專(zhuān)利名稱(chēng)：血清microRNA分子標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種血清HIiCT0RNA分子標(biāo)志物及其應(yīng)用，尤其涉及一種血清microRNA分子標(biāo)志物及作為白癜風(fēng)檢測(cè)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
白癜風(fēng)是一種常見(jiàn)的獲得性色素脫失性疾病，臨床表現(xiàn)為皮膚粘膜白斑，病理表現(xiàn)為表皮、粘膜或其他組織內(nèi)黑素細(xì)胞的減少或消失。該病發(fā)無(wú)定處，但好發(fā)于顏面等暴露部位，所及之處皮膚色素完全脫失而成瓷白色，嚴(yán)重影響形象美觀，甚至毀損患者容貌，給患者帶來(lái)巨大精神痛苦，青少年多發(fā)易感，其造成的“毀容”后果，給患者帶來(lái)嚴(yán)重的心理問(wèn)題。黑素細(xì)胞破壞的機(jī)制迄今尚未完全闡明，以往關(guān)于白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制的研究主要有以下幾種學(xué)說(shuō)自身免疫學(xué)說(shuō)、黑素細(xì)胞自毀學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)、神經(jīng)化學(xué)因子學(xué)說(shuō)及遺傳學(xué)說(shuō)等。然而，以上任何單一的機(jī)制均不能完全解釋白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)理。隨著研究和認(rèn)識(shí) 的深入，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，黑素細(xì)胞受損的啟動(dòng)及其進(jìn)程是多種遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)改變積累所致細(xì)胞調(diào)節(jié)和生長(zhǎng)失控的多階段復(fù)雜過(guò)程，是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，由于本病的治療相對(duì)困難，療程長(zhǎng)、收效慢、治愈率低，目前尚沒(méi)有滿意的治療方法。因此，預(yù)防和探索個(gè)體化的治療方案是白癜風(fēng)疾病控制未來(lái)的主要方向，與個(gè)體罹患白癜風(fēng)的易感性、治療反應(yīng)及與疾病進(jìn)程和預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物的研究也日漸成為熱點(diǎn)。microRNA (miRNA)是真核生物中一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在病毒、植物和動(dòng)物中廣泛存在且進(jìn)化保守，通過(guò)mRNA降解和轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制兩種沉默機(jī)制參與基因表達(dá)調(diào)控。生理狀態(tài)下，miRNA表達(dá)譜和表達(dá)水平具有很強(qiáng)的組織特異性和時(shí)相性，機(jī)體在病理狀態(tài)下，miRNA表達(dá)譜和表達(dá)水平的變化，破壞了 miRNA對(duì)其靶基因原有的調(diào)控強(qiáng)度，這可能是miRNA參與疾病發(fā)生的關(guān)鍵。既往的研究發(fā)現(xiàn)miRNA和皮膚腫瘤、炎癥性皮膚病疾病、皮膚自身免疫性疾病、皮膚創(chuàng)傷愈合等發(fā)病有關(guān)，但目前關(guān)于miRNA在白癜風(fēng)發(fā)病中的機(jī)制研究仍處于起步階段。常規(guī)研究多通過(guò)檢測(cè)病變組織miRNA表達(dá)譜與正常組織差異探究發(fā)病機(jī)制，其檢測(cè)技術(shù)復(fù)雜、創(chuàng)傷大，難以真正應(yīng)用于臨床診斷，需找簡(jiǎn)便、快捷的miRNA研究方法，對(duì)于大規(guī)模、快速篩查白癜風(fēng)發(fā)病相關(guān)miRNA顯得十分重要。最近研究發(fā)現(xiàn)血清/血漿中存在著大量循環(huán)的miRNA，不同的疾病狀態(tài)miRNA表達(dá)譜也不同，而在正常人群中血漿miRNA則很穩(wěn)定，提示血清/血漿miRNA可作為新的疾病標(biāo)志物，成為疾病發(fā)生機(jī)制研究的一個(gè)新的切入點(diǎn)，有望應(yīng)用于疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、診斷及治療。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種血清microRNA分子標(biāo)志物及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是本發(fā)明提供了一種血清microRNA分子標(biāo)志物，其特殊之處在于所述血清microRNA分子標(biāo)志物是hsa-let_7b, miR-15b, miR-16, miR-25,miR-451中任意一個(gè)；
其中hsa-let-7b 的序列是UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU ；miR-15b 的序列是UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA ；miR-16 的序列是UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG ；miR-25 的序列是CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ；miR-451 的序列是AAACCGUUACCAUUACUGAGUU。
任何一個(gè)血清microRNA分子標(biāo)志物作為檢測(cè)白癜風(fēng)時(shí)的應(yīng)用。任何一個(gè)血清mi cr0RNA分子標(biāo)志物作為制備具有白癜風(fēng)檢測(cè)能力試劑盒的應(yīng)用。一種具有白癜風(fēng)檢測(cè)能力試劑盒，其特殊之處在于所述具有白癜風(fēng)檢測(cè)能力試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、擴(kuò)增系統(tǒng)以及引物系統(tǒng)；所述反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由E. coli Poly (A) Polymerase (Poly A 加尾酶)、10XPoly(A) Polymerase Buffer (IOXPoly A 加尾反應(yīng)緩沖溶液)、5XrATP solution (5XATP 溶液)、10 X RT primer (10 X反轉(zhuǎn)錄引物)、10 X RT Buffer (10 X反轉(zhuǎn)錄緩沖液)、超純dNTPMixture、RNasin (RNA 酶)、Quant RTase (反轉(zhuǎn)錄酶)、RNase_freeddH20 組成；所述擴(kuò)增系統(tǒng)由2XmiRcute miRNA premix、reverse primer (反向引物)組成；所述引物系統(tǒng)由hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中的任意一個(gè)的擴(kuò)增引物組成其中hsa-let-7b 的正向引物是5’ -CCTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT-3’miR-15b 的正向引物是5’ -TAGCAGCACATCATGGTTTACA-3’miR-16 的正向引物是5’ -TAGCAGCACGTAAATAITGGCG-3’miR-25 的正向引物是5’ -GCAITGCACTTGTCTCGGTCTG-3，miR-451 的正向引物是5’ -CGAAACCGTTACCATTACTGAGTT-3’。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明所提供的血清microRNA分子標(biāo)志物及其應(yīng)用，該分子標(biāo)志物包括hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451中任意一個(gè)，這些分子標(biāo)志物都能夠用于檢測(cè)白癜風(fēng)，本發(fā)明所提供的血清microRNA分子標(biāo)志物及其應(yīng)用中，由于血清具有取材方便，無(wú)創(chuàng)傷性，并可連續(xù)體外檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，因此從血清中尋找生物標(biāo)志物可以將白癜風(fēng)的早期篩查和診斷提高至一個(gè)新的水平；同時(shí)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)白癜風(fēng)臨床樣本的血清水平miRNA的檢測(cè)，定量準(zhǔn)確，相對(duì)于芯片技術(shù)或者分子雜交技術(shù)，改方法簡(jiǎn)單快速且經(jīng)濟(jì)實(shí)用；第三，該疾病標(biāo)志物可與其他分子指標(biāo)相結(jié)合，為白癜風(fēng)篩查，診斷，治療與預(yù)后提供新的綜合性試劑盒，方便臨床應(yīng)用。


圖Ia 是 hsa-let-7b，miR_15b，miR-16, miR-25, miR-451 在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V總RNA中的特異性表達(dá)電泳圖；圖Ib 是 hsa-let_7b,miR-15b,miR-16,miR-25,miR-451 在白癒風(fēng)白斑組織總 RNA中的特異性表達(dá)電泳圖 Ic 是 hsa-let-7b，miR_15b，miR-16, miR-25, miR-451 在血清總 RNA 中的特異性表達(dá)電泳圖；圖2是本發(fā)明所提供的血清microRNA表達(dá)水平的5 CT值分布圖；圖3是血清中miRNA的Pearson相關(guān)性分析；圖4a是本發(fā)明所提供的hsa-let_7b miRNA白癜風(fēng)血清樣本和正常血清樣本經(jīng)RT-qPCR分析圖；圖4b是本發(fā)明所提供的miR_15b miRNA白癜風(fēng)血清樣本和正常血清樣本經(jīng)RT-qPCR分析圖；
圖4c是本發(fā)明所提供的miR-16miRNA白癜風(fēng)血清樣本和正常血清樣本經(jīng)RT-qPCR分析圖；圖4d是本發(fā)明所提供的miR_25miRNA白癜風(fēng)血清樣本和正常血清樣本經(jīng)RT-qPCR分析圖；圖4e是本發(fā)明所提供的miR_451miRNA白癜風(fēng)血清樣本和正常血清樣本經(jīng)RT-qPCR分析圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明目的在于提出hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中任意一個(gè)能作為白癜風(fēng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的分子標(biāo)志物應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，從而提供一種性價(jià)比高、易于推廣應(yīng)用的白癜風(fēng)外周血診斷方法；hsa-let-7b ；UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (MIMAT0000063)miR-15b ；UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA (MIMAT0000417)miR-16 ；UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (MIMAT0000069)miR-25 ;CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA (MIMAT0000081)miR-451 ；AAACCGUUACCAUUACUGAGUU (MIMAT0001631)本發(fā)明還同時(shí)提供了上述任何一個(gè)血清microRNA分子標(biāo)志物作為檢測(cè)白癜風(fēng)時(shí)的應(yīng)用，尤其是任何一個(gè)血清microRNA分子標(biāo)志物作為制備具有白癜風(fēng)檢測(cè)能力試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種具有白癜風(fēng)檢測(cè)能力的試劑盒，該試劑盒由反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，擴(kuò)增系統(tǒng)和引物系統(tǒng)組成；所述反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由E. coli Poly (A) Polymerase>10XPoly (A) PolymeraseBuffer>5XrATP solution、10XRT primer、10XRT Buffer、超純 dNTP Mixture、RNasin、Quant RTase、RNase-free ddH20 組成；所述擴(kuò)增系統(tǒng)由2 XmiRcute miRNA premix、reverse primer 組成；引物系統(tǒng)由hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中的任意一個(gè)的擴(kuò)增引物組成hsa-let-7b 的引物是CCTGAGGTAGTAGGITGTGTGGITmiR-15b 的引物是TAGCAGCACATCATGGITTACAmiR-16 的引物是TAGCAGCACGTAAATAITGGCGmiR-25 的引物是GCAITGCACTTGTCTCGGTCTG
miR-451 的引物是CGAAACCGTTACCATTACTGAGIT。在本發(fā)明中，具有白癜風(fēng)檢測(cè)能力的試劑盒的使用步驟如下；I)獲取來(lái)源于被檢測(cè)個(gè)體的血液樣本；2)利用特異性的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)樣本中生物標(biāo)志物的表達(dá)；3)判定被檢測(cè)個(gè)體是否是患有白癜風(fēng)上述步驟2)中的生物標(biāo)志物的檢測(cè)是對(duì)分離的血清或血漿中純化的RNA樣本進(jìn)行檢測(cè)。特異性檢測(cè)技術(shù)為實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)了 5條miRNA可作為白癜風(fēng)早期篩查與臨床診斷的血清 學(xué)生物標(biāo)志物；具體如下UmiRNA在血清中的特異性表達(dá)如圖I所示，進(jìn)過(guò)RT-PCR定性檢測(cè)及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定和分析表明，在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V總RNA (圖la)，白癜風(fēng)白斑組織總RNA (圖lb)，血清總RNA (圖Ic)中均檢測(cè)到目標(biāo) miRNA 的特異性表達(dá)，說(shuō)明 hsa-let_7b,miR-15b,miR-16,miR-25 和 miR-451 等 5種RNA在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系，白癜風(fēng)白斑組織及血清中均存在，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。2、miRNA在血清中的個(gè)體差異性分析如圖2 所示，hsa-let-7b, miR_15b，miR-16, miR-25 和 miR-451 共 5 條 miRNA 表達(dá)水平的S CT值分布較集中。各miRNA表達(dá)水平經(jīng)pearson相關(guān)性分析得到R值接近1，P〈0. 05。該結(jié)果說(shuō)明Pearson相關(guān)性分析結(jié)果可靠,且miRNA的表達(dá)在個(gè)體間相關(guān)性好,個(gè)體差異性很小。(圖3)3、臨床白癜風(fēng)血清樣本的檢測(cè)分析如圖4所示，經(jīng)臨床白癜風(fēng)血清樣本和正常血清樣本各80例的RT-qPCR分析作圖可得，hsa-let-7b (圖 4a), miR_15b (圖 4b), miR-16 (圖 4c), miR-25 (圖 4d)和 miR-451(圖4e)5條miRNA白癜風(fēng)血清樣本中檢測(cè)所得的S Ct顯著低于正常血清樣本的S Ct值，從而推得該5條miRNA在白癜風(fēng)血清樣本中的表達(dá)顯著高于正常血清樣本。也即該5條miRNA可特異性檢測(cè)白癜風(fēng)，是白癜風(fēng)發(fā)生標(biāo)志物。且當(dāng)檢測(cè)樣本中hsa-let-7b 8 Ct ^ 8. 46 ；miR-15b 8 Ct ^ 8. 42 ；miR-16 8 Ct ^ 5. 80 ；miR-25 8 Ct ^ 4. 50 ；miR-451 8 Ct ^ 2. 60 時(shí)，提示是白癜風(fēng)患者。為使本發(fā)明的目的，技術(shù)方案和有點(diǎn)更加清楚，下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例I :生物標(biāo)志物及檢測(cè)引物本發(fā)明提供了一組miRNA 生物標(biāo)志物，包含 hsa-let-7b,miR-15b,miR-16,miR-25和miR-451。該組生物標(biāo)志物的具體序列如下hsa-let-7b UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU (SEQ ID NO 1)miR-15b UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA (SEQ ID NO :2)miR-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (SEQ ID NO :3)miR-25 :CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA (SEQ ID NO :4)miR-451 AAACCGUUACCAUUACUGAGUU (SEQ ID NO :5)Poly (A)加尾法miRNA經(jīng)過(guò)Poly (A)加尾反應(yīng)后,利用通用引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，需要針對(duì)miRNA的具體序列設(shè)計(jì)特異性PCR引物，用SYBR-green顯色實(shí)時(shí)定量地檢測(cè)目標(biāo)miRNA的擴(kuò)增情況。特異性PCR引物具體信息如下hsa-let-7b CCTGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT (SEQ ID NO :6)miR-15b TAGCAGCACATCATGGTTTACA (SEQ ID NO :7)miR-16 TAGCAGCACGTAAATATTGGCG (SEQ ID NO :8)miR-25 GCATTGCACTTGTCTCGGTCTG (SEQ ID NO :9)miR-451CGAAACCGTTACCATTACTGAGTT (SEQ ID NO :10)實(shí)施例2 :實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)試劑本發(fā)明中使用白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V、白癜風(fēng)白斑組織及20例臨床正常血清樣本(其中包括男性10例、女性10例)、20例臨床白癜風(fēng)血清樣本。上述均為離體組織。 實(shí)驗(yàn)試劑均為常用的分子生物學(xué)試劑,主要有mirVana miRNA Isolation Kit(Catalog#1560,1561, Ambion)試劑盒，Trizol試劑，氯仿,異丙醇，乙醇等常規(guī)生化試劑均購(gòu)于 sigma 公司。E. coli Poly (A) Polymerase>10XPoly (A) Polymerase Buffer >5 XrATP solution、10 X RT primer、10 X RT Buffer> 超純 dNTPMixture、RNasin、QuantRTase^RNase-free ddH20、2 XmiRcute miRNA premix、2XTaq MasterMix^reverse primer均購(gòu)自QIAGEN公司。實(shí)施例3 =Poly (A)加尾法檢測(cè)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系、白斑組織及血清中miRNA的表達(dá)I、MicroRNA 的提取細(xì)胞系和組織microRNA 的提取，按照 mirVana miRNA Isolation Kit(Catalog#1560,1561,Ambion)試劑盒所提供的操作步驟,提取上述細(xì)胞系和組織樣本的總RNA，分裝-80 V冰箱凍存，直至檢測(cè)。血清中mi croRNA的提取，由于細(xì)胞系和組織中可以使用U6作為內(nèi)參照，而血清中沒(méi)有內(nèi)參照，加入人工合成的線蟲(chóng)cel-miR-39作為檢測(cè)樣本的外參照，200 y L血清中加入 5 u L 濃度為 5fmol/ U L 的 cel-miR-39?；旌虾蟀凑?mirVana miRNA IsolationKit (Catalog#1560,1561, Ambion)試劑盒所提供的操作步驟,提取上述血清中總RNA,分裝-80 V冰箱凍存，直至檢測(cè)。2, miRNA 3’ 末端進(jìn)行加 Poly (A)處理在3個(gè)無(wú)RNase的0. 2mL PCR管中分別加入I ii g白癜風(fēng)PIG3V黑素細(xì)胞系總RNA、I u g白斑組織總RNA、I u g血清提取得到的RNA，再依次加入0. 4 y L E. coli Poly(A)Polymerase (5U/ u L), 2 u L IOXPoly (A) Polymerase Buffer, 4 u L 5XrATPsolution,RNase-free ddH20補(bǔ)至總體積20 ii L,混勻離心后,在PCR儀中進(jìn)行Poly (A)加尾反應(yīng),反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為37°C 60min。3、cDNA 合成分別取上述Poly (A)反應(yīng)液 2 ii L，再加入 2 ii L 10XRT primer,2u L 10XRTBuffer, I u L 超純 dNTP Mixture (2. 5mM each), IuL RNasin (40U/ u L), 0. 5 u L QuantRTase, RNase-free ddH20補(bǔ)至總體積20 U L,混勻離心后,在PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為37°C 60min。得模板cDNA。由于采用Poly(A)加尾法，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA可以作為通用模板用于檢測(cè)miRNA，因此對(duì)應(yīng)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系、白斑組織及血清共有3個(gè)模板cDNA。
4、cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)在0. 2mL PCR 管中依次加入 10 U L 2 X Taq MasterMix, 0. 4 U L reverse primer(IOuM),對(duì)應(yīng)的miRNA特異性正向引物(10 y M)各0. 4 y L，I y L模板cDNA (步驟2所得)和去離子水8. L,總體積為20ii L?；靹螂x心后在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為94°C 2min，循環(huán)條件為94°C 15s，60°C 30s, 72°C lmin，共35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后取4 y L反應(yīng)液，進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果如圖I所示。圖I中的M代表2000bp DNA Ladder其中最下面一條帶為lOObp。根據(jù)該圖，可得知經(jīng)過(guò)RT-PCR定性檢測(cè)及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定和分析表明，在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V總RNA，白斑組織總RNA，血清總RNA中均檢測(cè)到目標(biāo) miRNA 的特異性表達(dá)，說(shuō)明 hsa_let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25 和 miR-451 等 5 種miRNA在白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V，白斑組織，血清中均存在，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)。5、cDNA進(jìn)行熒光定量PCR
在新的0. 2mL PCR 反應(yīng)管中依次加入 10 u L 2 XmiRcute miRNA premix,0. 4 u Lreverse primer (lOuM),對(duì)應(yīng)的 miRNA 特異性正向引物(10 u M)各 0. 4 u L, 2 u L 模板cDNA (步驟2所得)和去離子水7. 2 ii L，總體積為20 u L?；靹螂x心后在RT-qPCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為94°C 2min，循環(huán)條件為94°C 20s, 60°C lmin，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)該反應(yīng)可得該5條基因在不同樣本中的表達(dá)量，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)分析。6、數(shù)據(jù)處理熒光定量PCR定量檢測(cè)miRNA的相對(duì)表達(dá)變化量時(shí)，表達(dá)量倍數(shù)的變化用公式 RQ=2_S 5CT, 6 6 Ct= 6 Clvitiligo- 6 Clcontrol 其中細(xì)胞系和組織中 S
Cl1Vitiligo CTmiR ^TU6
血中 3 CTvitilig0-CTmiE-CTcel_miE_39o 細(xì)胞系和組織中 S CTcontrol-CTmiR-CTU6 ;血 ^ 中^ CTcontrol_CTmiR_CTcel—miR—39。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16. 0統(tǒng)計(jì)分析軟件，Excel2003等數(shù)據(jù)分析工具，當(dāng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤(STDEV) < 0. 5，p值< 0. 05時(shí)，認(rèn)為結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。如圖3所示,分析內(nèi)容為miRNA在血清中表達(dá)的個(gè)體差異性分析。該結(jié)果說(shuō)明miRNA可作為白癜風(fēng)的生物標(biāo)志物。實(shí)施例4 :利用本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)樣本中miRNA的表達(dá)—種用于篩查和診斷白癜風(fēng)病人療效和預(yù)后的試劑盒，由擴(kuò)增系統(tǒng)和引物系統(tǒng)組成。其中，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由Poly (A)加尾酶、反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成；擴(kuò)增系統(tǒng)由含Taq酶的miRNA表達(dá)定量檢測(cè)混合液組成；引物系統(tǒng)由hsa_let_7b，miR-15b, miR-16, miR-25和miR-451特異性引物和通用引物組成；具體為反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由E. coli Poly (A) Polymerase 加尾酶、IOXPoly (A)Po I ymeraseBuf f er > Quant RTase 反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系 10XRT Buffer 緩沖溶液和 RNase抑制劑組成；擴(kuò)增系統(tǒng)由含Taq酶的miRNA表達(dá)定量檢測(cè)混合液組成，包括2XmiRcutemiRNApremix ；引物系統(tǒng)由hsa-let-7b，miR_15b，miR-16, miR-25 和 miR-451 特異性引物和reverse primer通用引物組成，同實(shí)施例I中序列。該實(shí)施例中，分別以80個(gè)健康人和80個(gè)白癜風(fēng)患者血清為樣本，分別用5種不同的microRNA生物標(biāo)志物進(jìn)行試驗(yàn)，從而獲得如圖4所述結(jié)果。具體如下
I、血清 microRNA 的提取血清中microRNA的提取,200 UL血清中加入5iiL濃度為5fmol/ ii L的cel-miR-39?；旌虾蟀凑?mirVana miRNA Isolation Kit (Catalog#1560，1561，Ambion)試劑盒所提供的操作步驟，提取上述血清中總RNA。2, miRNA 3’ 末端進(jìn)行加 Poly (A)處理在0. 2mL PCR管中加入I y g血清提取得到的RNA，再依次加入0. 4 y L E. coliPoly (A) Polymerase (5U/ U L),2li L 10 X Poly (A) Polymerase Buffer, 4 U L5 XrATPsoIution, RNase-free ddH20補(bǔ)至總體積20 U L,混勻離心后，在PCR儀中進(jìn)行Poly(A)加尾反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為37°C 60min。3、cDNA 合成分別取上述Poly (A)反應(yīng)液 L，再加入 2 ii L IOXRT primer，2 ii L10 X RTBuffer, I u L 超純 dNTP Mixture (2. 5mM each), I u L RNasin (40U/u L),0. 5 u LQuant RTase, RNase-free ddH20補(bǔ)至總體積20 ii L,混勻離心后，在PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為37°C 60min。得模板cDNA。4、cDNA進(jìn)行熒光定量PCR在新的0. 2mL PCR 反應(yīng)管中依次加入 10 u L 2 XmiRcute miRNA premix,0. 4 u Lreverse primer (lOuM),對(duì)應(yīng)的 miRNA 特異性正向引物(10 u M)各 0. 4 u L, 2 u L 模板cDNA (步驟2所得)和去離子水7. 2 ii L，總體積為20 u L?；靹螂x心后在RT-qPCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)為94°C 2min，循環(huán)條件為94°C 20s, 60°C lmin，共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)該反應(yīng)可得該5條基因在不同樣本中的表達(dá)量，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)分析。5、數(shù)據(jù)處理熒光定量PCR定量檢測(cè)所得miRNA的5 Ct值，采用Excel 2003數(shù)據(jù)分析工具，當(dāng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤(STDEV) < 0. 5，認(rèn)為結(jié)果可靠。如圖4所示，可得5條miRNA在白癜風(fēng)血清/正常血清樣本中的S Ct值比較分析。分析結(jié)果顯示該5條miRNA在白癜風(fēng)血清樣本中檢測(cè)所得的S Ct值顯著低于正常血清樣本的6(^值。從而推得該5條miRNA在白癜風(fēng)血清樣本中的表達(dá)顯著高于正常血清樣本。也即該5條miRNA可特異性檢測(cè)白癜風(fēng)，是白癜風(fēng)標(biāo)志物。且當(dāng)檢測(cè)樣本中 hsa-let-7b 8 Ct ^ 8. 46 ；miR-15b 8 Ct ^ 8. 42 ；miR-16 8 Ct ^ 5. 80 ； miR-25 8 Ct ^ 4. 50 ；miR-451 8 Ct ^ 2. 60 時(shí)，提示是白癜風(fēng)患者。
權(quán)利要求
1.一種血清microRNA分子標(biāo)志物，其特征在于所述血清microRNA分子標(biāo)志物是hsa_let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451 中任意一個(gè)； 其中 hsa-let-7b 的序列是UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU ； miR-15b 的序列是UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA ； miR-16 的序列是UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG ； miR-25 的序列是CAUUGCACUU⑶CUCGGUCUGA ； miR-451 的序列是:AAACCGUUACCAUUACUGAGUU。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的任何一個(gè)血清microRNA分子標(biāo)志物作為檢測(cè)白癜風(fēng)時(shí)的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的任何一個(gè)血清microRNA分子標(biāo)志物作為制備具有白癜風(fēng)檢測(cè)能力試劑盒的應(yīng)用。
4.一種具有白癜風(fēng)檢測(cè)能力試劑盒，其特征在于所述具有白癜風(fēng)檢測(cè)能力試劑盒包括反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、擴(kuò)增系統(tǒng)以及引物系統(tǒng)； 所述反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由 E. coli Poly (A) Polymerase>10XPoly (A) Polymerase Buffer>.5 XrATP solution、10 X RT primer、10 X RT Buffer、超純 dNTP Mixture、RNasin、QuantRTase、RNase-free ddH20 組成； 所述擴(kuò)增系統(tǒng)由 2XmiRcute miRNA premix、reverse primer 組成； 所述引物系統(tǒng)由hsa-let_7b, miR_15b, miR-16, miR-25, miR-451中的任意一個(gè)的擴(kuò)增引物組成 其中 hsa-let-7b 的正向引物是5’ -CCTGAGGTAGTAGGITGTGTGGIT-3’ ； miR-15b 的正向引物是5’ -TAGCAGCACATCATGGITTACA-3’ ； miR-16 的正向引物是5’ -TAGCAGCACGTAAATAITGGCG-3’ ； miR-25 的正向引物是5’ -GCAITGCACTTGTCTCGGTCTG-3’ ； miR-451 的正向引物是5’ -CGAAACCGTTACCATTACTGAGIT-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種血清microRNA分子標(biāo)志物及作為白癜風(fēng)檢測(cè)方面的應(yīng)用。該血清microRNA分子標(biāo)志物是hsa-let-7b，miR-15b，miR-16，miR-25，miR-451中任意一個(gè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102757965SQ20121020791
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者李凱, 李春英, 王剛, 石瓊, 郭森, 高天文 申請(qǐng)人:李春英