專(zhuān)利名稱(chēng)：人源抗EV71病毒中和性抗體EV71FabK7、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程抗體技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及一種人源抗EV71病毒中和性抗體EV71FabK7、其制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
手足口病(Hand foot mouth disease, HFMD)是由腸道病毒引起的傳染病，多發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，可引起發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，個(gè)別患者可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種，其中柯薩奇病毒(Cox Asckievirus) A16 M (Cox A16)和腸道病毒 71 型(Enterovirus71. EV71)最常見(jiàn)。1974年Schmidt等人首次報(bào)道從美國(guó)加利福尼亞暴發(fā)的表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀疾病 (196擴(kuò)1973年)的患者體內(nèi)分離到EV71，隨后，世界上許多國(guó)家相繼報(bào)道了 EV71病毒在不同地區(qū)的流行情況，人們逐漸認(rèn)識(shí)到EV71病毒是手足口病的主要病原。由于手足口病目前沒(méi)有相應(yīng)的疫苗和特異性藥物，因此制備高效、價(jià)廉、副反應(yīng)小的被動(dòng)免疫制劑成為研究的熱點(diǎn)。利用含有特異性抗體的人源或動(dòng)物血清免疫球蛋白來(lái)預(yù)防和治療傳染病由來(lái)已久。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內(nèi)保護(hù)肌體抵抗病毒攻擊已獲得許多實(shí)驗(yàn)證明，如漢坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、狂犬病毒等中和性單克隆抗體可以在體內(nèi)100%保護(hù)動(dòng)物免受病毒攻擊.免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)作為抗體成分主要來(lái)自捐獻(xiàn)者(恢復(fù)期病人)免疫血清，從獲得陽(yáng)性血清到通過(guò)安全性檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，且需投入大量的人力和財(cái)力，這就使其大量制備受到限制，同時(shí)由于抗體主要來(lái)源于血清，因此容易發(fā)生血源性傳播疾病的感染。而使用人源基因工程產(chǎn)品替代血制品則可克服這些缺陷，隨著人源基因工程抗體研究的不斷深入，給這一領(lǐng)域的生物制品發(fā)展帶來(lái)了新的希望和廣闊前景。90年代初興起的噬菌體抗體基因庫(kù)技術(shù)(Barbas, C. F.等.，1991)和整個(gè)基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，極大促進(jìn)了人源或基因工程抗體的開(kāi)發(fā)研究，并已由基礎(chǔ)研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開(kāi)發(fā)階段。人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預(yù)防和治療開(kāi)辟了新思路，并在抗病毒感染生物醫(yī)藥領(lǐng)域中逐漸開(kāi)發(fā)出一類(lèi)新的抗病毒藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人源抗EV71病毒中和性抗體EV71FabK7或其活性片段。本發(fā)明的另一目的是提供所述抗體EV71FabK7或其活性片段的制備方法。本發(fā)明的再一目的是提供所述抗體EV71FabK7或其活性片段的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種人源抗EV71病毒中和性抗體EV71FabK7或其活性片段，其輕鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如表I所示
表I抗體EV71FabK7的重鏈及輕鏈高變區(qū)的氨基酸序列
CDRlCDR2CDR3
重鏈 VH SGYYWGSIYHSGSTYYNPSLKSDSSYNGFDP
輕鏈 VL RASQSISSSFLA SASSRATQQYATSLRT前述的抗體EV71FabK7，i)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將第16位的Arg替換為L(zhǎng)ys不會(huì)影響蛋白的功能。前述的抗體EV71FabK7，ii)其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將第8位的Val替換為Ala不會(huì)影響蛋白的功能。本發(fā)明還提供編碼所述抗體EV71FabK7的基因。其中，編碼輕鏈可變區(qū)和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。本發(fā)明還提供含有編碼所述抗體EV71FabK7的基因的載體及含有該載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供所述抗體EV71FabK7或其活性片段經(jīng)改造得到的單鏈抗體ScFv或全抗體免疫球蛋白IgG。本發(fā)明還提供所述抗體EV71FabK7或其活性片段的制備方法，利用噬菌體表面展示技術(shù)，采集多個(gè)EV71病人恢復(fù)期外周血淋巴細(xì)胞，通過(guò)基因工程方法構(gòu)建了人源抗EV71病毒基因工程抗體文庫(kù)，并篩選獲得特異性抗EV71病毒的基因工程抗體Fab段。該抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的，并能夠在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合EV71病毒的功能性抗體。它特異性識(shí)別EV71病毒顆粒抗原，與EV71病毒具有明顯的酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)和抗EV71病毒感染的中和活性功能。EV71FabK7特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來(lái)源于對(duì)人源抗EV71病毒抗體基因庫(kù)的特異性富積篩選，該抗體庫(kù)的建立來(lái)源于中國(guó)EV71病毒病人外周血淋巴細(xì)胞基因。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列組合及其CDR區(qū)之間的框架區(qū)序列構(gòu)成了該抗體可變區(qū)序列特征，EV71FabK7屬于抗體輕鏈家族VL1?？贵w蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列及其互補(bǔ)序列所決定，6個(gè)相應(yīng)的CDR區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定了本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合特征和抗EV71病毒功能特征。此外，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，對(duì)編碼上述Fab段抗體的基因序列進(jìn)行改造，獲得編碼具有相同功能的抗體的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表達(dá)抗體宿主的密碼子偏愛(ài)性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達(dá)效率。進(jìn)一步地，本發(fā)明將上述Fab抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)進(jìn)行重組，獲得分子量更小的單鏈抗體(ScFv)，該抗體同樣能夠特異性識(shí)別EV71病毒表面抗原，具有細(xì)胞內(nèi)、免疫的作用。單鏈抗體穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用?？蓪⑸鲜鼍幋aFab抗體的基因、ScFv基因克隆到表達(dá)載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)獲得Fab抗體以及單鏈抗體。此外，可將上述Fab抗體的輕鏈編碼基因和重Fd段基因克隆到全抗表達(dá)載體中，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，獲得表達(dá)抗EV71病毒的全抗免疫球蛋白。利用ELISA、SDS-PAGE、中和實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)獲得的Fab抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明人源Fab抗體EV71FabK7針對(duì)SHZH98株和FUYANG-0805株EV71病毒顆粒均有特異性結(jié)合，利用中和實(shí)驗(yàn)對(duì)Fab抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明EV71FabK7具有較好的中和活性。、
本發(fā)明還提供所述抗體EV71FabK7或其活性片段在制備預(yù)防或治療手足口病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步含有所述抗體EV71FabK7或其活性片段的藥物或檢測(cè)試劑。本發(fā)明利用噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)，成功地獲得了特異性針對(duì)EV71病毒的人源中和性抗體EV71FabK7 ;利用上述獲得的人源中和性抗EV71病毒基因工程抗體可變區(qū)基因、Fab抗體基因以及該抗體基因特征下的全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真核細(xì)胞及任何重組系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)該抗體或以此為基礎(chǔ)的改建后的含有該抗體基因的任何其他基因，獲得具有中和EV71病毒感染的抗體產(chǎn)物，制成臨床上用于預(yù)防和治療手足口病的特異性抗體藥物。


圖I為純化后EV71FabK7抗體的SDS-PAGE電泳圖；其中，I為純化抗體EV71FabK7。M為蛋白Marker。圖2為抗EV71病毒人源EV71FabK7抗體的ELISA檢測(cè)(SHZH98株)結(jié)果，其中陽(yáng)性對(duì)照為商業(yè)鼠抗，陰性對(duì)照為柯薩奇A4病毒抗體。圖3為抗EV71病毒人源EV71FabK7抗體的ELISA檢測(cè)(FUYANG-0805株)結(jié)果，其中陽(yáng)性對(duì)照為商業(yè)鼠抗，陰性對(duì)照為柯薩奇A4病毒抗體。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例I人源抗EV71病毒抗體庫(kù)的構(gòu)建及Fab抗體的篩選I. I材料和方法I. I. I病毒、細(xì)胞及載體來(lái)源EV71病毒SHZH98株和FUYANG-0805株已在文獻(xiàn)(Yang F，Jin Q, He Y，Li L, Hou Y. 2001. The complete genome of Enterovirus 71 Chinastrain.Sci China C Life Sci 和 Wu Z, Yang F, Zhao R, Zhao L, Guo D, Jin Q. 2009.Identification of small interfering RNAs which inhibit the replication ofseveral Enterovirus 71 strains in China. J Virol Methods)中公開(kāi)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所提供。用于EV71病毒體外中和實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞為RD細(xì)胞，購(gòu)自ATCC。菌株為XLl-Blue (Stratagene,美國(guó)),載體pComb3H(由美國(guó)Scripps研究所提供)。I. I. 2抗原制備
EV71病毒純化分別收獲EV71病毒SHZH98株和FUYANG-0805株感染RD細(xì)胞后培養(yǎng)上清，經(jīng)甲醛滅活和安全檢查后，用20%蔗糖密度梯度35000g，4°C離心3h純化病毒顆粒(Beckman SW28)。I. I. 3噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建用淋巴細(xì)胞分離液(Sigma，美國(guó))從EV71病人恢復(fù)期抗凝血液中分離淋巴細(xì)胞，用RNeasy Mini Kit (QIAGEN，德國(guó))提取總細(xì)胞RNA，以O(shè)ligo-dT為引物，提取的RNA為模版采用 Invitrogen公司的第一鏈合成試劑盒(SuperScriptTMIII First-Strand SynthesisSystemfor RT-PCR. Cat No. 18080-051)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。用一組擴(kuò)增人源抗體IgGl重鏈Fd及輕鏈Kappa和Lambda的引物,使用的弓I物序列如下
(一)重鏈Fd區(qū)引物5，端VHla 5，-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3’VHlf 5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’VH2f 5’-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3’VH3a 5’-GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3'VH3f 5’-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3'VH4f 5，-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3’VH6f 5’-CAG GTG CAG CTA CTA GAG TGG GG-3’VH6a 5’-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG-3’3，端CGlZ 5’-GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3'(二)輕鏈引物K鏈可變區(qū)5’ -端VKla 5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’VK2a 5’-GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3'VK3a 5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3'K鏈可變區(qū)3-端CKld 5，-GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCCTGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA-3’入鏈可變區(qū)5_端VLl 5’-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC-3’VL2 5，-TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG-3’VL3 5，-TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3'VL4 5’-TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3'VL5 5’-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3’VL6 5，-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3'入鏈可變區(qū)3-端CL2 5’-CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’對(duì)人源輕鏈和重鏈Fab基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94°C lmin，54°C lmin,72°C 2min,共35個(gè)循環(huán)。建庫(kù)方法基本按文獻(xiàn)(Barbas, C. Fill. , Kang, A. S. , and larner, R.A.Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface: the gene IIIsite. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88 (18) :7978-7982)進(jìn)行。具體如下首先將所有不同的重鏈和輕鏈PCR產(chǎn)物分別按各自組群混合。取經(jīng)XbaI和SacI酶切消化，并經(jīng)電泳純化后的pComb3H載體DNA1. 5-2 u g與輕鏈混合物500_700ng，加入2u I高濃度連接酶(NEB2000U/iil)，加入連接緩沖液，16°C過(guò)夜連接。次日加入100 yl純化水，加入3M NaAc 16 yl，加2. 5-3倍無(wú)水乙醇沉淀DNA，離心沉淀，用20 U I純水重懸沉淀后加入到電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌XLl-Blue中，電壓2. 5kv，電擊I分鐘。電轉(zhuǎn)后立即加入2ml SOC培養(yǎng)液，然后立即轉(zhuǎn)入細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37°C振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。將菌液全部涂于含氨芐青霉素的LB平皿上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。次日向平皿中加入10-15ml培養(yǎng)液，刮取菌斑，分裝于離心管，12000rpm離心后棄上清，全部用QIAGEN大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒pComb3H-L，混合后凍存于-20°C待用。將克隆入L鏈的pComb3H-L和Fd鏈純化PCR產(chǎn)物，分別用XhoI和SpeI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，37°C 3-4h。電泳回收相應(yīng)的條帶，將質(zhì)粒和Fd酶切后回收產(chǎn)物定量。取酶切消化后回收純化的載體DNA g，重鏈PCR產(chǎn)物600ng左右，加入2iU高濃度連接酶，力口入相應(yīng)的連接緩沖液，16°C連接過(guò)夜。次日加100 Ul純化水，加3M NaAc 16^1，加2. 5-3 倍無(wú)水乙醇沉淀DNA，離心沉淀，用20iU純水重懸沉淀并加入到電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌XLl-Blue中，電壓2. 5kv,電擊I分鐘。電轉(zhuǎn)后立即加入2ml SOC培養(yǎng)液，然后立即轉(zhuǎn)入細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)lh。將菌液轉(zhuǎn)入一個(gè)三角瓶中，加入含20 y g/ml氨芐青霉素的10ml SB-A+，370C 200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。加入IOOml SB培養(yǎng)液(含100 u g/ml的Amp和20ii g/ml的Tet)，震蕩培養(yǎng)I小時(shí)。加入1012pfu輔助噬菌體VCSM13，37°C靜止感染20min，然后37°C培養(yǎng)2h加入終濃度為70 ii g/ml的Kan，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。待0D600約為I時(shí)，將菌液4°C 4000rpm離心15min,轉(zhuǎn)移上清至無(wú)菌三角瓶中，加入4% (w/v)PEG8000和3% (w/v)NaCl，完全溶解后冰浴30min以上以沉淀噬菌體。4°C 9000rpm離心20_30min，棄上清將沉淀用2ml PBS重懸，瞬時(shí)離心，上清即為Fab噬菌體抗體庫(kù)。I. I. 4噬菌體抗體庫(kù)的富集篩選及Fab段抗體的誘導(dǎo)表達(dá) 以超速離心純化的滅活病毒顆粒SHZH98和FUYANG-0805株為篩選抗原。使用時(shí)用0. IM NaHCO3 (pH8. 6)溶液稀釋?zhuān)幻庖吖?，用?%脫脂奶的PBS液，于37°C封閉2h后，力口入上述噬菌體抗體庫(kù)，每管lml，37°C孵育2h，用含5%TWeen-20的TBS液反復(fù)洗20遍，最后每管用Iml pH2. 2的甘氨酸-鹽酸洗脫液洗脫，并用pH9. 6的Tris液中和。洗脫后的噬菌體繼續(xù)感染2ml新鮮的OD6tltl為I. 0左右的XLl-Blu菌，經(jīng)輔助噬菌體VCSM13 (Stratagene,美國(guó))感染后進(jìn)行下一輪篩選。如此反復(fù)篩選3 4次。具體富集篩選方法及Fab段的誘導(dǎo)表達(dá)基本按文獻(xiàn)(Barbas, C. Fill.，Kang, A. S.，and larner, R. A. Assembly of combinatorialantibody libraries on phage surface: the gene III site. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 1991; 88 (18) :7978-7982)進(jìn)行。噬菌體抗體庫(kù)的富集用0. IM NaHCO3CpH8. 6)的溶液將純化的SHZH98株按I :100稀釋分別包被96孔板，4°C過(guò)夜。次日用PBS-T(20mM PBS加入0. 05% Tween-20)洗去未吸附的抗原，用3%的脫脂奶37°C封閉lh。棄封閉液，每孔加入60iU噬菌體抗體庫(kù)，37°C孵育 2h。棄去孔中未結(jié)合的噬菌體，用 TBS-T(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0. 5% Tween-20,pH7. 5)洗液沖洗各孔，沖洗時(shí)用移液器反復(fù)吹打，共洗20次，以充分洗去未吸附的噬菌體。最后用ddH20洗兩遍，吸凈孔中剩余液體。每孔加入50 ill Glycine-HCl (pH2. 2)的洗脫液，室溫孵育lOmin，在此過(guò)程中，用移液器吸頭反復(fù)吹打(注意勿吹出氣泡)。將洗脫液集中于一個(gè)離心管，按照每孔3 的比例加入2M Tris，使溶液pH值約為7，以中和洗脫下的噬菌體。將洗脫的噬菌體立即加入2ml新鮮的XLl-Blue菌液中(0D600 = I),室溫孵育20min。轉(zhuǎn)入一個(gè)250ml三角瓶中，加入IOml SB(含氨芐青霉素20 y g/ml和四環(huán)素20 y g/ml )，立即取10 ill涂于氨芐平皿，用于滴定噬菌體。其余液體37 °C振蕩培養(yǎng)Ih。加入IOOmlSB (含氨芐青霉素IOOii g/ml和四環(huán)素20 ii g/ml)，37°C振蕩培養(yǎng)2h。之后，加入輔助噬菌# VCSMl3 (9X1012pfu/ml) lml，37°C靜止 20min，37°C振蕩培養(yǎng) 2h。加入卡那霉素(終濃度70 ii g/ml)，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)菌長(zhǎng)到0D600約為I時(shí)，將菌液4°C 6500rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清至無(wú)菌三角瓶，加入4% (ff/V) PEG8000和3% (ff/V) NaCl，完全溶解后冰浴30min以上以充分沉淀噬菌體。4°C 9000rpm離心20-30min，棄上清。將沉淀用2ml PBS重懸，瞬時(shí)離心，上清即為第一輪富集篩選Fab噬菌體抗體庫(kù)。 Fab陽(yáng)性克隆的表達(dá)隨機(jī)挑選2000個(gè)經(jīng)3次富集篩選后的單菌落于96深孔板中，每孔800 ill培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。次日以1:20的比例轉(zhuǎn)接至含有800 ill SB培養(yǎng)基(含Amp IOOu g/ml)的96孔板中，37°C培養(yǎng)至0D600 = 0. 2-0. 3時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG, 30°C誘導(dǎo)表達(dá)8-10hr。4°C 4000rpm離心15min,上清用于檢測(cè)。1.1.5人源抗EV71病毒Fab抗體的ELISA檢測(cè)(I)檢測(cè)Fab的表達(dá)用0. IM NaHCO3 (pH9. 6)溶液將抗人Fab抗體(I 2000稀釋后使用，Sigma,美國(guó))包被于酶標(biāo)板上，4°C過(guò)夜；4%脫脂奶封閉，37°C lh，加入表達(dá)的Fab抗體，37°C Ih ;加入酶標(biāo)抗人Fab 二抗(I 2000稀釋后使用，Sigma，美國(guó))，37°C Ih;顯色液顯色，2M H2SCU*止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A值。(2)間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)Fab與EV71病毒結(jié)合活性用純化的滅活EV71病毒顆粒作為包被抗原，其余步驟同上。I. I. 6人源Fab抗體可變區(qū)基因的核酸序列分析用Qiagen Miniprep Kit (QIAGEN,德國(guó))制備質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行核酸序列分析。輕重鏈的測(cè)序引物分別為5 ' -AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3丨和5 ; -CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3 ;。將測(cè)序結(jié)果與 Internet V-Base 基因庫(kù)中 IgG 基因序列進(jìn)行比較。I. I. 7人源抗EV71病毒Fab抗體的純化用抗人Fab的抗體(Sigma,美國(guó))制備2ml親和層析柱,將濾過(guò)的含F(xiàn)ab抗體的菌液加于親和層析柱中，反復(fù)循環(huán)30min至lh。加入pH值6. 8的PBS預(yù)洗緩沖液，洗去非特異性吸附蛋白。加入pH值2. 7的甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫結(jié)合的Fab抗體蛋白，加入pH值
9.0的Tris-HCl緩沖液中和洗脫下來(lái)的溶液，然后用濃縮柱離心濃縮。取純化濃縮后的Fab片段蛋白10 20 u g進(jìn)行SDS-PAGE電泳。I. I. 8人源抗EV71病毒Fab抗體的中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)( I)實(shí)驗(yàn)步驟將100TCID50EV71病毒25 U I和倍比稀釋的抗體25 iU于37°C共同孵育2小時(shí)，然后加入濃度為2 X IO5個(gè)RD細(xì)胞/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液50iU。觀察7天，記錄細(xì)胞病變結(jié)果。
(2)結(jié)果判定當(dāng)最高稀釋度抗體的2孔中有I孔出現(xiàn)細(xì)胞病變，另一孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，該稀釋度的倒數(shù)即為該抗體的中和抗體效價(jià)；當(dāng)高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該抗體的中和抗體效價(jià)；當(dāng)兩個(gè)相鄰稀釋度抗體均出現(xiàn)I孔細(xì)胞病變，另I孔不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該抗體的中和抗體效價(jià)。I. 2 結(jié)果I. 2. I人源抗EV71病毒抗體庫(kù)的篩選用純化的EV71病毒顆粒SHZH98株對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選，3輪篩選后隨機(jī)挑取2000個(gè)克隆。用抗人Fab抗體(I 2000稀釋后使用，Sigma，美國(guó))和EV71病毒顆粒SHZH98株抗原包被96孔板，加入待測(cè)樣品上清，用酶標(biāo)抗人Fab 二抗(I 2000稀釋后使用，Sigma，美國(guó))檢測(cè)。結(jié)果顯示共獲得816個(gè)人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆，其中，413個(gè)克隆能 夠特異性結(jié)合EV71病毒顆粒SHZH98株(表2)。表2SHZH98株對(duì)噬菌體抗體庫(kù)富集篩選結(jié)果
權(quán)利要求
1.人源抗EV71病毒中和性抗體EV71FabK7或其活性片段，其特征在于，其輕鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如下表所示
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗體EV71FabK7，其特征在于， i)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及 ii)其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求2所述抗體EV71FabK7的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，編碼輕鏈可變區(qū)和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的載體。
6.含有權(quán)利要求5所述載體的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求I或2所述抗體EV71FabK7或其活性片段經(jīng)改造得到的單鏈抗體ScFv或全抗體免疫球蛋白IgG。
8.權(quán)利要求I或2所述抗體EV71FabK7或其活性片段的制備方法，其特征在于，利用噬菌體表面展示技術(shù)，采集多個(gè)具有高滴度EV71病毒抗體的病人外周血淋巴細(xì)胞，通過(guò)基因工程方法構(gòu)建了人源抗EV71病毒基因工程抗體文庫(kù)，并篩選獲得特異性抗EV71病毒的基因工程抗體Fab段，命名為EV71FabK7。
9.權(quán)利要求I或2所述抗體EV71FabK7或其活性片段在制備預(yù)防或治療手足口病的藥物中的應(yīng)用。
10.含有權(quán)利要求I或2所述抗體EV71FabK7或其活性片段的藥物或檢測(cè)試劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用噬菌體表面展示技術(shù)篩選獲得的人源抗EV71病毒中和性抗體EV71FabK7，其輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。該抗體能夠特異性識(shí)別EV71病毒顆?？乖?，可與EV71病毒發(fā)生顯著的酶聯(lián)免疫反應(yīng)且具有抗EV71病毒感染的中和活性功能。此外，可將本發(fā)明的抗體制成預(yù)防和治療手足口病的特異性抗體藥物，從而在臨床中用于預(yù)防和治療由EV71病毒引起的手足口病。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102718864SQ20121020784
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月21日
發(fā)明者金奇, 陳哲 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所