一種病毒中和抗體定量檢測試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種病毒中和抗體定量檢測試劑盒及其在發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒中和抗體檢測中的應(yīng)用。通過原核表達發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒NP蛋白，制備針對NP蛋白的鼠源單抗或多抗。通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測NP蛋白來測定確定病毒的組織細胞半數(shù)感染量(TCID50)。將待檢標本與等量病毒液混合接種細胞。用NP蛋白的單抗或多抗為1抗，通過雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測標本中和抗體效價。本發(fā)明可應(yīng)用在發(fā)熱伴血小板減少綜合征疫苗的臨床免疫效果評價、人群或動物群發(fā)熱伴血小板減少綜合征血清流行病學(xué)研究，以及人工制備發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒中和抗體的體外效價測定和評估等方面。本發(fā)明提供的方法具有敏感、快速、特異和通量高等特點。
【專利說明】一種病毒中和抗體定量檢測試劑盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種病毒中和抗體定量檢測試劑盒及其在發(fā) 熱伴血小板減少綜合癥病毒中和抗體定量檢測中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)熱伴血小板減少綜合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome， SFTS)是我國近年來新發(fā)現(xiàn)的由布尼亞病毒引起的一種出血性疾病，病原稱之為SFTS病 毒。本病主要分布山區(qū)和丘陵地帶的農(nóng)村，呈散發(fā)，人群普遍易感。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，體溫 多在38°C以上，伴乏力、惡心、嘔吐等，部分病例有頭痛、肌肉酸痛、腹瀉等。絕大部分患者預(yù) 后良好，但部分病例病情危重，出現(xiàn)意識障礙、皮膚瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、 呼吸衰竭、彌漫性血管內(nèi)凝血等多臟器功能衰竭死亡，重癥死亡率高達15-30%。目前在我 國的河南、湖北、山東、安徽、遼寧、江蘇、浙江等地都發(fā)現(xiàn)了 SFTS病例。近期在日本、韓國和 美國都發(fā)現(xiàn)了由SFTS相關(guān)病毒引起的病例，表明病毒的分布范圍較廣，已成為威脅人類健 康和公共衛(wèi)生的重要新發(fā)傳染病。。此外，在該病毒能夠感染豬、羊、牛、犬、禽等動物，對動 物健康也有潛在的威脅。
[0003] 病毒的特異性中和抗體水平能夠反應(yīng)個體或群體的抗病毒狀態(tài)，同時也常用來評 價疫苗的臨床免疫效果，因此檢測中和抗體具有重要的臨床和流行病學(xué)意義。目前檢測 SFTS病毒中和抗體方法主要是通過觀察細胞病變或免疫熒光法來進行，耗時、費力、敏感性 差，而且不能同時檢測大量標本。此外，SFTS病毒感染細胞（如Vero)后細胞病變不明顯， 更增加了檢測中和抗體的難度。NP蛋白較為保守，在病毒粒子中含量豐富。運用酶聯(lián)免疫 吸附法，通過雙抗體法檢測病毒NP蛋白，在此基礎(chǔ)上可以建立一種快速、敏感、可實現(xiàn)大量 自動檢測的SFTS病毒中和抗體檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明需要解決的問題是提供一種病毒中和抗體定量檢測試劑盒及其在發(fā)熱伴 血小板減少綜合癥病毒中和抗體定量檢測中的應(yīng)用。檢測的標本包括人和動物血清、人工 制備的單抗或多抗或其它基因工程抗體。
[0005] 本發(fā)明提供的定量檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒中和抗體的試劑盒由96孔 細胞板、Vero細胞、100TCID50病毒液、NP蛋白單抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 Ig，底物 四甲基聯(lián)苯胺（TMB)顯色劑組成。
[0006] 本發(fā)明所述發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒中和抗體的定量檢測試劑盒的制備原 理：
[0007] (1)原核表達發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒NP蛋白，免疫小鼠制備針對NP蛋白的 單抗或多抗；
[0008] (2)采用組織細胞半數(shù)感染量（TCID50)測定病毒的滴度，通過酶聯(lián)免疫吸附法檢 測NP蛋白來確定細胞感染狀況；
[0009] (3)將待檢血清倍比稀釋，與等量的100TCID50病毒混合，接種細胞，在37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)20?24h ;
[0010] ⑷用NP蛋白的單抗或多抗為1抗，通過雙抗體酶聯(lián)免疫吸附法檢測標本中和抗 體效價。
[0011] 上述過程所用的細胞包括Vero、BHK-21、C6/36、DH82細胞。其使用方法為：
[0012] (1)抗體-病毒混合物和Vero細胞共培養(yǎng)：將系列倍比稀釋的待檢抗體和 100TCID50/50 μ L的稀釋病毒液混合，放入37°C培養(yǎng)箱作用lh，每孔加100 μ 11. 5x104細胞 /孔的細胞，細胞培養(yǎng)板在37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)20?24h ;
[0013] (2)固定：用PBS液洗細胞2次，每孔加入80%的冰丙酮100 μ 1，室溫固定細胞 lOmin ；
[0014] (3)酶標儀檢測：每孔加入稀釋后的NP蛋白的單抗（抗體1) 1000 μ 1，室溫作用 lh，用250 μ 1/次PBS+0. 05% TWEEN-20洗滌液洗洗板4次，每孔加入100 μ 1稀釋后的HRP 標記的羊抗鼠 IgG(抗體2)，室溫作用lh，用250μ 1 PBS+0.05% TWEEN-20洗滌液洗滌板6 次，每孔加入ΤΜΒ底物100 μ 1，室溫放lOmin顯色，CC對照孔尚未變色時，每孔加入1Μ硫酸 100 μ 1終止反應(yīng)，用450納米酶標儀讀出每孔0D值；
[0015] (4)結(jié)果判讀：結(jié)果判定采用公式：X = (VC平均0D值一CC平均0D值）/2，Χ表示 50%的Vero細胞感染時的0D值，每孔0D值低于X值時，判定為中和抗體檢測陽性，中和抗 體陽性的血清最高稀釋度即為血清的中和抗體效價。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0017] (1).本發(fā)明根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附法原理，通過酶標記的雙抗體檢測NP蛋白來指示 病毒的感染情況，極大的提供了特異性和敏感性。
[0018] (2).本發(fā)明提供的方法，不僅可以檢測人和動物血清中和抗體，也能檢測人工方 法中和抗體，能夠?qū)χ泻涂贵w進行定性和定量檢測。
[0019] (3).本發(fā)明提供的方法大大縮短了中和抗體檢測時間，一般可在30小時內(nèi)完成 實驗。
[0020] (4).本發(fā)明提供的中和抗體檢測試劑盒，能夠高通量對標本進行檢測。快速、敏 感、特異可實現(xiàn)大量自動檢測SFTS病毒中和抗體。
[0021] (5)本發(fā)明可應(yīng)用在發(fā)熱伴血小板減少綜合征疫苗的臨床免疫效果評價、人群或 動物群發(fā)熱伴血小板減少綜合征血清流行病學(xué)研究，以及人工制備發(fā)熱伴血小板減少綜合 征病毒中和抗體的體外效價測定和評估等方面。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒中和抗體檢測96孔細胞培養(yǎng)板布置。

【具體實施方式】
[0023] 通過下面給出的具體實施例可以進一步了解本發(fā)明。但它們不是對本發(fā)明的限 定。
[0024] 實施例1 :NP蛋白單抗和多抗的制備
[0025] 通過RT-PCR法擴增SFTS病毒NP基因，閱讀框插入表達質(zhì)粒pQE30 (Qiagen， Germany)的多克隆位點內(nèi)，得到NP基因原核表達質(zhì)粒pQE30-SFTS-NP，轉(zhuǎn)化E. Coli M15菌 株（Qiagen，Germany),誘導(dǎo)表達6His-NP重組蛋白。NP重組蛋白純化定量后，按常規(guī)方法 免疫BALB/c小鼠，制備抗SFTS病毒NP蛋白的單抗和多抗。
[0026] 實施例2 病毒滴度測定
[0027] 采用組織細胞半數(shù)感染量（TCID50)測定法。將_70°C凍存的病毒液100倍稀釋。 取1 :100倍稀釋的病毒液，在96孔細胞培養(yǎng)板上進行l(wèi)/21og稀釋，S卩KT2、KT 2_5、10 一3、 1〇一3 5......1〇 ―7。每孔含1〇〇 μ 1病毒液，每個稀釋度做4孔重復(fù)。
[0028] 取對數(shù)生長期的細胞，用LEDTA-胰酶消化，用細胞培養(yǎng)液分散細胞，加病毒稀釋 液至10mL，用細胞計數(shù)板對細胞計數(shù)，將細胞稀釋成1. 5 X 105細胞/mL備用。已稀釋好病 毒的微量細胞培養(yǎng)板中，加100 μ 1細胞（1. 5xl04細胞/孔）。細胞培養(yǎng)板最好一列做正常 細胞（CC)對照。在37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)20?24h。
[0029] 用PBS液（PH7. 2)的洗細胞2次，每孔加入80%的冰丙酮100 μ 1，室溫固定細胞 lOmin。棄去固定液，讓微量培養(yǎng)板室溫干燥。⑴去除丙酮，用PBS洗滌微量培養(yǎng)板3次。 每孔加入稀釋后的抗SFTS病毒NP蛋白的單抗或多抗（抗體1) 1000 μ 1，室溫作用lh。用 250 μ 1/次洗滌液洗（PBS+0. 05% TWEEN-20)洗板4次。每孔加入100 μ 1稀釋后的辣根過 氧化物酶HRP標記的羊抗鼠 IgG (抗體2)，室溫作用lh。用250 μ 1洗滌液洗滌板6次。每 孔加入四甲基聯(lián)苯胺底物（TMB Substrate kit, Thermo Scientific公司）100 μ 1。室溫放 lOmin左右顯色，CC對照孔尚未變色時，每孔加入1Μ硫酸100 μ 1終止反應(yīng)。用酶標儀（450 納米）讀出每孔0D值。計算CC對照孔的平均0D值，接種不同稀釋度病毒的孔平均0D值 是CC對照孔平均0D值2倍以上，則判斷為病毒生長陽性。
[0030] 根據(jù)Reed和Muench方法計算病毒的TCID50/100ml。
[0031] 實施例3 :中和抗體檢測
[0032] 在96孔細胞培養(yǎng)板上進行血清中和抗體效價檢測。在96孔細胞板的每孔中加入 50 μ 1 MEM細胞培養(yǎng)液（不含牛血清）。第一排中前11孔（A1?All)在加入40 μ 1病毒稀 釋液，使之成為90 μ 1/每孔，加入10 μ 1待檢血清于第一排Α1?All，系列倍比稀釋（Α? H)為 1 :10、1 :20、1 :40· · · 1 :1280。稀釋病毒至 100TCID5(l/50mL。除 CC 孔（E12、F12、G12、 H12)外，每孔加入50μ 1病毒工作液?？譇12、B12、C12和D12作為病毒接種對照（VC)孔。 CC孔加入50μ 1MEM細胞培養(yǎng)液（不含牛血清）。另外，選擇1列孔作病毒工作液滴度核實， 每孔加入200TCID50/100mL，作系列倍比稀釋，使之成為100TCID50, 50, 25,12,6,…· · 0· 7, 然后每孔加入50 μ 1 MEM細胞培養(yǎng)液使體積成為100 μ 1/孔?；靹虿《疽谎寤旌衔铮?37°C培養(yǎng)箱作用lh。每孔加100μ1細胞（1.5χ104細胞/孔）。細胞培養(yǎng)板孔E12、F12、 G12和H12做正常細胞（CC)對照。在37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)20?24h。
[0033] 棄去微量培養(yǎng)板中的細胞液。用250 μ L PBS液（PH7. 2)的洗細胞2次，每孔加入 80%的冰丙酮100μ1，室溫固定細胞lOmin。棄去固定液，讓微量培養(yǎng)板室溫干燥。（1)去 除丙酮，用PBS洗滌微量培養(yǎng)板3次。每孔加入稀釋后的抗SFTS病毒NP蛋白的單抗或多 抗（抗體1) 1000 μ 1，室溫作用lh。用250 μ 1/次洗滌液洗（PBS+0. 05% TWEEN-20)洗板4 次。每孔加入100 μ 1稀釋后的HRP標記的羊抗鼠 IgG(抗體2)，室溫作用lh。用250 μ 1 洗滌液洗滌板6次。每孔加入TMB底物100 μ 1。室溫放lOmin左右顯色，CC對照孔尚未變 色時，每孔加入1M硫酸100 μ 1終止反應(yīng)。用酶標儀（450納米）讀出每孔0D值。
[0034] 結(jié)果判定采用公式：X = (VC平均0D值一CC平均0D值）/2。X表示50%的Vero 細胞感染時的0D值。每孔0D值低于X值時，判定為中和抗體檢測陽性，中和抗體陽性的血 清最高稀釋度即為血清的中和抗體效價。
[0035] 實施例4 :檢測試劑盒的制備
[0036] 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附原理，制備一種發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒中和抗體定量檢 測試劑盒，試劑盒的組成部分為96孔細胞板、Vero細胞、100TCID50病毒液、NP蛋白單抗、 辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 Ig，底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB)顯色劑等。具體檢測步驟：
[0037] 抗體-病毒混合物和Vero細胞共培養(yǎng)
[0038] 按照圖1所示布置檢測抗體和相關(guān)對照。在96孔細胞板將待檢抗體系列倍比稀 釋為 1 :10、1 :20、1 :40· · · 1 :1280。稀釋病毒至 100TCID5(l/50mL。除 CC 孔（E12、F12、G12、 H12)外，每孔加入50μ 1病毒工作液?？譇12、B12、C12和D12作為病毒接種對照（VC)孔， 孔E12、F12、G12和H12做正常細胞（CC)對照。CC孔加入50μ 1MEM細胞培養(yǎng)液（不含牛 血清）。混勻病毒一血清混合物，放37°C培養(yǎng)箱作用lh。每孔加100 μ 1細胞（1. 5x104細 胞/孔）。細胞培養(yǎng)板在37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)20?24h。
[0039] (2)固定
[0040] 用250 μ L PBS液（PH7. 2)的洗細胞2次，每孔加入80%的冰丙酮100 μ 1，室溫固 定細胞l〇min。
[0041] (3)酶標儀檢測
[0042] 去除丙酮，用PBS洗滌微量培養(yǎng)板3次。每孔加入稀釋后的NP蛋白的單抗（抗 體1) 1000 μ 1，室溫作用lh。用250 μ 1/次洗滌液洗（PBS+0. 05% TWEEN-20)洗板4次。每 孔加入100 μ 1稀釋后的HRP標記的羊抗鼠 IgG(抗體2)，室溫作用lh。用250 μ 1洗滌液 洗滌板6次。每孔加入ΤΜΒ底物100 μ 1。室溫放10min左右顯色，CC對照孔尚未變色時， 每孔加入1M硫酸100 μ 1終止反應(yīng)。用酶標儀（450納米）讀出每孔0D值。
[0043] (4)結(jié)果判讀
[0044] 結(jié)果判定采用公式3=以(：平均00值一0：平均00值）/2。父表示50%的￥61'〇 細胞感染時的0D值。每孔0D值低于X值時，判定為中和抗體檢測陽性，中和抗體陽性的血 清最高稀釋度即為血清的中和抗體效價。
【權(quán)利要求】
1. 一種病毒中和抗體的定量檢測試劑盒，其特征是由96孔細胞板、Vero細胞、 100TCID50病毒液、NP蛋白單抗、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 Ig，底物四甲基聯(lián)苯胺TMB 顯色劑組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種病毒中和抗體的定量檢測試劑盒的使用方法，其特征是由 以下步驟構(gòu)成： (1)抗體-病毒混合物和Vero細胞共培養(yǎng)：將系列倍比稀釋的待檢抗體和 100TCID50/50 μ L的稀釋病毒液混合，放入37°C培養(yǎng)箱作用lh，每孔加100 μ 11. 5x104細胞 /孔的細胞，細胞培養(yǎng)板在37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)20?24h ; ⑵固定：用PBS液洗細胞2次，每孔加入80%的冰丙酮100 μ 1，室溫固定細胞lOmin ; (3) 酶標儀檢測：每孔加入稀釋后的NP蛋白的單抗1000 μ 1，室溫作用lh，用250 μ 1/ 次PBS+0. 05% TWEEN-20洗滌液洗洗板4次，每孔加入100 μ 1稀釋后的HRP標記的羊抗鼠 IgG，室溫作用lh，用250 μ 1 PBS+0. 05 % TWEEN-20洗滌液洗滌板6次，每孔加入ΤΜΒ底物 100 μ 1，室溫放lOmin顯色，CC對照孔尚未變色時，每孔加入1Μ硫酸100 μ 1終止反應(yīng)，用 450納米酶標儀讀出每孔0D值； (4) 結(jié)果判讀：結(jié)果判定采用公式：X= (VC平均0D值一CC平均0D值）/2，Χ表示50% 的Vero細胞感染時的0D值，每孔0D值低于X值時，判定為中和抗體檢測陽性，中和抗體陽 性的血清最高稀釋度即為血清的中和抗體效價。
3. 權(quán)利要求1所述一種病毒中和抗體的定量檢測試劑盒在發(fā)熱伴血小板減少綜合征 病毒早期感染檢測中的應(yīng)用。
4. 權(quán)利要求1所述一種病毒中和抗體的定量檢測試劑盒在發(fā)熱伴血小板減少綜合征 疫苗的臨床免疫效果評價或人群或動物群發(fā)熱伴血小板減少綜合征血清流行病學(xué)研究中 的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/569GK104062443SQ201410335006
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】祁賢, 湯奮揚, 焦永軍, 鮑倡俊, 崔侖標, 李志鋒, 周明浩 申請人:江蘇省疾病預(yù)防控制中心