專(zhuān)利名稱(chēng)：：大豆球蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種大豆球蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大豆作為人和動(dòng)物優(yōu)質(zhì)的植物蛋白和油脂來(lái)源，具有廣泛應(yīng)用。大豆及豆制品大量應(yīng)用于食品行業(yè)，玉米-豆粕型日糧作為主要的動(dòng)物飼料廣泛應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)。但是大豆球蛋白作為含量豐富、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、具有較強(qiáng)免疫原性的大豆抗原蛋白，經(jīng)常引起過(guò)敏反應(yīng)，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常表現(xiàn)為嬰幼兒腹瀉，以及5-6%的兒童和2-4%的成年人對(duì)大豆和豆制品表現(xiàn)出臨床癥狀，常表現(xiàn)為腹瀉，嚴(yán)重的伴有顫抖、咽喉水腫和急性哮喘等癥狀；在畜牧行業(yè)，大豆抗原蛋白可導(dǎo)致斷乳仔豬和妊娠母豬、犢牛、大鼠等幼齡動(dòng)物的過(guò)敏反應(yīng)，常表現(xiàn)為腹瀉、生長(zhǎng)性能下降直至死亡。目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種加工工藝來(lái)處理大豆、豆粕及豆制品，如多項(xiàng)研究證實(shí)豆粕、膨化大豆、發(fā)酵豆粕、大豆?jié)饪s蛋白和大豆分離蛋白等大豆制品的抗原活性弱于生大豆。然而大豆球蛋白是熱穩(wěn)定性的抗原蛋白，直接加熱并不能徹底破壞其抗原活性。例如，經(jīng)過(guò)加熱處理的大豆制品中具有抗原活性的球蛋白殘留量仍高達(dá)18%,這個(gè)量足以引起嬰兒的過(guò)敏反應(yīng)。所以，對(duì)不同加工工藝處理前后大豆、豆制品、豆粕飼料中大豆球蛋白含量的檢測(cè)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。己有的定量檢測(cè)方法主要以抗血清測(cè)定和高效液相色譜分析為主。這些方法從免疫學(xué)角度來(lái)看仍存在一定的缺陷，前者多抗血清需要重復(fù)制備、不同實(shí)驗(yàn)室之間不能參比、靈敏度和準(zhǔn)確性低；后者則無(wú)法體現(xiàn)免疫反應(yīng)性，并且由于前處理過(guò)程繁瑣和需要昂貴的專(zhuān)門(mén)儀器而難以廣泛應(yīng)用于大豆制品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可用于檢測(cè)大豆球蛋白的單克隆抗體與分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞。本發(fā)明所提供的分泌大豆球蛋白的單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCCNa2791的抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2產(chǎn)生。該單克隆抗體為包含k輕鏈的鼠IgG2抗體，其親和常數(shù)(Ka)為3.3x108L/mol?？勾蠖骨虻鞍讍慰寺】贵w細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791已于2008年12月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路)，保藏登記號(hào)為CGMCCNo.2791。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有上述單克隆抗體的檢測(cè)大豆球蛋白的試劑盒。為了更方便現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控和大量樣本篩查，本發(fā)明所提供的含有上述單克隆抗體的檢測(cè)大豆球蛋白的試劑盒中，還含有其它酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑，如酶標(biāo)二抗、大豆球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液、顯色液、終止液、洗滌液等。將上述大豆球蛋白的單克隆抗體和固相載體相偶聯(lián)得到的免疫親和吸附劑，以該免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱和含有該免疫親和吸附劑和免疫親和色譜柱的試劑盒均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。其中，所述固相載體可為纖維素、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃、瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺-瓊脂糖凝膠等親和層析載體。本發(fā)明制備的大豆球蛋白單克隆抗體，為大豆球蛋白的基礎(chǔ)研究、品種篩選和改造、臨床診斷提供了有利的工具，可用于深入研究大豆球蛋白的生物學(xué)效應(yīng)。具體而言可應(yīng)用于.-(1)飼料行業(yè)、食品行業(yè)高通量快速檢測(cè)大豆、豆粕、豆制品、豆粕飼料中大豆球蛋白的含量；(2)將該抗體作為研究大豆抗原性的工具，進(jìn)行大豆種質(zhì)資源篩選、品種改造；(3)應(yīng)用該抗體制備免疫親和柱，來(lái)分離純化大豆球蛋白；(4)應(yīng)用該抗體進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究；(5)將大豆球蛋白單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記(如用FITC進(jìn)行標(biāo)記)，用于臨床診斷或輔助診斷對(duì)大豆食物過(guò)敏的患者；(6)應(yīng)用該抗體進(jìn)行免疫組化檢測(cè)大豆球蛋白在器官組織、各種體液的分布；(7)應(yīng)用該抗體作為大豆球蛋白的拮抗劑，可以進(jìn)行藥理學(xué)研究，用于治療大豆抗原蛋白過(guò)敏性疾病。用本發(fā)明的大豆球蛋白單克隆抗體檢測(cè)大豆球蛋白，克服了傳統(tǒng)的SDS-PAGE、多抗血清間接性ELISA檢測(cè)方法存在的不同實(shí)驗(yàn)室之間不能參比、靈敏度和準(zhǔn)確性低、需要重復(fù)免疫制備多抗血清的缺點(diǎn)，其檢測(cè)準(zhǔn)確性接近反相高效液相法(RP-HPLC)，而且成本很低，可滿(mǎn)足詞料行業(yè)、食品行業(yè)相關(guān)企業(yè)單位高通量快速檢測(cè)大豆、豆粕、豆制品中大豆球蛋白含量的需要，在大豆制品抗原物質(zhì)定量檢測(cè)和致過(guò)敏性的評(píng)估中具有廣闊的應(yīng)用前景。圖1為SDS-PAGE分析純化的大豆球蛋白樣品。圖中條帶a:空白對(duì)照；條帶b:提取的大豆球蛋白粗樣品；條帶C:純化的大豆球蛋白樣品。圖2抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體的效價(jià)曲線。圖中每一個(gè)點(diǎn)代表在ELISA分析中8個(gè)重復(fù)測(cè)定的平均值(n^8)。包被抗原大豆球蛋白的濃度為50.0pg/mL，單抗的起始濃度為1.0mg/mL。(橫坐標(biāo)是指10的n次方，比如說(shuō)4對(duì)應(yīng)的就是104，即該點(diǎn)代表稀釋10000倍)。圖3抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體與大豆及其制品的免疫印跡分析。圖中條帶a:提取的大豆球蛋白粗樣品；條帶b:純化的大豆球蛋白樣品。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試劑，如無(wú)特別說(shuō)明，均從商業(yè)途徑獲得。實(shí)施例l、抗大豆球蛋白單克隆抗體的制備1、大豆球蛋白的提取和純化采用分級(jí)鹽析與凝膠過(guò)濾相結(jié)合的方法制備。具體步驟如下l丄大豆脫皮后磨漿，過(guò)濾后乙醚萃取脫脂，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘留乙醚，制得脫脂大豆粉。1.2.在室溫條件下，向脫脂大豆粉中加入0.03M的Tris-HCl(pH8.0，10mM(3-巰基乙醇(購(gòu)自上海Aladdin,貨號(hào)1093795))緩沖液(1:20)，溶解，10,000rpm/min離心30min，收集上清液。1.3.以HC1調(diào)節(jié)pH至6.4，10,000rpm/min(4°C)離心30min，收集沉淀用磷酸鹽緩沖液(添加10mmol/LP-巰基乙醇的0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS)，pH8.0)(0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS)8.00gNaCl、0.20gKCl、0.20gKH2PO4、1.15gNa2HP04*12H20，加蒸餾水至1000mL，用lmol/L的NaOH調(diào)PH為8.0)。溶解，離心收集上清液，獲得大豆球蛋白粗提液。1.4.加入固體(NH4)2S04，使(NH4)2S04飽和度達(dá)51。/。，4"C靜置過(guò)夜后，15,000rpm/min4。C離心30min收集沉淀，沉淀溶解于pH7.6的磷酸鹽緩沖液。加入固體(NH4)2S04，使(NH4)2S04飽和度達(dá)90。/。，4。C靜置過(guò)夜后，以15,000rpm/min(4°C)離心30min，沉淀溶于pH7.6的磷酸鹽緩沖液中。1.5.瓊脂糖凝膠Sepharose6B經(jīng)真空脫氣后裝柱(100cmx2.6cm)，充分平衡后上樣進(jìn)行凝膠過(guò)濾，用pH7.6的磷酸鹽緩沖液洗脫，核酸蛋白檢測(cè)儀280nm檢測(cè)，分別收集洗脫液組分。將收集到的含有蛋白的洗脫液再經(jīng)過(guò)DEAE-52層析柱(30cmx3.3cm)，收集蛋白洗脫液。將洗脫液于4'C對(duì)蒸餾水透析除鹽，冷凍干燥。1.6.蛋白純度鑒定和分子量測(cè)定采用SDS-PAGE電泳方法進(jìn)行，添加SDS的分離凝膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。以低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行電泳，電泳條件為恒壓100V。電泳結(jié)束后用考馬斯亮蘭染色液染色6h以上，脫色觀察，結(jié)果如圖l所示。1.7.利用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白的濃度，測(cè)定步驟按操作說(shuō)明進(jìn)行。2、雜交瘤細(xì)胞系的建立2丄動(dòng)物免疫將適量純化的大豆球蛋白溶液加入0.5mL生理鹽水中，配成5mg/mL濃度，加入等體積的完全弗氏佐劑(購(gòu)自Sigma，目錄號(hào)F5506-10)后制成免疫原乳化劑，免疫6周齡雌性Balb/c小鼠。4周后行第二次免疫，再兩周后行第三次免疫，均使用加入等體積的不完全弗氏佐劑(購(gòu)自Sigma，目錄號(hào)F5881-10)后制成免疫原乳化劑。在第三次免疫后第10天用間接ELISA法測(cè)定小鼠血清中大豆球蛋白抗體效價(jià)，效價(jià)高者進(jìn)行下一步細(xì)胞融合。2.2.細(xì)胞融合無(wú)菌取材經(jīng)過(guò)步驟2.1.免疫的Balb/c小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸浮液。分別吸取含lX108個(gè)脾細(xì)胞和2x1(^個(gè)骨髓瘤細(xì)胞sp2/0的懸浮液，移至50mL離心管中。加不完全培養(yǎng)液，使細(xì)胞液總體積為30mL。充分混勻后，于1000xg離心7min，棄上清液。輕彈管底，松散沉淀細(xì)胞。將離心管底部浸入37。C溫水中，均勻轉(zhuǎn)動(dòng)，將1mL50%PEG溶液沿離心管壁加樣轉(zhuǎn)動(dòng)的離心管，加樣時(shí)間60秒左右。立即將細(xì)胞懸浮液全部吸入吸管，靜置30秒后，再將其吹入離心管內(nèi)。在5min內(nèi)加入25mL不完全培養(yǎng)液以稀釋PEG，使PEG失去促融作用。于800xg離心7min，棄上清液。加入10mLHAT培養(yǎng)液，懸浮并混勻沉淀細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮液加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔0.1mL。然后將培養(yǎng)板置于37'C和5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將融合后的細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)液中，置于37"C和5%<:02的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每2-3天更換培養(yǎng)液一次。在融合后7天內(nèi)用HAT培養(yǎng)液；第7-14天改用HT培養(yǎng)液；第14天以后則用普通的完全培養(yǎng)液。2.3.間接免疫酶聯(lián)吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞融合后第7天，每次換液收集雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，然后采用間接ELISA方法對(duì)每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔的培養(yǎng)液進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選。具體操作如下(1)包被用包被緩沖液((0.85mol/L、pH9.6的碳酸緩沖液)準(zhǔn)確稱(chēng)取1.59gNa2C03和2.93gNaHC03，將其混溶于1000mL蒸餾水中)將純化大豆球蛋白溶液稀釋至最佳工作濃度(2.5|ig/mL)，每孔加樣100)LiL，置濕盒于37"C溫育1小時(shí)。(2)封閉棄去酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體。每個(gè)孔加入封閉液(用包被緩沖液配制，加入1%明膠)150pL，置濕盒中37i:溫育1小時(shí)后，用洗滌緩沖液(含0.05%Tween-20的0.01mol/LPBS(pH7.4);0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)的配方為8.00gNaCl，0.20gKCl，0.20gKH2PO4，1.15gNa2HP04*12H20;加蒸餾水至1000mL)洗滌3次，每次90s(簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同)，然后拍干。(3)加待測(cè)樣品用抗體稀釋液(含0.01。/。Tween-20、0.1%明膠的0.01mol/LPBS(pH7.4))將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液以適當(dāng)起始濃度倍比稀釋后加入酶標(biāo)板，每個(gè)孔100^L,每個(gè)濃度梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。37'C溫育lh后，洗滌，拍干。(4)加酶標(biāo)二抗(抗抗體)用抗體稀釋液將酶標(biāo)二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀釋到工作濃度(1:5000)，加入酶標(biāo)板，每個(gè)孔100pL，置于37'C溫育lh后，洗滌，拍干。(5)加底物溶液向各酶標(biāo)孔加新鮮配制的OPD底物使用液(OPD底物使用液將40mgOPD溶于100mL底物緩沖液，再加30pL30%H202。底物緩沖液((pH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液)將25.7mL的0.2mol/L磷酸氫二鈉(28.4g/L)和24.3mL的0.1mol/L檸檬酸(19.2g/L)溶于50mL蒸餾水)100|iL，37。C溫育15-30min。(6)終止反應(yīng)每個(gè)孔加終止緩沖液((2mol/LH2S04):將21.7mL濃硫酸(98%)溶于156.6mL蒸餾水中)50mL，終止底物顯色反應(yīng)。(7)判定結(jié)果用酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)下測(cè)定各個(gè)孔內(nèi)溶液的吸光值(OD492)，若待測(cè)孔00492大于或等于陰性對(duì)照孔的2.1倍，即認(rèn)為是陽(yáng)性值，從而得出可能的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞克隆。2.4.陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的單克隆化采用有限稀釋法對(duì)篩選的陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行克隆，具體步驟如下于克隆前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞(Balb/c小鼠的腹腔單核巨噬細(xì)胞)。將待克隆的雜交瘤細(xì)胞用加樣器反復(fù)吹打均勻后，轉(zhuǎn)至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，對(duì)細(xì)胞懸浮液做適當(dāng)稀釋。取250個(gè)活細(xì)胞懸浮于4.6mL(終體積)培養(yǎng)液中(此時(shí)平均每0.1mL溶液中含5個(gè)細(xì)胞)，接種96孔培養(yǎng)板，每個(gè)孔0.1mL，共36個(gè)孔。將4mL培養(yǎng)液加入到余下的l.OmL細(xì)胞溶液中(此時(shí)平均每0.1mL溶液中含1個(gè)細(xì)胞)，將此細(xì)胞液接種至其次的36孔，每個(gè)孔O.lmL。向剩余的1.4mL細(xì)胞懸浮液中補(bǔ)加培養(yǎng)液1.4mL(此時(shí)平均每0.1mL溶液中含0.5個(gè)細(xì)胞)?；靹蚝螅瑢⑵浣臃N于剩余的24孔，每個(gè)孔0.1mL。將培養(yǎng)板置于37'C和5n/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。適時(shí)進(jìn)行換液和檢測(cè)。有多孔陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)盡可能取單克隆孔進(jìn)行再次克隆，直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)液均為陽(yáng)性。最后獲得穩(wěn)定分泌抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2，該細(xì)胞株已于2008年12月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路)，保藏登記號(hào)為CGMCCNo.2791。3、體外培養(yǎng)法制備單抗將己經(jīng)建立的抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基添加20。/。的胎牛血清，置于37°(3和5%(:02孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞濃度大于10S/ml時(shí)停止換液，持續(xù)孵育至細(xì)胞全部死亡。收集培養(yǎng)上清液，1500-2000xg，離心10分鐘，上清液含有高水平的單克隆抗體，-20°C保存?zhèn)溆谩?、體內(nèi)誘生腹水法制備單抗抗體的大量制備采用體內(nèi)誘生法。將液體石蠟(0.5mL/只)注入健康的Balb/c雌性小鼠腹腔內(nèi)，1-2周后備用。將擴(kuò)大培養(yǎng)的抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791吹落，于1000xg離心5min后收集細(xì)胞，棄上清。用不完全培養(yǎng)液將細(xì)胞懸浮，混勻，將細(xì)胞濃度調(diào)整至10S個(gè)/mL。向已進(jìn)行石蠟處理的小鼠腹腔內(nèi)注射lmL/只的上述雜交瘤細(xì)胞。7-9天后收集腹水，于3000xg離心10min，棄脂肪層和細(xì)胞層，收集中間澄清層，置于-7(TC凍存。5、單抗的純化5丄預(yù)處理(二氧化硅吸附法)取步驟3獲得的上清液或步驟4獲得的小鼠腹水，用等體積的巴比妥緩沖液稀釋。加二氧化硅粉末，室溫下不時(shí)搖動(dòng)30min。于2000xg離心20min，即得澄清的液體。5.2.辛酸-硫酸銨沉淀法純化IgG向一份經(jīng)過(guò)步驟5丄預(yù)處理過(guò)的液體中加入2倍體積的0.06mol/L乙酸緩沖液(pH5.0)。用0.1mol/LHCl調(diào)pH值至4.8。于室溫下攪拌，并在30min內(nèi)逐滴加入辛酸(每lmL稀釋前的經(jīng)過(guò)步驟5丄預(yù)處理過(guò)的液體加33pL辛酸)。在4°C靜置2h后，于15000xg離心30min。棄沉淀，上清液經(jīng)砂芯漏斗過(guò)濾。向溶液中加入經(jīng)過(guò)步驟1預(yù)處理過(guò)的液體的1/10體積的0.1mol/LPBS，用1mol/LNaOH調(diào)pH值至7.4。置于4i:冰浴中，在30min內(nèi)加入0.277g/mL的(NH4)2S04，使其飽和度達(dá)45%。靜置lh以上后，于10000Xg離心30min。棄上清，將沉淀溶于PBS(含137mmol/LNaCl、2.6腿ol/LKC1和0.2mmol/LEDTA，pH7.4)中。在4"C于PBS中透析過(guò)夜。于10000xg離心30min后，除去不溶性沉渣，澄清液即為初級(jí)純的抗體。5.3.親和層析純化IgG抗體的進(jìn)一步純化采用HiTrapProteinGHP親和層析柱進(jìn)行。具體操作如下用10倍柱體積(約10mL)的結(jié)合緩沖液(20mmol/L磷酸鹽，pH7.0)平衡層析柱。用直徑為0.45pm的過(guò)濾器過(guò)濾樣品除去不溶物，然后與結(jié)合緩沖液按l:l(V/V)混合。再用注射器進(jìn)樣，隨后以10倍柱體積(約10mL)結(jié)合緩沖液清洗，以除去未結(jié)合雜蛋白。最后用2-5倍柱體積的洗脫緩沖液(0.1mol/L甘氨酸-鹽酸，pH2.7)洗脫樣品。收集洗脫液(收集試管事先加有l(wèi)mol/LpH9.0的Tris-HCl中和液，其用量為100pL/mL收集液)。于5mmol/LPBS中充分透析，然后濃縮備用。6、單抗的特性鑒定6.1.抗體的類(lèi)型及亞型取抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791培養(yǎng)液，于2000xg離心8min，以去除細(xì)胞及其碎片。用免疫純單抗分型試劑盒I(ImmunoPureMonoclonalAntibodyIsotypingKitI)測(cè)定抗體的類(lèi)型、亞型和輕鏈的亞型。根據(jù)分型試劑盒分析，抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791產(chǎn)生的單抗屬于含A輕鏈的IgG2。6.2.抗體的含量收集抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791的培養(yǎng)液，然后采用夾心ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中的抗體濃度，以純化兔抗鼠IgG包被酶標(biāo)板，洗滌后加入適宜濃度的兔抗鼠IgG-HRP識(shí)別抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體。以小鼠IgG的不同濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的OD492值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)檢測(cè)各株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液的OD492值，計(jì)算出抗體的準(zhǔn)確濃度。6.3.抗體的效價(jià)用步驟1的大豆球蛋白(50.(Hig/mL)包被酶標(biāo)板。將純化的單抗(單抗的起始濃度為1.0mg/mL)進(jìn)行倍比稀釋后，用間接ELISA方法測(cè)定抗體的效價(jià)，以未進(jìn)行融合的SP2/0細(xì)胞的培養(yǎng)上清液為陰性對(duì)照。圖2是抗體的效價(jià)曲線圖，與OD柳值為l.O相對(duì)應(yīng)的抗體效價(jià)為2.7x1(^(圖中每一個(gè)點(diǎn)代表在ELISA分析中8個(gè)重復(fù)測(cè)定的平均值)。6.4.單抗穩(wěn)定性的檢測(cè)復(fù)蘇雜交瘤細(xì)胞，收集不同傳代次數(shù)的細(xì)胞上清，并用間接ELISA方法檢測(cè)其效價(jià)。結(jié)果表明抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791不同代次能夠穩(wěn)定產(chǎn)生單克隆抗體(以實(shí)施例1，步驟6.3所述的方法進(jìn)行檢測(cè)，該細(xì)胞株第1代至第8代的抗體效價(jià)均高于lx104)。6.5.抗體親和力的測(cè)定(非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA)抗體的親和常數(shù)采用非競(jìng)爭(zhēng)性ELISA法，操作程序除了加入系列稀釋的已知濃度的抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791培養(yǎng)液外，其他同步驟2.3。以待測(cè)樣品的不同濃度為橫坐標(biāo)，以其相應(yīng)的OD492值為縱坐標(biāo)，繪制三條測(cè)定曲線。以各曲線上部趨于平坦的OD492值為100%，計(jì)算00492值為50%時(shí)抗體的濃度[Ab]t，這樣每份待測(cè)樣品可得[Ab]t、[Ab]'t、[Ab]"t三個(gè)值，然后根據(jù)徐志凱(徐志凱主編，1991，實(shí)用單克隆抗體技術(shù)。西安陜西科學(xué)技術(shù)出版社。pp7-145)描述的方法計(jì)算，抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體的親和常數(shù)(《。)為3.3xl()8L/mo1。6.6.單抗的反應(yīng)特異性(1)抗體與類(lèi)似物交叉反應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA測(cè)定大豆球蛋白與其結(jié)構(gòu)或功能類(lèi)似物之間的交叉反應(yīng)。將抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體作適當(dāng)濃度稀釋后，以等體積分別與系列倍比稀釋的大豆球蛋白、P-伴聚球蛋白、胰蛋白酶抑制因子和凝集素混勻后，室溫反應(yīng)15min。然后加至已包被處理的酶標(biāo)板中。其余步驟同2.3.。其中，用于ELISA分析的包被抗原(大豆球蛋白)濃度為50.0|ig/mL，大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體濃度為50ng/mL。根據(jù)00492值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定IC5。(ng/mL)(ICso為抑制抗原抗體結(jié)合的50%時(shí)各競(jìng)爭(zhēng)物濃度，表l中每個(gè)iq。代表12個(gè)重復(fù)測(cè)定的平均值)。按照如下公式計(jì)算各類(lèi)似物的交叉反應(yīng)率(即大豆球蛋白的IC5()與各競(jìng)爭(zhēng)物IC5Q之比。交叉反應(yīng)率CR(。/。)=(大豆球蛋白的IC50)/(某競(jìng)爭(zhēng)物的ICso)xl00X。如表1所示。表l中第二列上一行的數(shù)值為ICso，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單位是ng/mL;下一行的數(shù)值是交叉反應(yīng)率，單位是％。表l.抗體與大豆球蛋白及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物或相關(guān)物質(zhì)的交叉反應(yīng)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2)用WesternBlot免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)單抗與大豆球蛋白結(jié)合反應(yīng)將大豆粗提蛋白和純化的大豆球蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，按常規(guī)方法在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉在4°C封閉過(guò)夜，加入抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體。室溫反應(yīng)lh，洗滌三次。隨后加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫反應(yīng)lh，洗滌三次。最后加入NBT/BCIP底物顯色。洗滌均用TBST，每次10min。結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體與大豆球蛋白具有較強(qiáng)的特異性反應(yīng)，條帶a:提取的大豆球蛋白粗樣品；條帶b:純化的大豆球蛋白樣品。ELISA和WesternBlot的結(jié)果都證明抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體能和大豆球蛋白發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合反應(yīng)，因此可以應(yīng)用于的免疫學(xué)檢測(cè)和蛋白定量，以及其他的相關(guān)應(yīng)用研究。實(shí)施例2:大豆球蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法以抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體對(duì)大豆球蛋白進(jìn)行檢測(cè)可以包括如下試劑1)抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體按實(shí)施例1步驟5進(jìn)行純化；2)抗大豆球蛋白的多克隆抗體。該多抗的制備、純化方法如下a.多抗的制備取實(shí)施例1制備的大豆球蛋白用生理鹽水配成5mg/mL，與等量弗氏佐劑混合，利用旋渦混合器使其乳化完全。選取健康雌性新西蘭大白兔，首次免疫為足內(nèi)側(cè)上皮，注射完全佐劑乳化抗原，選兩個(gè)位點(diǎn)，每點(diǎn)0.5mL;首免后14天加強(qiáng)免疫，背部隨機(jī)選取4點(diǎn)，消毒后皮下注射不完全佐劑乳化抗原，0.5mL/點(diǎn)；以后每隔10d加強(qiáng)免疫一次，連續(xù)三次加強(qiáng)免疫。最后一次加強(qiáng)免疫后10d，在耳上選擇清晰的靜脈血管，注射腎上腺素0.1mL/只，過(guò)0.5h后，再往靜脈直接注射提純的抗原。待效價(jià)達(dá)到要求后，對(duì)兔子進(jìn)行前腔靜脈采血，分離血清，-20°(3保存?zhèn)溆谩.多抗的純化同實(shí)施例1的步驟5。3)羊抗鼠IgG/HRP酶標(biāo)二抗；4)大豆球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(可按照實(shí)施例l步驟l的方法進(jìn)行制備純化)；5)包被緩沖液(組成同實(shí)施例1步驟2.3.(1));6)1%牛血清白蛋白封閉液(組成同實(shí)施例1步驟2.3.(2));7)洗滌緩沖液(組成同實(shí)施例1步驟2.3.(2));8)OPD底物液(組成同實(shí)施例1步驟2.3.(5));9)終止液(組成同實(shí)施例1步驟2.3.(6))。所建立的大豆球蛋白雙抗夾心ELISA定量檢測(cè)法的實(shí)驗(yàn)過(guò)程包括以抗大豆球蛋白的多克隆抗體包被ELISA酶標(biāo)板，順序加入待檢樣品、抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體、羊抗鼠IgG/HRP酶標(biāo)二抗、OPD底物液、終止液，然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)各個(gè)孔內(nèi)溶液的吸光值(OD492)?？梢砸源蠖骨虻鞍诪闃?biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋加樣，根據(jù)吸光值讀數(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品孔吸光值比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出精確大豆球蛋白含量。具體的方法及操作如下(1)大豆樣品的處理如果待檢測(cè)的樣品為大豆或者顆粒飼料，需預(yù)先按照如下方法制備大豆脫皮后磨漿，過(guò)濾后乙醚萃取脫脂，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘留乙醚，制得脫脂樣品，再溶于0.03mol/LTris墨HCl(含0.01mol/L的(5-巰基乙醇，pH8.0)中。如果待檢測(cè)的樣品為粉狀豆粕或者飼料，可直接將待測(cè)大豆樣品溶于0.03mol/LTris-HCl(含0.01mol/L的(3-巰基乙醇，pH8.0)中，并磁力攪拌2h，使大豆蛋白以游離的形式釋放出來(lái)，以便于用免疫學(xué)方法定量檢測(cè)其中大豆球蛋白的實(shí)際(2)包被多抗純化后的抗大豆球蛋白的多克隆抗體用0.05mol/LNaHCO3pH9.6配成2ug/ml，包被于96孔酶標(biāo)板中，4"C過(guò)夜(200wL/孔)包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗體。(3)封閉棄去酶標(biāo)板孔內(nèi)的液體。洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗體后，用1%牛血清白蛋白封閉液進(jìn)行封閉，每個(gè)孔加入封閉液150)LiL。置濕盒中于37匸溫育lh后，用洗滌緩沖液洗滌3次，每次90s(簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同)，然后拍干。(4)加待測(cè)樣品用包被緩沖液將大豆球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成O、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0(ig/mL八個(gè)工作濃度。按酶標(biāo)板縱順序?qū)⒚恳环N濃度的標(biāo)準(zhǔn)品加入到酶標(biāo)板孔中，然后加入每個(gè)待測(cè)樣品(每個(gè)樣品設(shè)10個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù))。每個(gè)孔100nL，每個(gè)濃度梯度或者樣品至少設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。置濕盒中于37'C烘箱孵育lh后，棄去孔內(nèi)的液體，洗滌，拍干。(5)加一抗(單抗)用抗體稀釋液將抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2CGMCCNo.2791所產(chǎn)生的單克隆抗體稀釋至最佳工作濃度(2.5|ig/mL)，用移液槍準(zhǔn)確移至酶標(biāo)板，每個(gè)孔100pL，置濕盒中于37'C溫育lh。棄去孔內(nèi)液體，洗滌，拍干。(6)加酶標(biāo)二抗用抗體稀釋液將酶標(biāo)二抗(羊抗鼠IgG/HRP)稀釋到工作濃度(1:5000)，加入酶標(biāo)板，每個(gè)孔100pL，置于37。C溫育lh后，棄去孔內(nèi)的液體，洗滌，拍干。(7)加底物溶液向各酶標(biāo)孔加新鮮配制OPD底物使用液100pL，37'C溫育15—30min。(8)終止反應(yīng)每個(gè)孔加終止液50pL，終止底物顯色反應(yīng)。(9)判定結(jié)果用酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)下測(cè)定孔內(nèi)溶液的吸光值(OD492)，以標(biāo)準(zhǔn)品不同稀釋度所對(duì)應(yīng)的吸光值(OD492)做圖，得出擬合曲線方程。然后把待測(cè)樣品孔的吸光值(OD492)帶入方程，可準(zhǔn)確得出大豆球蛋白的濃度。經(jīng)檢測(cè)，本研究開(kāi)發(fā)出的大豆球蛋白的雙抗夾心ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)范圍為0.02昭/ml10iig/ml;靈敏度為0.01^ig/ml;變異系數(shù)為板內(nèi)變異系數(shù)為1.8%，板間變異系數(shù)為3.3%，批內(nèi)變異系數(shù)為4.0%，批間變異系數(shù)為7.2%;樣品不同梯度的線性評(píng)估為R2《972。權(quán)利要求1、大豆球蛋白的單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCCNo.2791的抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2所產(chǎn)生。2、保藏號(hào)為CGMCCNo.2791的抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2。3、含有權(quán)利要求1所述的大豆球蛋白的單克隆抗體的試劑盒。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒為酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。5、將權(quán)利要求1所述的大豆球蛋白的單克隆抗體和固相載體相偶聯(lián)得到的免疫親和吸附劑。6、以權(quán)利要求5所述的免疫親和吸附劑為填料的免疫親和色譜柱。7、含有權(quán)利要求5所述的免疫親和吸附劑或權(quán)利要求6所述的免疫親和色譜柱的試劑盒。8、權(quán)利要求1所述的大豆球蛋白的單克隆抗體或權(quán)利要求3或4的試劑盒在如下1)或2)的應(yīng)用1)在檢測(cè)大豆球蛋白中的應(yīng)用；2)在分離純化大豆球蛋白中的應(yīng)用。9、權(quán)利要求5所述的免疫親和吸附劑、權(quán)利要求6所述的免疫親和色譜柱或權(quán)利要求7所述的試劑盒在分離純化大豆球蛋白中的應(yīng)用。10、大豆球蛋白的拮抗劑，它的活性成分是權(quán)利要求l所述的大豆球蛋白的單克隆抗體。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種大豆球蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的大豆球蛋白的單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCCNo.2791的抗大豆球蛋白單克隆抗體細(xì)胞株4B2產(chǎn)生。用本發(fā)明的大豆球蛋白單克隆抗體檢測(cè)大豆球蛋白，克服了傳統(tǒng)的SDS-PAGE、多抗血清間接性ELISA檢測(cè)方法存在的不同實(shí)驗(yàn)室之間不能參比、靈敏度和準(zhǔn)確性低、需要重復(fù)免疫制備多抗血清的缺點(diǎn)，其檢測(cè)準(zhǔn)確性接近反相高效液相法(RP-HPLC)，而且成本很低，可滿(mǎn)足飼料行業(yè)、食品行業(yè)相關(guān)企業(yè)單位高通量快速檢測(cè)大豆、豆粕、豆制品中大豆球蛋白含量的需要，在大豆制品抗原物質(zhì)定量檢測(cè)和致過(guò)敏性的評(píng)估中具有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C07K16/16GK101445558SQ20081024100公開(kāi)日2009年6月3日申請(qǐng)日期2008年12月24日優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日發(fā)明者于貴平,尹靖東,李德發(fā),王軍軍,王鳳來(lái),賀平麗,曦馬申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)