一種三聚體trail蛋白及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體設及一種S聚體TRAIL蛋白及其應用。
【背景技術】
[0002] 近年來，由于生物制藥技術的發(fā)展使得蛋白質(zhì)或多膚類藥物大量生產(chǎn)成為可能， 但是多膚藥物存在著體內(nèi)循環(huán)的半衰期短、易在胃腸道內(nèi)被蛋白水解酶破壞、水溶性差、抗 原性較強引起過敏、W及易于引起中和抗體的產(chǎn)生等缺點，限制著它的應用。因此，現(xiàn)有技 術中針對具有醫(yī)療作用的蛋白質(zhì)或多膚進行PEG定點修飾來使其走向藥物應用的技術被廣 泛研究。蛋白質(zhì)或多膚的聚乙二醇（polyethylene glycol ,PEG)修飾即PEG化 (pegylation)，是將活化的PEG通過化學方法W共價鍵偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或多膚分子上。自1977 年化ViS首次采用PEG修飾牛血清白蛋白W來，PEG修飾技術迅速發(fā)展，并廣泛應用于多種蛋 白質(zhì)和多膚的化學修飾，PEG修飾技術也從理論走向?qū)嶋H的藥物應用。
[0003] PEG修飾能賦予蛋白質(zhì)和多膚類多種優(yōu)良性能，具體表現(xiàn)為循環(huán)半衰期延長、免疫 原性降低或消失、毒副作用減少W及物理、化學和生物穩(wěn)定性增強等，在很大程度上擴寬了 蛋白質(zhì)和多膚的的應用范圍。其機理可能為:蛋白質(zhì)PEG修飾后，相對分子質(zhì)量(化)增大，當 修飾后的蛋白質(zhì)的化達到或超出腎小球濾過闊值時，蛋白質(zhì)隨血液循環(huán)進入腎臟后就可W 逃避腎小球的濾過作用；由于PEG的屏蔽效應，使得修飾后的蛋白質(zhì)或多膚不易受到各種蛋 白酶的攻擊，降解速率明顯降低，穩(wěn)定性提高，因而可W在血液循環(huán)中停留更長的時間;PEG 在溶液中呈無規(guī)則卷曲，作為一種屏障，能掩蓋蛋白質(zhì)表面的抗原決定簇，使得蛋白質(zhì)不能 與各種細胞表面受體結(jié)合，不被機體的免疫系統(tǒng)識別，避免了相應抗體的產(chǎn)生，降低了蛋白 質(zhì)的免疫原性;PEG與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后能將其優(yōu)良的理化性質(zhì)賦予蛋白質(zhì)，如能改善蛋白質(zhì)的 生物分布和溶解性能。
[0004] 腫瘤壞死因子相關調(diào)亡誘導配體（tumor necrosis factor relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)也稱為調(diào)亡素-2配體(Ap〇-2L)，是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子 (TNF)基因超家族成員，屬于II型跨膜蛋白（transmembrane protein)。TRAIL是一個由281 個氨基酸構成的11型跨膜蛋白，其中從第114個精氨酸（arginine)到第281個甘氨酸 (glysine)的序列為誘導癌細胞調(diào)亡的主要功能區(qū)域。它能通過與死亡受體結(jié)合選擇性誘 導多種腫瘤細胞與轉(zhuǎn)化細胞發(fā)生調(diào)亡，而對正常組織和細胞幾乎沒有不良反應。運一特性 使得TRAIL在腫瘤的祀向治療中具有良好的應用前景，被認為是一種非常具有發(fā)展?jié)摿Φ?抗腫瘤因子，近年已成為國內(nèi)外研究的熱點。但單體結(jié)構的TRAIL不能誘導細胞調(diào)亡，只有 S聚體結(jié)構的TRAIL才能與死亡受體(DR4，DR5)相結(jié)合發(fā)揮細胞調(diào)亡的作用。但是在自然情 況下TRAIL很難形成S聚體結(jié)構，把TRAIL應用到臨床上仍有許多問題亟待解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是為解決利用聚乙二醇修飾腫瘤壞死因子相關調(diào)亡誘導配體 的難題，提供一種S聚體TRAIL蛋白及其應用，利用祀T表達載體對人類TRAIL基因（114-281 序列）進行基因克隆制作出具有N-末端組氨酸標簽化istidine tag)和異亮氨酸拉鏈基序 化eucine zipper)的TRAIL重組基因（pET23dw-His-ILZ-hTRAIL( 114-281 )，簡稱監(jiān)-TRAIL)。利用陽Gylation技術將TRAIL重組基因改良成新的陽G-HZ-TRAIL，生產(chǎn)S聚體的高 活性TRAIL蛋白質(zhì)，并且本發(fā)明的S聚體TRAIL蛋白對抗腫瘤和抗類風濕關節(jié)炎的具有高藥 效的優(yōu)點。
[0006] 為了達到上述技術效果，本發(fā)明的技術方案包括：
[0007] 一種S聚體TRAIL重組蛋白，所述S聚體TRAIL重組蛋白由TRAIL的114-281氨基酸 序列與載體PET進行基因克隆制備出具有N-末端組氨酸標簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因 pET23dw-His-ILZ-hTRAILl 14-281 的 TRAIL 重組蛋白，簡稱監(jiān)-TRAIL，所述監(jiān)-TRAIL 再經(jīng)聚 乙二醇修飾，使PEGW共價鍵偶聯(lián)到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，得到所述經(jīng)聚乙二醇修飾 TRAIL重組蛋白，即PEG-HZ-TRAIL蛋白。
[000引所述的S聚體TRAIL重組蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0009] -種經(jīng)S聚體TRAIL重組蛋白，適用于在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞中表達。
[0010] 所述的陽G-HZ-TRAIL蛋白可誘導癌細胞或炎性淋己細胞調(diào)亡。
[0011] 所述的陽G-HZ-TRAIL蛋白可應用于抗腫瘤藥物中。
[0012] 所述的陽G-HZ-TRAIL蛋白可應用于類風濕性關節(jié)炎藥物中。
[0013] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0014] 1、本發(fā)明一種S聚體TRAIL蛋白及其應用，利用陽Gylation技術將監(jiān)-TRAIL改良 成新的PEG-監(jiān)-TRAIL,改善了 TRAIL固有的諸多問題比如減少藥物降解及損失，從而延長了 TRAIL的半衰期、通過延緩蛋白的排泄，提高其抗酶解的能力，增加其溶解性與穩(wěn)定性，W及 降低其免疫原性，顯著
[0015] 延長TRAIL的體內(nèi)生物活性。另外，通過進一步研究證明了
[0016] PEG-HZ-TRAIL在抗腫瘤和抗類風濕關節(jié)炎的藥效。
[0017] 2、本發(fā)明一種S聚體TRAIL蛋白及其應用，PEG-HZ-TRAIL可W誘導多種癌細胞的 調(diào)亡，而對正常組織和細胞無任何副作用。
[0018] 3、本發(fā)明一種S聚體TRAIL蛋白及其應用，PEG-監(jiān)-TRAIL在RA發(fā)病過程中通過誘 導炎性淋己細胞的調(diào)亡，降低炎癥反應，對關節(jié)起保護作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1所示為本發(fā)明一種立聚體TRAIL重組蛋白PEG-HZ-TRAIL制備模式圖；
[0020] 圖2所示為本發(fā)明一種S聚體TRAIL重組蛋白監(jiān)-TRAIL的制備模式圖；
[0021] 圖3A所示為在一般生理環(huán)境條件下監(jiān)-TRAIL和陽G-監(jiān)-TRAIL溶解度隨時間變化 圖；
[0022] 圖3B所示為在血漿溶液中監(jiān)-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度隨時間變化圖；
[0023] 圖4所示為本發(fā)明實施例5監(jiān)-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的藥代動力學比較分析圖；
[0024] 圖5所示為本發(fā)明實施例6 PEG-HZ-TRAIL對大腸癌細胞化CT116)殺傷能力測定 圖；
[0025] 圖6所示為本發(fā)明實施例6陽G-HZ-TRAIL對結(jié)腸癌細胞化CT116)的調(diào)亡能力測定 圖；
[00%] 圖7A所示為本發(fā)明實施例6監(jiān)-TRAIL和PEG-監(jiān)-TRAIL的抗移植瘤效能比較分析 圖；
[0027]圖7B所示為本發(fā)明實施例6 PEG-HZ-TRAIL的抗移植瘤效能比較分析圖；
[002引圖7C所示為本發(fā)明實施例6監(jiān)-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的肝臟組織病理學變化圖； [00巧]圖7D所示為本發(fā)明實施例6監(jiān)-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的腫瘤組織病理學變化圖。
[0030] 圖8所示為本發(fā)明實施例7建立類風濕關節(jié)炎動物模型和處理藥物流程圖；
[0031] 圖9A所示為本發(fā)明實施例7 PEG-監(jiān)-TRAIL對類風濕關節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的 濃度依賴性發(fā)病率變化圖；
[0032] 圖9B所示為本發(fā)明實施例7陽G-監(jiān)-TRAIL對類風濕關節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的 濃度依賴性關節(jié)炎指標的變化圖；
[0033] 圖IOA所示為本發(fā)明實施例7野生型小鼠；
[0034] 圖IOB所示為本發(fā)明實施例7野生型小鼠炎性淋己細胞；
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