一種利用miR-152作為動(dòng)脈粥樣硬化血清標(biāo)志物及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于分子生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】的一種利用miR-152為標(biāo)志物的動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)試劑盒及方法。本發(fā)明設(shè)計(jì)miR-152特異性的引物，采用定量PCR的方法檢測(cè)正常人血清、動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中miR-152的含量變化，含量顯著降低為動(dòng)脈粥樣硬化患者血清。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，迅速，靈敏，適用于檢測(cè)患者是否患有動(dòng)脈粥樣硬化。
【專利說明】—種利用miR-152作為動(dòng)脈粥樣硬化血清標(biāo)志物及檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物醫(yī)學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種利用miR-152作為動(dòng)脈粥樣硬化血清標(biāo)志物及其檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重威脅人類生命的常見病之一。大多見于體循環(huán)系統(tǒng)的大型肌彈力型動(dòng)脈，如主動(dòng)脈，和中型肌彈力型動(dòng)脈，如冠狀動(dòng)脈、腦動(dòng)脈。研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化是一種多基因遺傳病，呈現(xiàn)非常明顯的遺傳異質(zhì)性，發(fā)病具有地區(qū)特異性和種族特異性，病程發(fā)展由多層級(jí)聯(lián)反應(yīng)機(jī)制調(diào)控，病因復(fù)雜。目前認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病是由于環(huán)境因素和遺傳因素共同導(dǎo)致，從發(fā)生機(jī)制上看，多數(shù)學(xué)者支持“內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說”，即認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化是一種血管壁的慢性炎癥反應(yīng)性疾病，以內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)、粥樣斑塊形成為特點(diǎn)。這種斑塊形成，向不穩(wěn)定斑塊轉(zhuǎn)化、最終斑塊破裂的過程最終導(dǎo)致了心血管急性事件的發(fā)生。
[0003]microRNA(miRNA)是一類長約22nt的非編碼小RNA分子，它們通過與靶基因3' UTR結(jié)合降解靶基因或者抑制翻譯，在多種生理過程中發(fā)揮重要作用。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程由多種復(fù)雜的調(diào)控通路參與，其中miRNA參與了動(dòng)脈粥樣硬化致病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。動(dòng)脈粥樣硬化的致病原因有很多，如炎性反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙等，近期越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能夠參與到上述病理過程的調(diào)控之中。
[0004]本發(fā)明證實(shí)，miR-152在動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中含量明顯低于正常人，細(xì)胞水平研究進(jìn)一步證實(shí)，在缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞中miR-152表達(dá)明顯降低。
[0005]本發(fā)明目的是利用提供一種利用檢測(cè)血清中miR-152水平作為臨床診斷動(dòng)脈粥樣硬化的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供miR-152作為動(dòng)脈粥樣硬化血清分子標(biāo)志物。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)miR-152表達(dá)量的引物。
[0008]本發(fā)明的目的還在于提供一種動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)試劑盒。
[0009]本發(fā)明的目的還在于提供一種非診斷目的的動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)方法。
[0010]一種檢測(cè)miR-152表達(dá)量的引物，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.2，SEQ ID N0.3 所示。
[0011]一種動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含序列表中SEQ ID N0.2，SEQ IDN0.3所示的引物，標(biāo)準(zhǔn)樣品，內(nèi)參引物，反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制劑和滅菌水。
[0012]所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為未經(jīng)過處理的人血清樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。
[0013]一種非診斷目的的動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)方法，按照如下步驟進(jìn)行:
[0014](I)提取待檢樣品的總RNA ；[0015](2)將步驟(1)得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
[0016](3)利用權(quán)利要求3或4所述的一種動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)試劑盒，以步驟⑵得到的cDNA為模板，做定量PCR，檢測(cè)樣品中miR-152的表達(dá)量；
[0017](4)若待檢樣品的表達(dá)量顯著高于標(biāo)準(zhǔn)樣品的表達(dá)量，則該待檢樣品取自動(dòng)脈粥樣硬化患者的生物樣品。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單，迅速，靈敏，適用于檢測(cè)患者是否患有動(dòng)脈粥樣硬化。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是定量PCR檢測(cè)正常人血清與動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中miR-152含量的結(jié)
果O
[0020]圖2是定量PCR檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在常氧與低氧環(huán)境培養(yǎng)下miR-152含量的結(jié)果。 【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0022]以下實(shí)施例未說明的實(shí)驗(yàn)步驟參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或參照相應(yīng)試劑盒的說明書。
[0023]實(shí)施例1人血清樣品中RNA的抽提
[0024](I)樣品(正常人血清、動(dòng)脈粥樣硬化患者血清)室溫放置5分鐘，從-80攝氏度冰箱取出的樣品室溫放置15分鐘至融化。
[0025](2)每250 μ I樣品加750 μ I Trizol混勻，再加入250 μ I三氯甲烷，劇烈晃動(dòng)15
秒，室溫靜置3分鐘。
[0026](3)4攝氏度、1200(^離心15分鐘，上層為RNA
[0027](4)將上層水相約500微升轉(zhuǎn)移到新EP管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻10秒,置于-20攝氏度冰箱沉淀兩小時(shí)或過夜。
[0028](5)取出樣品，4攝氏度12000g離心15分鐘，倒掉上清加入I毫升80%乙醇(DEPC)洗滌沉淀，上下翻轉(zhuǎn)十次，使白色RNA沉淀浮起，4攝氏度、7500g離心5分鐘，共進(jìn)行兩次。
[0029](6)棄上清，吸盡管中液體，使乙醇揮發(fā)干凈(約2-5分鐘)
[0030](7)待RNA沉淀邊緣開始變干透明時(shí)，立即加入DEPC水(20 μ I左右)。取I μ I用于定量，其它RNA與-80攝氏度保存?zhèn)溆谩？杉尤隝 μ I RNAase inhibitor防止RNA降解。
[0031]實(shí)施例2反轉(zhuǎn)錄
[0032]米用M-MLV Reverse Transcriptase [Promega#9PIM170]反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
[0033]每個(gè)樣品取I μ g RNA分別和miR-152及U6的特異反轉(zhuǎn)引物混合，70度水浴10分鐘，冰上放置兩分鐘。然后每個(gè)樣品分別加入buffer5 μ l，dNTP4 μ 1，反轉(zhuǎn)錄酶I μ 1，RNAaseinhibitor0.2μ I。反轉(zhuǎn)好的cDNA在-20度保存，避免反復(fù)凍融。
[0034]實(shí)施例3定量-PCR[0035]按照實(shí)驗(yàn)分組，每個(gè)樣品檢測(cè)內(nèi)參和mir-152的含量。PCR正向引物和反向引物如序列表中SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組三個(gè)復(fù)孔，體系為20 μ 1，儀器為Stratagene MxPro3000, SYBR Green mix 為 Promega 公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)體系為:10μ 12X SYBRGreen mix,8y I水，I μ I引物，1μ I cDNA。PCR反應(yīng)條件是95度5分鐘，95度20秒，60度20秒，72度20秒，50個(gè)循環(huán)，溶解曲線為60度到95度，溫度間隔為0.4度。
[0036]PCR結(jié)果如圖1-2所示，在動(dòng)脈粥樣硬化患者中miR-152的拷貝數(shù)明顯低于正常人血清中miR-152的拷貝數(shù)(圖1);人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在常氧與低氧環(huán)境培養(yǎng)時(shí)，miR-152的拷貝數(shù)相應(yīng)下降(圖2)。以上結(jié)果均表明，在動(dòng)脈粥樣硬化患者血清及低氧脅迫處理均使miR-152的拷貝數(shù) 下降。
【權(quán)利要求】
1.miR-152作為動(dòng)脈粥樣硬化血清分子標(biāo)志物，其特征在于，所述核苷酸序列如序列表中 SEQ ID N0.1 所示。
2.一種檢測(cè)miR-152表達(dá)量的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.3 所示。
3.一種動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權(quán)利要求2所述的引物，標(biāo)準(zhǔn)樣品，內(nèi)參引物，反轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs, buffer, RNA酶抑制劑和滅菌水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)樣品為未經(jīng)過處理的人血清樣品中的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。
5.一種非診斷目的的動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)方法，其特征在于，按照如下步驟進(jìn)行: (1)提取待檢樣品的總RNA； (2)將步驟⑴得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA； (3)利用權(quán)利要求3或4所述的一種動(dòng)脈粥樣硬化血清檢測(cè)試劑盒，以步驟(2)得到的cDNA為模板，做定量PCR，檢測(cè)樣品中miR-152的表達(dá)量； (4)若待檢樣品的表達(dá)量顯著高于標(biāo)準(zhǔn)樣品的表達(dá)量，則該待檢樣品取自動(dòng)脈粥樣硬化患者的生物樣品。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104017860SQ201410143184
【公開日】2014年9月3日 申請(qǐng)日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】邵寧生, 黃皚雪, 李慧, 蘇雪婷, 李潔, 丁紅梅, 李少華, 趙強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所