán)境 問(wèn)題，因此重金屬對(duì)環(huán)境的污染和治理日益受到重視，而金屬抗性細(xì)菌的有效利用 則可以從污染的環(huán)境中去除金屬。因it樹(shù)于重金屬抗性調(diào)控的理解，將有助于處理 生物廢棄物和評(píng)估工業(yè)活動(dòng)對(duì)自然生態(tài)系統(tǒng)的影響。
銅是一種重要的微量金屬，在細(xì)胞的生理中扮演重要的角色，它也是呼吸作用 中一系列酶的重要輔基。但是，超過(guò)一定濃度時(shí)則對(duì)細(xì)胞具有毒性，高濃度的銅離 子主要通過(guò)產(chǎn)生高活性的自由基損傷DNA、破壞膜結(jié)構(gòu)及使酶失活。因此，為了保 護(hù)細(xì)胞免受高濃度重金屬毒害，細(xì)菌利用一系列抗性機(jī)制如滲透屏障、胞內(nèi)及胞 外多價(jià)螯合、外流泵、酶脫毒和還原系統(tǒng)保護(hù)自身免受銅的毒害，并確保滿足其營(yíng) 養(yǎng)要求。
克隆抗性基因，重金屬抗性機(jī)理研究的前提，同時(shí)，對(duì)克隆到的抗性基因進(jìn) 行改造，不僅可以為探討細(xì)菌重金屬抗性機(jī)理提供一定的理論依據(jù)，還可以為重金 屬污染地域的生物修復(fù)技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論研究和應(yīng)用基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種銅抗性基因和該基因的DNA序列和推導(dǎo)的氨基酸(圖1)，
以及銅抗性蛋白的異源表達(dá)(圖2 )。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種銅抗性基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和重組菌株。 含有上述DNA序列的重組質(zhì)粒pUC118-Cul和pET28a-Cul，以及利用載體
pET28a-Cul轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌BL21 (DE3) -pET28a~Cul 。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案銅抗性基因，它的DNA序列如附圖1所示。 銅抗性基因，它的氨基酸序列如附圖1所示。
所述的銅抗性基因，其由雷氏菌屬(5^ra^a sp. ) KMR-3菌株產(chǎn)生，基因序 列全長(zhǎng)l，117bp，推導(dǎo)的抗銅蛋白由194個(gè)氨基酸編碼，為CutF蛋白，分子量為約 22KDa，理論pl值為5.30;與莫氏耶爾森氏菌(re/^z'/7j'a肥7/are"力ATCC 43969 銅抗性脂蛋白NlpE同源性最高，達(dá)70 % 。
包括權(quán)利要求1的DNA序列的重組載體pUC118-Cul。
包括權(quán)利要求1的DNA序列的重組載體pET28a-Cul 。
利用重組載體pET28a-Cul轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌BL21 (DE3) -pET28a-Cul。
上述的銅抗性基因、重組載體、重組菌株的制備方法，提取粘質(zhì)沙雷氏 菌KMR-3菌株的染色體DNA，用限制性內(nèi)切酶fe〃3A I進(jìn)行部分酶切，膠回收酶切 產(chǎn)物，并與pUC118勘/zHI/BAP載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀，電轉(zhuǎn)化￡ DH5 ，涂布含氨節(jié)青霉素的LB平板，成功構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)；在含有氨芐青霧 素和銅離子的選擇性平板上篩選重組子，從重組質(zhì)粒pUC118-Cul中分離出含銅抗 性基因的DNA片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，獲得如圖1所示的DNA;設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增 銅抗性基因，與pET28a載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，獲得重組質(zhì)粒 pET28a-Cul和含重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株大腸桿菌BL21 (DE3) -pET28a-Cul 0
本發(fā)明禾傭從昆明冶煉廠周圍廢水中分離到的一株對(duì)銅離子具有高抗性的沙 雷氏菌屬(&rra"a sp. ) KMR-3菌株，其保藏號(hào)為CQMCC No. 2636。通過(guò)在 大腸桿菌DH5中構(gòu)建該菌的基因組DNA文庫(kù)，克隆到了與銅抗性相關(guān)的基因?？?隆到的銅抗性基因所編碼的蛋白屬于CutF蛋白，由194個(gè)氨基酸編碼，與莫氏耶 爾森氏菌(7eT^'7W'a 7z^7are"力ATCC 43969銅抗性脂蛋白NlpE同源性最高，達(dá)到 70%。通過(guò)常規(guī)方法獲得含有銅抗性基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株成功表達(dá) 了編碼銅抗性基因的蛋白。
此外，通過(guò)分子生物學(xué)手段，可將本發(fā)明涉及的銅抗性基因克隆到其他應(yīng)用于 污水處理的菌株中去，從而提高其對(duì)銅的耐受性進(jìn)而達(dá)到富集、轉(zhuǎn)化等去除重金屬 離子的自的。本發(fā)明涉及的沙雷氏菌屬(5fe7Ta"a sp. ) KMR-3菌株己經(jīng)于2008年8月26 日在"中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心"(中國(guó)北京)保藏， 保藏號(hào)為CGMCC No. 2636。
本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下提取沙雷氏菌屬KMR-3菌株染色體DNA，用限制 性內(nèi)切酶5k/3AI進(jìn)行部分酶切。膠回收酶切產(chǎn)物，并與pUC118 Aa/zHI/BAP載體 連接。連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀，電轉(zhuǎn)化S co力'DH5 ，涂布含氨芐青霉素的LB平板， 成功構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)。在含有氨芐青霉素和銅離子的選擇性平板上篩選重組子。 從重組質(zhì)粒pUC118"Cul中分離出含銅抗性基因的DNA片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切， 獲得如圖1所示的DNA。篩選到與銅抗性相關(guān)的基因，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化￡ coh'后， 其對(duì)銅的耐受性由160mg/L提高到了 300mg/L，因此克隆到的銅抗性基因具有應(yīng)用 于污水處理的潛力。測(cè)序表明克隆到的銅抗性基因由194個(gè)氨基酸編碼，分子量 約為22KDa。設(shè)計(jì)弓卿擴(kuò)增銅抗性基因，與pET28a載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)菌株，獲得重組質(zhì)粒pET28a^Cul和含重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株大腸桿 菌BL21(DE3)-pET28a-Cul。在IPTG誘導(dǎo)下，在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)(圖2)。
本發(fā)明克隆到的銅抗性基因，與莫氏耶爾森氏菌(^7^'m'a //^^re"力ATCC 43969銅抗性脂蛋白NlpE同源性最高，達(dá)到70%。利用軟件進(jìn)行了該蛋白的細(xì)胞 內(nèi)定位分析。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，該抗銅蛋白平均分布于胞質(zhì)、質(zhì)膜、周質(zhì)、外膜和胞 外。而已知的文獻(xiàn)報(bào)道表明，A "h'的CutF蛋白為外膜脂蛋白，參與銅離子的外 流及運(yùn)輸銅離子至銅依賴性的酶。研究表明NlpE(CutF)是一種新的外膜脂蛋白E， 而且NlpE是有關(guān)外膜脂蛋白參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及激活lysopho印holipids的第一個(gè)例 子。
'目前，很多研究表明NlpE參與感應(yīng)細(xì)胞與非生物表面的結(jié)合，并通過(guò)激活 Cpx雙層組分系統(tǒng)來(lái)傳遞信號(hào)；NlpE可能參與感應(yīng)細(xì)胞與疏7j^面接觸時(shí)發(fā)生的外 膜損失，并傳遞信號(hào)給Cpx途徑；NlpE還監(jiān)控包膜的完整性；消除周質(zhì)中異常蛋白， 修復(fù)N饑餓中的氨基酸；感應(yīng)外膜的壓力，介導(dǎo)信號(hào)至細(xì)胞質(zhì)膜上的傳，激酶
CpxA。本發(fā)明所克隆到的CutF蛋白雖然與NlpE有很高的同源性，但在很多性質(zhì)上 與NlpE仍有所不同，尤其從分布來(lái)看，NlpE分布于外胞膜，主要擔(dān)當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)的作用，而CiitF卻無(wú)明顯的跨膜區(qū)，它更象一個(gè)胞質(zhì)蛋白，但它如何參與了細(xì)菌的 銅抗性仍需作進(jìn)一步的研究。
如上所述，本發(fā)明涉及的銅抗性基因及其編碼的蛋白主要特征如下
(1) 沙雷氏菌屬(5brra"a sp. ) KMR-3菌株產(chǎn)生。
(2) 由194個(gè)氨基酸編碼，分子量約為22KDa。與莫氏耶爾森氏菌(^^im's 啦Ware"i) ATCC 43969銅抗性脂蛋白NlpE同源性最高，達(dá)到70%。
(3) IPTG誘導(dǎo)下，在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)。


圖1克隆的銅抗性基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列； 圖2抗性蛋白在大腸桿菌中表達(dá)圖。
其中M—-蛋白Marker; 1-—BL21(DE3)-pET28a對(duì)照菌株IPTG誘導(dǎo)前；2-一 BL21 (DE3) -pET28a對(duì)照菌株IPTG誘導(dǎo)后；3-— BL21 (DE3) -pET28a~Cul重組菌株 IPTG誘導(dǎo)前；4--- BL21 (DE3) -pET28a~Cul重組菌株IPTG誘導(dǎo)后。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖，用實(shí)施例^it一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來(lái)限 定本發(fā)明。
實(shí)施例l:
沙雷氏菌屬(6"erraz^s sp. ) KMR-3菌株銅抗性基因克隆和鑒定 從昆明冶煉廠周圍廢水中分離到的一株對(duì)銅離子具有高抗性的沙雷氏菌屬 (6"erra"a sp. ) KMR-3菌株。該沙雷氏菌屬(6"erra"a sp. ) KMR-3菌株己經(jīng)于 2008年8月26日在"中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心"(中國(guó)北 京)保藏，保藏號(hào)為CGMCC No. 2636。
基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建沙雷氏菌屬(&r—ra"asp. ) KMR-3菌株基因組總DNA 的提取(F.奧斯伯等，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南，北京科學(xué)出版社，1999)。用 限制性內(nèi)切酶6k/3Al部分酶切基因組總DNA，膠回收酶切產(chǎn)物，與pUC118^/tH I /BAP載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡ "〃 DH5 。涂布含氨節(jié)青霉素的LB平板， 該基因組DNA文庫(kù)的覆蓋率達(dá)到99. 9%，為有效文庫(kù)，成功構(gòu)建了該菌的基因組DNA文庫(kù)。在含有氨芐青霉素和銅離子的選擇性平板上篩選重組子。
銅抗性基因的鑒定利用PCR擴(kuò)增和雙酶切方法鑒定重組子。對(duì)CaCl2法轉(zhuǎn)化 ￡ WDH5后在選擇性平板上生長(zhǎng)的菌落在LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用博大 泰克試劑盒抽提質(zhì)粒。以Mu (RV/M4)為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，弓胸 序列如下M13 (MO: 5' "GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAA-3' ， M13 (RV): 5' -ATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'。進(jìn)一步通過(guò)雙酶切檢測(cè)插入片斷的大小。PCR 擴(kuò)增結(jié)果與雙酶切結(jié)果一致，插入片斷的大小約為1. 2 kb。
篩選到與銅抗性相關(guān)的基因，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化A coW后，其對(duì)銅的耐受性由 160mg/L提高到了 300mg/L，因此克隆到的銅抗性基因具有應(yīng)用于污水處理的潛能； 還可將本發(fā)明涉及的銅抗性基因克隆到其他應(yīng)用于污水處理的菌株中去，從而提高 其對(duì)銅的耐受性進(jìn)而達(dá)到富集、轉(zhuǎn)化等去除重金屬離子的目的。
實(shí)施例2:
銅抗性蛋白的異源表達(dá)
銅抗性基因分析測(cè)序表明銅抗性基因序列全長(zhǎng)l,117bp，推導(dǎo)的抗銅蛋白由
194個(gè)氨基酸編碼，為CutF蛋白。該蛋白的推算分子量為約22KDa，理論pl值為 5.30。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，該抗銅蛋白平均分布于胞質(zhì)、質(zhì)膜、周質(zhì)、外膜和胞外。而 已知的文獻(xiàn)報(bào)道表明，A coh'的CutF蛋白為外膜脂蛋白，參與銅的外流及運(yùn)輸銅 離子至銅依賴性的酶。利用Blast (Ve:r2. 2. 14)序列同源性比對(duì)表明其與莫氏耶爾 森氏菌()fe2^'/2j'a/z7a^are"力ATCC 43969銅抗性脂蛋白NlpE同源性最高，為70%。 銅抗性基因的亞克隆根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物(分別含有謝el和J力oI的 酶切位點(diǎn))，通過(guò)PCR擴(kuò)增銅抗性基因。目的片段大小約為600bp，通過(guò)1%瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)片段的大小，膠回收目的片段。pET28a質(zhì)粒和膠回收的銅抗性基因的 目的片段同時(shí)用兩種限制性內(nèi)切酶(蕭el和J力o1)進(jìn)行酶切。膠回收酶切產(chǎn)物， 并用T4 DNA連接酶進(jìn)纟，接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，相應(yīng) 地獲得一系列重組大腸桿菌菌株。通過(guò)PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定重組子。結(jié)果一致表 明銅抗性基因已成功亞克隆到pET28a質(zhì)粒上。含有重組質(zhì)粒pET28a-Cul的重組 大腸桿菌稱為大腸桿菌BL21 (DE3) -Cul菌株。銅抗性蛋白的異源表達(dá)將通過(guò)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定的重組大腸桿菌
BL21 (DE3) -pET28a-Cul菌株和對(duì)照菌株即含有pET28a質(zhì)粒的大腸桿菌 BL21(DE3)-pET28a，接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C, 150rpm培養(yǎng) 12h。以1%的接種量轉(zhuǎn)接搖瓶，培養(yǎng)至菌體0D咖達(dá)到0.6-0.8，取出lml的菌體， 5000rpm離心5min，棄上清。在剩余的液體培養(yǎng)基中加入終濃度為lmM的IPTG， 37°C 誘導(dǎo)4h。同樣對(duì)誘導(dǎo)的菌體進(jìn)行離心。用無(wú)菌水懸浮誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后的菌體，并同 時(shí)加入等體積的2X上樣緩沖液，混勻，95。C熱裂解15min，于12000rpm離心5min， 吸取IO 1上清作為SDS-PAGE的上樣樣品。SDS-PAGE的分離膠濃度為12. 5%，濃 縮膠濃度為5%。 SDS-PAGE結(jié)果表明亞克隆的銅抗性基因編碼的蛋白在大腸桿菌 BL21 (DE3)中大量表達(dá)(圖2)。
權(quán)利要求
1、銅抗性基因，它的DNA序列如附圖1所示。
2、 銅抗性基因，它編碼的蛋白質(zhì)具有附圖1所述的的氨基酸序列。
3、 如權(quán)利要求1所述的銅抗性基因，由雷沙氏菌屬(6brraz^3印.)KMR-3菌 株產(chǎn)生，基因序列全長(zhǎng)l，117bp，推導(dǎo)的抗銅蛋白由194個(gè)氨基酸編碼，為CiitF蛋 白，分子量為約22KDa，理論pl值為5.30;與莫氏耶爾森氏菌(re2^'m'a 側(cè)Ware"力ATCC 43969銅抗性脂蛋白NlpE同源性最高，達(dá)70%。
4、 包括權(quán)利要求1的DNA序列的重組載體pUC118^Cul。
5、 包括權(quán)利要求l的DNA序列的重組載體pET28a""Cul。
6、 利用重組載體pET28a-Cul轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌BL21 (DE3)-pET28a-Cul。
7、 權(quán)利要求1至6所述的物質(zhì)的制備方法，提取粘質(zhì)沙雷氏菌KMR-3菌 株的染色體DNA，用限制性內(nèi)切酶&"3AI進(jìn)行部分酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，并與 pUC118 "a/zHI/BAP載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀，電轉(zhuǎn)化￡ coh'DH5 ，涂 布含氨芐青霉素的LB平板，構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)；在含有氨芐青霉素和銅離子的 選擇性平板上篩選重組子，從重組質(zhì)粒pUC118-Cul中分離出含銅抗性基因的DNA 片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，獲得如圖1所示的DNA;設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增銅抗性基因， 與pET28a載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，獲得重組質(zhì)粒pET28a-Cul和 含重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株大腸桿菌BL21 (DE3) -pET28a-Cul 。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種粘質(zhì)沙雷氏菌編碼銅抗性的基因，其由沙雷氏菌屬(Serratia sp.)KMR-3菌株產(chǎn)生，基因序列全長(zhǎng)1,117bp，推導(dǎo)的抗銅蛋白由194個(gè)氨基酸編碼，為CutF蛋白，分子量為約22KDa，理論pI值為5.30；與莫氏耶爾森氏菌(Yersinia mollaretii)ATCC 43969銅抗性脂蛋白NlpE同源性最高，達(dá)70％。提供含有該基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)該抗性基因的重組菌株。該基因的抗性蛋白異源表達(dá)的方法，包括通過(guò)構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)，克隆到銅抗性相關(guān)基因，根據(jù)氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所克隆的蛋白屬于CutF蛋白，并進(jìn)一步將該蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)。銅抗性基因的克隆技術(shù)，為細(xì)菌銅抗性機(jī)理和銅離子污染地域的生物修復(fù)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C07K14/195GK101509000SQ20081023362
公開(kāi)日2009年8月19日 申請(qǐng)日期2008年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月24日
發(fā)明者井申榮, 季秀玲, 林連兵, 魏云林 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)