L相比具有更好的腫瘤細胞調(diào)亡能力。
[0092] 實施例7 PEG-HZ-TRAIL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療效果測定
[0093] ( Dpeg-HZ-TRAIL在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中對臨床指數(shù)的影響
[0094] 實驗方法：（類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型）
[0095] ①實驗動物:DBA/1J小鼠，雄性，7-8周齡，體重20±0.34g，飼養(yǎng)于SPF屏障系統(tǒng)動 物室。
[0096] ②CIA小鼠模型建立:a)將II型膠原(CII)溶于0.05mol/L的冰醋酸中，濃度為2mg/ ml,將溶解的膠原與CFA等體積混合，冰浴中使用勻漿器充分乳化。b)免疫動物時，在小鼠尾 根部多點皮內(nèi)注射0.1ml乳劑(含IOOmg CH和200mg結(jié)核分枝桿菌）?；A(chǔ)免疫后第21天W 同樣方法重復(fù)，避開初次免疫部位，進行加強免疫。
[0097] ③藥物處理:a)分為5個實驗組，即野生型小鼠（對照組）10只，陽性對照組(PBS)
[0098] 10只，W及處理不同濃度陽G-監(jiān)-TRAIL的小鼠巧化g/mouse，150yg/mouse，300iig/ mouse)各10只，總共50只。b)對于處理不同濃度陽G-監(jiān)-TRAIL的小鼠，加強免疫后第21天開 始每3天或每1周處理1次（i.p，5化1)藥物，直到實驗結(jié)束(初次免疫后第51天)為止。如圖8 所示建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動物模型和處理藥物流程。
[0099] ④檢測分析:通過觀察關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)外病變及利用關(guān)節(jié)炎評分方法，比較分析各組 之間
[0100] RA的各種指標(biāo)包括關(guān)節(jié)炎臨床指數(shù)(Clinical score)，發(fā)病率（Incidence)等。評 分方法:《0》無紅腫；《1》關(guān)節(jié)紅不腫；《2》關(guān)節(jié)輕度紅腫；《3》關(guān)節(jié)中度紅腫；《4》關(guān)節(jié)重度紅 腫伴功能障礙。關(guān)節(jié)炎分數(shù)為每只小鼠所有病變關(guān)節(jié)分數(shù)的總和，最高分為16分。測定結(jié)果 見圖9APEG-HZ-TRAIL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的濃度依賴性關(guān)節(jié)炎指標(biāo)的變化 圖，圖9B陽G-監(jiān)-TRAIL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模式小鼠（CIA)治療的濃度依賴性發(fā)病率變化圖。 由圖9結(jié)果可知，PEG-監(jiān)-TRAIL對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有良好的治療效果。CIA的臨床指數(shù)也隨 藥物濃度的增加而逐漸減少。同樣其CIA發(fā)病率隨藥物濃度的增加而逐漸降低。
[0101] (2)PEG-HZ-TRAIL在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中對炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用
[0102] 實驗方法：
[0103] ①采樣:將上述藥物處理③野生型小鼠（對照組）、陽性對照組(PBS)、W及處理不 同濃度PEG-監(jiān)-TRAIL的小鼠（初次免疫后第51天），利用乙酸麻醉脫頸處死小鼠并采樣，包 括肘關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)，外周血清，W及組織臟器等。關(guān)節(jié)除去病變關(guān)節(jié)的皮毛和多余的皮下組 織、保留巧趾關(guān)節(jié)，并用4%多聚甲醒固定，10%邸TA脫巧，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。
[0104] ②檢測分析:a)利用組織病理學(xué)方法化/E staining)比較分析各組之間肘關(guān)節(jié)和 膝關(guān)節(jié)的炎癥程度(滑膜細胞與炎性淋己細胞浸潤）。6)利用EILSA方法和免疫染色方法比 較分析各組之間外周血請W及關(guān)節(jié)腔中的炎性介子(TNF-a，比-10，比-2，IFN- 丫）的水平。
[0105] 測定結(jié)果見圖10對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型（CIA)處理不同濃度陽G-監(jiān)-TRAIL后關(guān) 節(jié)組織病理學(xué)變化圖，由圖10結(jié)果可知，PEG-HZ-TRAIL在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中對炎癥 具有良好的抑制效果，炎性淋己細胞和滑膜細胞的浸潤程度隨藥物濃度的增加而逐漸降 低。
[0106] 圖11對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠模型(CIA)處理不同濃度陽G-HZ-TRAIL后，血清中促炎
[0107] 介質(zhì)水平的變化圖。圖11A、圖11B、圖1IC和圖1ID所示可知陽G-HZ-TRAIL在類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎發(fā)病過程中對炎癥具有良好的抑制效果，血清中促炎介質(zhì)（TNF-a，化-10，IFN-T， 比-2)的水平隨藥物濃度的增加而逐漸降低。
[0108] 由上述內(nèi)容可知，本發(fā)明提供的一種S聚體TRAIL蛋白及其應(yīng)用，利用祀T表達載 體對人類TRAIL基因（114-281序列）進行基因克隆制作出具有N-末端組氨酸標(biāo)簽 (Histidine 1:ag)和異亮氨酸拉鏈基序(Xeucine zipper)的TRAIL重組基因（96123(1￥-化3-ILZ-hTRAIL( 114-281)，簡稱監(jiān)-TRAIL)。利用陽Gylation技術(shù)將TRAIL重組基因改良成新的 PEG-HZ-TRAIL，生產(chǎn)S聚體的高活性TRAIL蛋白質(zhì)，并且本發(fā)
[0109] 明的利用聚乙二醇修飾腫瘤壞死因子相關(guān)調(diào)亡誘導(dǎo)配體對抗腫瘤和抗類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎的具有高藥效的優(yōu)點。
[0110] 上述詳細說明是針對發(fā)明的可行實施例的具體說明，該實施例并非用W限制本發(fā) 明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實施或變更，均應(yīng)當(dāng)包含于本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
[0111] 另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可在本發(fā)明權(quán)利要求公開的范圍和精神內(nèi)做其它形式和 細節(jié)上的各種修改、添加和替換。當(dāng)然，運些依據(jù)本發(fā)明精神所做出的各種各種修改、添加 和替換等變化，都應(yīng)包含在本發(fā)明所要求保護的范圍之內(nèi)。
[0112]
【主權(quán)項】
1. 一種三聚體TRAIL重組蛋白，其特征在于，所述三聚體TRAIL重組蛋白由TRAILm-281氨 基酸序列與載體PET進行基因克隆制備出具有N-末端組氨酸標(biāo)簽和異亮氨酸拉鏈基序重組 基因 PET23dw-Hi s-ILZ-hTRAILm-281的TRAIL重組蛋白，簡稱重組蛋白HZ-TRAIL，所述重組 蛋白HZ-TRAIL再經(jīng)聚乙二醇修飾，使PEG以共價鍵偶聯(lián)到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，得到 所述經(jīng)聚乙二醇修飾TRAIL重組蛋白，即PEG-HZ-TRAIL蛋白。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種三聚體TRAIL重組蛋白，其特征在于，所述的重組蛋白HZ-TRAIL的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種經(jīng)三聚體TRAIL重組蛋白，其特征在于，所述三聚體TRAIL 重組蛋白適用于在大腸桿菌、酵母和哺乳動物細胞中表達。4. 權(quán)利要求1~3任一項所述的一種三聚體TRAIL重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述的 PEG-HZ-TRAIL蛋白可誘導(dǎo)癌細胞或炎性淋巴細胞凋亡。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種三聚體TRAIL重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可應(yīng)用于抗腫瘤藥物中。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種三聚體TRAIL重組蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎藥物中。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種三聚體TRAIL蛋白及其應(yīng)用，所述三聚體TRAIL重組蛋白由TRAIL的114-281氨基酸序列與載體PET進行基因克隆制備出具有N-末端組氨酸標(biāo)簽和異亮氨酸拉鏈基序重組基因pET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重組蛋白，簡稱HZ-TRAIL，所述HZ-TRAIL再經(jīng)聚乙二醇修飾，使PEG以共價鍵偶聯(lián)到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，得到所述經(jīng)聚乙二醇修飾TRAIL重組蛋白，即PEG-HZ-TRAIL蛋白。利用PEGylation技術(shù)將TRAIL重組基因改良成新的PEG-HZ-TRAIL，生產(chǎn)三聚體的高活性TRAIL蛋白質(zhì)，并且本發(fā)明的三聚體TRAIL蛋白對抗腫瘤和抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎具有高藥效的優(yōu)點。
【IPC分類】A61P29/00, C07K19/00, A61P35/00, A61K38/17, A61K47/48, A61P19/02
【公開號】CN105693864
【申請?zhí)枴緾N201510875198
【發(fā)明人】金成浩, 孫虎男, 金穎華, 魯文賡, 臧延青, 劉暢
【申請人】黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2015年12月2日