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一種新型的乳腺癌量子點(diǎn)免疫層析試紙條的制備方法

文檔序號:9325459閱讀:430來源:國知局
一種新型的乳腺癌量子點(diǎn)免疫層析試紙條的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米材料腫瘤診斷技術(shù)領(lǐng)域,特別涉及一種新型的乳腺癌量子點(diǎn)免疫層析試紙條的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血清腫瘤標(biāo)志物的檢測已經(jīng)越來越引起人們的關(guān)注,這是因為這種方法具有很多優(yōu)點(diǎn),如簡便無創(chuàng),可以重復(fù)檢測,檢測結(jié)果直觀且可以定量,費(fèi)用相對較低等等。最重要的一點(diǎn)是對于血清腫瘤標(biāo)志物可以動態(tài)監(jiān)測,從而可以對惡性腫瘤的診斷、病情發(fā)展與療效等進(jìn)行判斷,在臨床上具有很高的應(yīng)用價值。
[0003]這些物質(zhì)在正常人的體內(nèi)不存在,或者在正常人體內(nèi)出現(xiàn)的水平顯著低于腫瘤患者體內(nèi)的水平。一般來說,一種理想的腫瘤標(biāo)志物需要滿足以下條件:特異性強(qiáng),靈敏度高,能夠?qū)δ[瘤進(jìn)行定位,與腫瘤的大小或分期相關(guān),能夠?qū)δ[瘤的療效和預(yù)后進(jìn)行判斷,具有相當(dāng)高的預(yù)測價值等。但是,目前所應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物并不能同時滿足上述所有要求,因此需要人們合理使用,并且正確評價其對臨床上進(jìn)行腫瘤檢測的意義與價值。由于目前臨床上常用的腫瘤標(biāo)志物沒有足夠高的靈敏度,且特異性不夠強(qiáng),因此在對惡性腫瘤進(jìn)行診斷時,不能排除假陰性的結(jié)果,所以腫瘤標(biāo)志物并不能夠確診,即不能作為腫瘤診斷的主要依據(jù),而只是作為惡性腫瘤檢測時的一種輔助手段,需要結(jié)合其他檢測方法進(jìn)行確診。腫瘤標(biāo)志物對正常人群普查時必須要考慮到該腫瘤的發(fā)病率以及檢測方法的靈敏度、特異性以及對檢測結(jié)果的重復(fù)性問題。除此之外,還應(yīng)該考慮到實際條件的制約,如普查的費(fèi)用是否合理,能否被大多數(shù)人接受,或者說該腫瘤的早期治療比晚期治療更經(jīng)濟(jì)有效。由于絕大多數(shù)腫瘤標(biāo)志物并不具有器官特異性,只有前列腺特異性抗原PSA、甲胎蛋白AFP和甲狀腺球蛋白等極少數(shù)的腫瘤標(biāo)志物有一定的器官定位作用,但這也不是腫瘤特異性,因此腫瘤標(biāo)志物陽性不能對腫瘤進(jìn)行絕對定位。腫瘤標(biāo)志物的濃度與腫瘤的大小相關(guān),且大多與腫瘤的分期存在關(guān)聯(lián),因此對判斷腫瘤臨床分期具有一定的意義。但是每個個體來說,各期腫瘤的腫瘤標(biāo)志物的濃度范圍很大,并且彼此之間會互相發(fā)生重疊,因此腫瘤標(biāo)志物的個體測得值并不能直接判斷出腫瘤大小,也不能用來確定腫瘤分期,只具有一定的指示作用。腫瘤標(biāo)志物對腫瘤的治療療效和復(fù)發(fā)監(jiān)測具有一定的臨床價值。臨床上,通過檢測腫瘤患者治療前后腫瘤標(biāo)志物的濃度變化可以判斷對腫瘤的治療是否有效。如果治療后患者的腫瘤標(biāo)志物的濃度下降到正常值范圍內(nèi),則表明對腫瘤的治療有效;如果治療后患者的腫瘤標(biāo)志物的濃度雖然有所下降,但仍然高于正常值范圍,則表明腫瘤還有殘留,或者腫瘤已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移;如果治療后患者的腫瘤標(biāo)志物的濃度下降到正常值范圍內(nèi),但是經(jīng)過一段時間,腫瘤標(biāo)志物的濃度再次上升并高于正常值,這表明腫瘤復(fù)發(fā)或者腫瘤轉(zhuǎn)移。根據(jù)上述幾種判斷標(biāo)準(zhǔn),可以判斷腫瘤預(yù)后,為進(jìn)一步治療提供參考依據(jù)。
[0004]基于上述幾種考慮,目前醫(yī)務(wù)工作者們大多采用幾種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測的原貝1J,這是因為患有一種腫瘤時可能有一種或幾種腫瘤標(biāo)志物異常,并且同一種腫瘤標(biāo)志物異??梢猿霈F(xiàn)在不同的腫瘤中。但是聯(lián)合檢測的指標(biāo)必須經(jīng)過科學(xué)分析以及嚴(yán)格篩選,綜合考慮各種腫瘤標(biāo)志物的靈敏度和特異性等因素作出合理選擇。目前臨床上常用的腫瘤標(biāo)志物有 AFP、CEA、PSA、HCG、NSE、CA199、CA12-5 以及 CA15-3 等。CA15-3 是乳腺癌的最重要的特異性標(biāo)志物,30% -50%的乳腺癌患者的CA15-3明顯升高,其含量的變化與治療效果密切相關(guān),是乳腺癌患者診斷和監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)、觀察療效的最佳指標(biāo),CA15-3動態(tài)測定有助于II期和III期乳腺癌病人治療后復(fù)發(fā)的早期發(fā)現(xiàn)。CEA是一個廣譜性腫瘤標(biāo)志物,它能向人們反映出多種腫瘤的存在,其特異性不強(qiáng),靈敏度不高,對腫瘤早期診斷作用不明顯,但對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預(yù)后估計是一個較好的腫瘤標(biāo)志物。
[0005]對生物體內(nèi)的腫瘤標(biāo)志物實現(xiàn)高靈敏度的檢測是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的一項重要課題,發(fā)展一種新的靈敏度高的檢測方法也成為研究者們努力的目標(biāo)。在眾多的檢測方法中,利用熒光分析檢測受到了人們的廣泛關(guān)注,而熒光分子檢測中的檢測限主要取決于所選用的熒光標(biāo)記物的發(fā)光強(qiáng)度。目前,量子點(diǎn)因具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于示蹤、成像以及標(biāo)記等方面。而免疫層析試紙條檢測則因為它的簡單迅速、價格低廉、可以隨時隨地等優(yōu)點(diǎn)在檢測領(lǐng)域處于特殊重要的地位。因此我們擬在已有量子點(diǎn)試紙條檢測腫瘤標(biāo)志物的基礎(chǔ)上,同時檢測兩種或兩種以上的腫瘤標(biāo)志物,實現(xiàn)量子點(diǎn)試紙條檢測腫瘤標(biāo)志物的多元檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的乳腺癌量子點(diǎn)免疫層析試紙條的制備方法,通過不同發(fā)射波長量子點(diǎn)進(jìn)行編碼,根據(jù)量子點(diǎn)的熒光性質(zhì)和腫瘤標(biāo)志物濃度之間的關(guān)系,在試紙條上同時檢測兩種或兩種以上的腫瘤標(biāo)志物,實現(xiàn)量子點(diǎn)試紙條檢測腫瘤標(biāo)志物的多元定量檢測。選定CA15-3和CEA這兩種腫瘤標(biāo)志物,建立一種乳腺癌量子點(diǎn)試紙條檢測的新方法,對乳腺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預(yù)后估計都有重要意義。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0008]1)將量子點(diǎn)QDs625nni和QDs 560nn, EDC(1-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)加入反應(yīng)器,反應(yīng)體系為PBS緩沖液,在旋轉(zhuǎn)混合架上活化量子點(diǎn)的羧基,離心得到免疫量子點(diǎn);
[0009]2)將糖類抗原15-3標(biāo)記抗體(CA15-3Abi)和免疫量子點(diǎn)QDs625nni混合,反應(yīng)體系為PBS緩沖液,在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2?3h,離心得到量子點(diǎn)_糖類抗原15-3標(biāo)記抗體(QDs-CAlSIAbi)的熒光探針,加入牛血清白蛋白BSA。
[0010]3)將癌胚抗原標(biāo)記抗體(CEAAbi)和免疫量子點(diǎn)QDs56Qnni混合,反應(yīng)體系為PBS緩沖液,在旋轉(zhuǎn)混合架上偶聯(lián)抗體2?3h,離心得到量子點(diǎn)-癌胚抗原CEA標(biāo)記抗體(QDs-CEAAbi)的熒光探針,加入牛血清白蛋白BSA。
[0011]4)試紙條制備:用處理液處理樣品墊和結(jié)合墊并37°C烘干,然后用上述熒光探針再次處理結(jié)合墊并37°C烘干,將吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊以及結(jié)合墊組裝在一起,得到乳腺癌量子點(diǎn)免疫層析試紙條。
[0012]量子點(diǎn):EDC質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為1:4000?10000。
[0013]量子點(diǎn)和標(biāo)記抗體質(zhì)量分?jǐn)?shù)比=1:20?50。
[0014]所述PBS緩沖液用以保持癌胚抗原抗體和糖類抗原15-3抗體的活性。
[0015]所述牛血清白蛋白(BSA)用以封閉熒光探針上未反應(yīng)的羧基。
[0016]所述處理液是蔗糖、牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG、聚氧乙烯山梨醇單月桂酸酯Tween-20的混合溶液。
[0017]所述制備方法,其特征在于同時選用不同發(fā)射波長的量子點(diǎn)QDs625nni和QDs 56_檢測不同的腫瘤標(biāo)志物CA15-3和CEA,如說明書附圖5所示。
[0018]根據(jù)試紙條夾心結(jié)構(gòu)捕獲的量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度和抗原濃度之間的關(guān)系,實現(xiàn)對兩種腫瘤標(biāo)志物的定性定量檢測,如說明書附圖3、4、5所示。不同CEA和CA15-3標(biāo)準(zhǔn)抗原濃度優(yōu)選O?1000ng/mL(其中Ong/mL對應(yīng)胎牛血清FBS,作為陰性對照)。
[0019]CA 15-3包被抗體勻噴在硝酸纖維素膜上作為檢測線T i,將CEA包被抗體Ab2均勻噴在硝酸纖維素膜上作為檢測線T2,而將羊抗鼠抗體Ab3硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線Co兩種量子點(diǎn)熒光探針和其相對應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物抗原Ag以及包埋在試紙條的另一種腫瘤標(biāo)志物單抗Ab2,形成一種類似夾心的結(jié)構(gòu)QDs-Ab1-Ag-Ab2,或者形成QDs-Ab1-Ab3結(jié)構(gòu)。如果檢測樣品僅有CA15-3抗原存在,則T1線和C線亮而T 2線不亮;如果檢測樣品僅有CEA存在,則T2線和C線亮而T:線不亮;如果檢測樣品同時含有CA15-3和CEAJj T:線、T 2線和C線均亮;如果檢測樣品既沒有CA15-3也沒有CEA,則T1線和T 2線均不亮而C線亮。
[0020]本發(fā)明涉及了一種新型的乳腺癌量子點(diǎn)免疫層析試紙條的制備方法。EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)活化羧基下采用發(fā)射波長在625nm左右的CdSe/ZnS紅色量子點(diǎn)和發(fā)射波長在560nm左右的CdSe/ZnS綠色量子點(diǎn)分別偶聯(lián)CA15-3 (carbohydrate antigenl5-3)和 CEA (carcino-embryonic antigen)腫瘤標(biāo)志物的單抗Ab1,形成兩種量子點(diǎn)熒光探針QDs625nn1-CA15-3AbdP QDs ^50nn1-CEAAb1。兩種量子點(diǎn)熒光探針和其相對應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物抗原Ag以及包埋在試紙條的另一種腫瘤標(biāo)志物單抗Ab2,形成一種類似夾心的結(jié)構(gòu)QDs-Ab1-Ag-Ab2,通過這種方法量子點(diǎn)試紙條可以同時檢測兩種及兩種以上的腫瘤標(biāo)志物,建立了一種新型的乳腺癌量子點(diǎn)免疫層析試紙條的制備方法。與現(xiàn)有產(chǎn)品和技術(shù)相比,本發(fā)明的特點(diǎn)在于:可同時檢測兩種腫瘤標(biāo)志物,大大簡化了檢測步驟,
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