專利名稱：重組腸道病毒71型中和抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一具有生物活性，特別是用于針對腸道病毒所造成的疾病的一系列抗體。本發(fā)明也涉及抗病毒治療方法，特別涉及重組抗人類EV71病毒單克隆抗體。本發(fā)明同時還涉及將該抗體用于診斷EV71感染的應用。
背景技術：
手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)通常是一輕微的疾病，且僅發(fā)生于嬰兒與幼童身上。感染腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)是造成手足口病的第二大病因(CDC報告，1998年8月7日；CDC報告，1998年8月11日)。感染EV71常常并發(fā)嚴重的神經(jīng)炎癥，包括病毒性腦(脊)膜炎(viral(aseptic)meningitis)，腦炎(encephalitis)，以及類似小兒麻痹的癱瘓。
EV71首次在1969年被分離與描述(Schmidt et al.，1974，J.Infect.Dis.129304)。關于EV71流行的報告從1998年開始出現(xiàn)，主要是發(fā)生于東南亞地區(qū)(Lam，1998，Emerg.Infect.Dis.4145；WHO報告，1998年6月；WHO報告，1998年7月)。世界衛(wèi)生組織曾發(fā)布香港、馬來西亞和臺灣是流行區(qū)域。最嚴重的流行爆發(fā)發(fā)生于臺灣1998年4月到7月，造成了約320例嚴重并發(fā)癥，并有73人死亡(Wu et al.，1999，Emerg.Infect.Dis，5458；Wang et al.，1999，Clin.Infect.Dis.1184；Komatsu et al.，1999，Pediatr.Neurol.2017)。
從EV71感染到出現(xiàn)癥狀約為3至6天。第一個常見的癥狀為發(fā)燒。在發(fā)燒出現(xiàn)后的一到兩天，病人口中常出現(xiàn)瘡(sores)并常轉(zhuǎn)變成潰瘍。皮膚紅疹出現(xiàn)于第1到2天，通常是在手掌或腳底出現(xiàn)。大部分病人會在1到2周內(nèi)恢復(WHO報告，1998年6月；CDC報告，1998年8月7日)。有些病例，主要是小于3歲的兒童，會出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥。他們出現(xiàn)短期(2-4天)的發(fā)燒病(febrile illness)，之后突然惡化，并在第12到24小時內(nèi)死亡(CDC報告，1998年8月7日)。目前還不清楚為何某些受感染的兒童能恢復，而其它的卻在感染后快速地產(chǎn)生并發(fā)癥。
有報告指出猴子可在被EV71感染后14到20天內(nèi)產(chǎn)生IgM抗體(Hashinmoto和Hagiwara，1982，Neuropathol.Appl.Neurobiol.8149；Hashinmoto和Hagiwara，1983，Acta.Neuropathol 60266)。報告指出病童的快速死亡，通常發(fā)生在第七天，是由于他們無法及時產(chǎn)生足夠的中和抗體。目前尚無有效的試劑或治療方法可治療EV71感染。目前已有的手足口病治療大多僅針對癥狀，包括減輕發(fā)燒、頭痛和不適(malaise)。掌控并發(fā)癥是目前臨床治療EV71感染最重要的著眼方向(CDC報告，1998年8月11日)。因此，一個能有效抑制病毒增生并清除病毒顆粒的治療方法是有高度商業(yè)價值的。
利用雜交瘤制備單克隆抗體的技術于1975年首次出現(xiàn)(Cottona和Milstein，1973，Nature 24442；Kohler和Milstein，1975，Nature256495)。在過去的兩個世紀，已產(chǎn)生了數(shù)種應用于臨床的單克隆抗體。這些單克隆抗體能辨認特定疾病的重要分子或致病原，并能產(chǎn)生免疫反應來消滅它們。到2001年為止，已有11個老鼠的基因改造單克隆抗體在市場上銷售(Glennie和Johnson，2000，Immunol.Today21403Ezzell，2001，Sci.Am.28534)。
EV71是一正單鏈RNA病毒。病毒的RNA被包裹在4個結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)上病毒蛋白1(viral protein 1，VP1)，VP2，VP3與VP4，都是由同一裸前體蛋白(naked precursor protein)經(jīng)翻譯后(post-translation)剪接而成。在這些病毒蛋白之中，VP1被認為是負責病毒與靶細胞結(jié)合的蛋白質(zhì)(Graham et al.，1989，J.Gen.Virol.70625)，因此它具有中和病毒主要的抗原決定簇(Pfaff et al.，1988，J.Virol.622033；Rueckert，1990，Virology/Lippin-cott-Raven，p.507)。許多以不同的病毒株進行的免疫學研究，分別指出數(shù)種單克隆抗體的主要表位應該在VP1上(Philip et al.，1986，J.Gen.Virol.671283；Tapani et al.，1993，J.Clin.Microbiol.311083；Timo et al.，1998，J.Gene.Virol.781)。
多個研究發(fā)現(xiàn)引發(fā)保護性的免疫反應需要EV71的一部分，并據(jù)此設計了寡肽(US 4,694,071，US 4,751,083，US 4,875,643)。懷孕的ICR鼠用VP1蛋白或EV71的DNA進行免疫，也發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)會產(chǎn)生足以保護新生鼠不受EV71感染的中和抗體(Wu，C.N.et al.，2002，Vaccine 20895)。
雖然EV71是一基因上變異度大，且演化迅速的病毒，但研究者發(fā)現(xiàn)從6個以上的國家所分離出的VP1的三種基因型，包括野生型病毒株BrCr-CA-70，其彼此之間至少有94％的同一性(Brown et al.，2000，J.Viol.7412003)。在EV71在臺灣的流行期間，研究者取得并分離了許多病理樣本，發(fā)現(xiàn)這些在臺灣不同區(qū)域獲得的VP1蛋白具有幾乎相同的序列。將GenBank中VP1的氨基酸序列互相比對，亦發(fā)現(xiàn)不同的分離株序列有高度的相似性(＞96％)，且在同一基因型中有高于98.9％的相同序列(Wang et al.，2002，J.Clin.Microbiol.4010；Shih et al.，2000，Virus Res.68127)。這些資料顯示VP1是一非常保守的區(qū)域，并且在被感染的個體中并未發(fā)生顯著突變。因此VP1是EV71有潛力的中和決定簇與合適的靶抗原。
在過去15年中，制備抗體的技術因抗體工程和轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展而快速進步。新一代的抗體一完全人類單克隆抗體(fully humanmonoclonal antibodies)在臨床上應用。表達人類單克隆抗體最常見的方式是將人類單鏈VH-VL文庫(單鏈Fv文庫，單鏈scFv文庫)在噬菌體表面表達，用轉(zhuǎn)基因鼠制備抗體，采集人類重鏈的基因并用人類癌癥細胞制備成雜交瘤生產(chǎn)抗體(Soderlind et al.，1993，Biotechnol.11503；Vaughan et al.，1998，Nat.Biotechnol.16535；Karpas et al.，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 981799)。實驗數(shù)據(jù)顯示這類單克隆抗體在人類疾病中引發(fā)較低的免疫原性，具有較長的半衰期以及較強的免疫反應。
最近有研究者在酵母菌中建立了一個高速制備/篩選人類抗體的系統(tǒng)(US 6406863)。相對于噬菌體表達系統(tǒng)，用酵母菌制備的抗體在表達之后可自然折疊，功能上應與人類抗體更相近。除此之外，在酵母菌中利用酵母雙雜合系統(tǒng)可以輕易的篩選抗體-抗原的關連，因此相對于傳統(tǒng)方式可省下許多時間與金錢。因此，酵母雙雜合系統(tǒng)提供了一個有效且經(jīng)濟的方式來篩選人類抗體。
酵母菌抗體庫的另一個好處是在酵母菌內(nèi)發(fā)生的同源重組。VH與VL序列的重組更增加了scFv文庫可能的復雜度，并可在成熟之后提高篩選后的scFv的結(jié)合親和力。

發(fā)明內(nèi)容
抗體本發(fā)明提供了一種抗腸道病毒EV71型的VP1特異性抗體。
在此“抗體”包括完整抗體(即包含兩個重鏈與兩個輕鏈的抗體)，或具有能結(jié)合抗原的部分抗體片段，例如Fab，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)v或單鏈Fv(scFv)片段。本發(fā)明優(yōu)選的實施例為scFv抗體。scFv由抗體的輕鏈可變區(qū)域(VL)與重鏈可變區(qū)域(VH)以一可彎曲的接頭(linker)組合而成。scFv因此可以連接抗原并可在細菌中快速產(chǎn)生。
本發(fā)明提供了一種抗腸道病毒EV71型的抗體，其包含如SEQ IDNO.14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的氨基酸序列或其活性同系物(active homologues)。本發(fā)明的抗體優(yōu)選其氨基酸序列為SEQ ID NO.26，該序列可進一步用來設計具有相似特異性的抗體。在本發(fā)明的具體實施例中的抗體是人類單克隆抗體。在更優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的抗體為一單鏈Fv抗體(single chainFv，scFv)。
另外，本發(fā)明的抗體包含一雙特異性抗體(bispecific antibody)，其包含兩個可變區(qū)域，至少其中之一是本發(fā)明的抗體的可變區(qū)域。優(yōu)選這兩個可變區(qū)域都是本發(fā)明的抗體的可變區(qū)域。
本發(fā)明的抗體可連接到一抗病毒藥物上或是可檢測的標記上。這使得抗體可以將該藥物或是可檢測的標記置于靶病毒上，并造成對靶病毒的破壞/消滅。因此，本發(fā)明的抗體可用于治療或手術，用作對人類或動物的治療或手術(例如放射免疫導向手術，radioimmunoguided surgery)所需的抗體；或是用于對人類或動物進行診斷。本發(fā)明特別適用于針對腸道病毒(如EV71型)感染的手術或治療，或是針對腸道病毒感染的診斷。
連接于抗體的抗病毒藥物可以是任何能破壞或消滅與抗體相接的病毒，或與抗體相接的內(nèi)含有病毒的細胞。例如，抗病毒藥物可以是有毒制劑例如化療制劑，放射性制劑或是放射性同位素，也可以是酶、前體藥物或細胞因子。
適合的化療藥物已在文獻中有詳細記載，包括蒽環(huán)類(如道諾霉素或阿霉素)，氨甲蝶呤，春地辛(vindesine)，新制癌菌素，順鉑，苯丁酸氮芥，阿糖胞苷，5-氟尿苷，苯丙氨酸氮芥，篦麻毒蛋白與卡奇霉素(calicheamicin)。
可用于抗病毒制劑的合適的放射性同位素已在文獻中已有詳細記載。
連接于抗體的抗病毒藥物也可以是能啟動前體藥物的酶，這樣可以在被感染區(qū)域?qū)⑶绑w藥物啟動至活化狀態(tài)，這又被稱為“抗體導向酶-前體藥物療法”(antibody-directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)。在臨床應用上，對病人施用抗體-酶接頭，使其能集中在被感染區(qū)域并治療感染部分。再對病人施用前體藥物，使得前體藥物在酶的催化下，能在被感染區(qū)域轉(zhuǎn)化成有毒殺性的藥物。
與抗體接連的可檢測標記，可以是能成像的藥物或是短半衰期的放射性同位素，例如111In，125I或99mTc。
本發(fā)明的抗體與可檢測的標記連接，除可用于診斷外，也可用于放射免疫導向手術(radioimmunoguided surgery，RIGS)。放射免疫導向手術包括對病人施用一被標記的抗體，之后以手術方式去除被抗體標記的組織。因此，被標記的抗體能使手術醫(yī)師有效地針對被感染的組織。
本發(fā)明的抗體，其中可檢測的標記可用于檢測或定量腸道病毒，檢測方法包括(a)將樣本與抗體接觸，(b)檢測或定量標記的抗體，其中腸道病毒可為完整的病毒顆?；蚴荲P1亞單位。本發(fā)明包括體外定量VP1，例如，抗體可以用于酶聯(lián)免疫測定法(enzyme-linkedimmunoassay，ELISA)，蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)或是在組織樣本中原位(in situ)檢測腸道病毒的感染。因此，本發(fā)明包含將本發(fā)明的抗體用于在樣本中定量VP1的方法，這個方法包括(a)將樣本與被標記的本發(fā)明的抗體接觸，和(b)檢測或定量任何與VP1結(jié)合的抗體。
應用本發(fā)明的標記抗體，采用ELISA定量樣本中VP1的方法包括(a)將一未標記的本發(fā)明的抗體固定在一固定支持物上；(b)將樣本加入，使得樣本中的腸道病毒能被攫??；(c)依照發(fā)明加入標記好的本發(fā)明的抗體；和(d)檢測或定量任何結(jié)合到VP1上的標記抗體。
本發(fā)明的抗體也可用于組織的原位測定或EV71的定量，例如用于免疫螢光或免疫電子顯微鏡。要進行原位測定或定量，可先將組織從病人身上移出，并讓一被標記的抗體能結(jié)合至樣本中的VP1。通過這樣的方法，不但可以知道是否有EV71的存在，也可標定其空間分布。
本發(fā)明的抗體也可用于純化VP1。一般傳統(tǒng)的純化抗原的方法包括免疫沉淀與免疫親和柱技術。在免疫親和柱技術中，一般先將本發(fā)明中的抗體與柱中惰性(inert)的基質(zhì)連接，再將含有靶VP1的樣本通入柱，因此VP1會被留在柱中。研究者再用化學或生物方法析出VP1。在以上測定、量化和純化方法中，含有VP1的樣本可能是組織樣本或是取自病人的細胞抽提物。樣本也可能是用DNA重組技術制備的，例如提取物或是表達VP1的宿主細胞。
用于體外的標記抗體，其標記可以是放射性同位素(例如32p或35S)，生物素(可用與過氧化物酶綴合的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白測定)，地高辛，堿性磷酸酶或是螢光標記(例如熒光素或羅丹明)。
本發(fā)明所包含的抗體的氨基酸序列是由包含SEQ ID NO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13所示的多核苷酸所編碼的。
本發(fā)明還提供了一種獲得本發(fā)明抗體的方法，包括(a)從酵母抗體文庫中選擇含有該抗體的酵母細胞，(b)將宿主細胞在能表達該抗體的條件下培養(yǎng)，和(c)從培養(yǎng)液中收集選擇的抗體。在本發(fā)明的方法中，酵母表達文庫是由以下步驟制備的(a)從外周血液細胞用RT-PCR準備VH與VL的DNA區(qū)段，(b)將VH與VL的編碼區(qū)段用接頭(linker)連接起來，和(c)用含有連接好的VH與VL的載體轉(zhuǎn)化酵母菌。酵母表達文庫中，載體是用來復制和表達可用于制備上述抗體的脫氧核糖核酸(DNA)。此載體是選自于質(zhì)粒、病毒或噬菌體載體，除具有復制起點外，其中啟動子可能與上述DNA功能性地連接在一起?！肮δ苄缘剡B接”是意指啟動子與編碼抗體的序列的關系足以使編碼序列的表達受啟動子的控制。載體也可以包含啟動子的調(diào)節(jié)基因。載體可能包括一個或多個標記基因，例如使用細菌載體時用的抗氨芐青霉素基因，或是使用哺乳動物細胞載體時用的抗新霉素基因。此載體可用于體外，例如利用DNA產(chǎn)生相對應的RNA，也可用于轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染宿主細胞。
本發(fā)明另提供了一種制備本發(fā)明的抗體的方法，該方法包括(a)在能表達該抗體的條件下培養(yǎng)宿主細胞，和(b)從培養(yǎng)物中收集抗體，其中宿主細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染從而可以表達本發(fā)明的抗體。宿主細胞一般選擇與載體相容的，因此可以是細菌、酵母菌、昆蟲或哺乳動物細胞，在優(yōu)選實施例中該宿主細胞為酵母菌。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含連接于抗病毒藥物或可檢測的標記上的本發(fā)明的抗體，以及藥學上適用的載體或溶劑。在臨床上，抗體將以非口服方式施用，例如以靜脈注射或是腹膜注射方式施用，因此該藥物組合物一般是適用于以非口服方式施用的。這樣的組合物可以很容易地包含抗體，并以等張的鹽水或碳酸氫鹽為溶劑。抗體的最終用量仍須由醫(yī)師決定，并應該考慮各種因素，例如治療方式、診斷結(jié)果、病人體重、狀況、年齡等。合適的抗體用量已記載在相關文獻中。一個合適的人類用量可能介于0.01至100mg，優(yōu)選0.1至10mg。本發(fā)明的抗體可用于已知的類似的腸道病毒。


圖1用高速酵母雙雜合系統(tǒng)篩選抗體的示意圖。EV71vp1EV71的衣殼蛋白(capsid protein)VP1。scFv抗體的單鏈Fv區(qū)域。DNA-BDDNA結(jié)合區(qū)域。AD轉(zhuǎn)錄-啟動區(qū)域。GAL1UASGAL1的上游啟動子。(A)DNA-BD/EV71vp1蛋白與GAL1 UAS結(jié)合，但在缺少AD的情況下無法啟動轉(zhuǎn)錄。(B)AD/scFv抗體庫蛋白無法落在UAS，因此無法啟動轉(zhuǎn)錄。(C)EV71的VP1如能與受檢scFv抗體庫的抗體相互作用，則AD/scFv會被帶近UAS，并恢復GAL1的功能，導致報道基因的表達。
圖2測量EV71VP1陽性克隆的抗原關連特異性(antigen-association specificity)。上G338、G235和G234的親本克隆；中G333、G2334和G335的親本克?。幌翯621、G622、G623、G624和G625的親本克隆。
圖3純化有潛力的scFv。箭頭標示純化的scFv。
圖4用Ni親和純化的EV71 VP1蛋白的SDS-PAGE圖示。箭頭標示析出的EV71 VP1-His6。
圖5用ELISA檢驗scFvs的結(jié)合特異性。
圖6用BIAcore 2000親和力檢驗測量scFv與重組VP1的結(jié)合。
圖7scFv的中和反應。(A)選擇抗EV71-B型的scFv克隆。(B)選擇抗EV71-C型的scFv克隆。
圖8用空斑數(shù)降低測定法(plaque reduction assay)檢驗scFv對(A)EV71-B和(B)EV71-C的抗體中和反應。
圖9建構(gòu)完整的G625抗體重組桿狀病毒。(A)G625重鏈構(gòu)建pCEF/DB625-huCg1，(B)G625輕鏈構(gòu)建pCEF/DB625-huCk，和(C)桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pAcDB3-G625Cg1Ck。
圖10用空斑數(shù)降低測定法測量完整的G625抗體重組桿狀病毒的中和反應。(A)G625抗EV71-B，和(B)G625抗EV71-C。
以下實施例是用于說明本發(fā)明，并不以任何形式對本發(fā)明的范圍進行限制。
具體實施例方式實施例1構(gòu)建scFv文庫，VP1融合蛋白。用酵母雙雜合系統(tǒng)篩選可能的抗體人類抗體VH與VL的DNA片段是從外周血液細胞取得。收集的血液細胞以數(shù)組寡核苷酸引物用RT-PCR擴增人類VH與VL的cDNA片段(Orlandi et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863833)。這些引物的設計是參考不同Ig基因家族的共有序列(引物序列請參見US6406863)。這些擴增的片段再與間隔/接頭序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4相連形成單鏈抗體(single-chain antibodies，scFv)。這些單鏈抗體的基因片段可插入載體成為單鏈抗體文庫，并可進一步轉(zhuǎn)化入酵母菌細胞。
為了高速篩選抗體，研究者將準備好的scFv文庫作為酵母雙雜合系統(tǒng)中的檢驗蛋白(US 6406863)。每一個檢驗蛋白都是一個scFv蛋白與活性結(jié)構(gòu)域(active domain，AD)的融合蛋白。酵母菌細胞則被修飾為能表達一重組蛋白，其包含一轉(zhuǎn)錄活化子(transcriptionactivator)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domain，BD)與靶抗原，EV71的VP1(序列37)。且酵母菌被改造為能表達一報導基因，其表達受一特定的DNA結(jié)合區(qū)域調(diào)控。當scFv與靶抗原相連時，AD就會被帶近BD，造成與BD結(jié)合的DNA結(jié)合區(qū)域下游的報道基因(LacZ/HIS3)的轉(zhuǎn)錄活化(圖1)。陽性克隆可用組氨酸缺乏的培養(yǎng)基篩選，而表達程度可以ONPG(對硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷)試驗測量。
為制備靶抗原的基因片段，發(fā)明人首先將EV71-B(TW/1743)與EV71-C(TW/2086)分別從病人組織中分離出來，并在Vero與RD細胞中繁殖。擴增之后，將病毒顆粒以蔗糖梯度離心(sucrosegradient centrifugation)的方式純化。蔗糖梯度離心的流程可參考Abraham和Colonno，1984，J.Virol.57340；Smyth et al.，1993，J.Mol.Biol.230667。病毒RNA是用RNA純化試劑盒，遵照制造商的操作流程進行(Qiagen Co.，USA)。
發(fā)明人將從兩種基因型取得的VP1基因片段用RT-PCR擴增，并克隆至轉(zhuǎn)錄活化子的BD的下游。病毒RNA則從被neu感染的細胞用一商業(yè)性試劑盒純化(QIAamp viral RNA mini kit，Qiagen Inc.，SantaClara，CA)。第一條cDNA鏈是用反轉(zhuǎn)錄酶(Promega，USA)與和VP1的病毒基因3’端互補的引物(序列38TCCTCCTGCGAAGCTGCTGACT)生成(Wu et al.，2002，Vaccine20895)。發(fā)明人再用Pfu DNA聚合酶與一對引物(Envp1FCACTCTTCCA TGGATATCCTACAGACAGGCA，Envp 1RTCCTCTTCTAAGGAGAGTG GTRATTGCTGTGCGAC)，PCR擴增35次整個VP1蛋白的雙鏈基因(94℃×1min，55℃×1min與72℃×2min)。
Envp1F與Envp1R是根據(jù)VP1基因已知的N端與C端序列設計的。發(fā)明人再將擴增后的VP1DNA用EcoR I切割后導入pcDNA3載體中(Invirtogen，USA)。發(fā)明人將構(gòu)建好的scFv表達載體與EV71表達載體分別導入不同的單倍體(haploid)酵母菌細胞(US 6406863)。經(jīng)兩個單倍體酵母菌細胞交配后，將scFv表達載體導入酵母菌中。研究者將兩種單倍體酵母菌細胞(如α與a型酵母菌)，分別攜有scFv表達載體與VP1表達載體，交配后成為攜有兩種表達載體的二倍體酵母菌細胞。如圖1所示，原本含有靶抗原表達載體的單倍體酵母菌細胞，在特定DNA結(jié)合位置的下游也有報道基因。因此兩個單倍體酵母細胞交配之后，如果可能的scFv抗體能結(jié)合到靶VP1上，AD就會被帶近BD，造成報道基因轉(zhuǎn)錄的活化。發(fā)明人根據(jù)對報道基因的表達程度與其它可選擇的標記的觀察，可以篩選出能有效與抗原VP1結(jié)合的scFv抗體，再克隆該選定的scFv抗體。然后分離并定性含有這些有潛力的scFv抗體的質(zhì)粒。
發(fā)明人總共選擇了10個親本的(parental)克隆(序列14-23)。利用誘變PCR(mutagenic PCR)，發(fā)明人可將這些克隆的親和力再次提高，并另外選擇了13個成熟的克隆(DNA序列1-13，蛋白質(zhì)序列24-36)。其中發(fā)明人利用酵母雙雜合系統(tǒng)，比較了6個對照組(controlbaits)，和部分抗體與EV71 VP1陽性克隆的抗原結(jié)合特異性；分別以pGBK，laminC，IL-8，EGFR，p53，與TNF作為對照組，與啟動區(qū)段(AD)形成重組蛋白，利用酵母雙雜合系統(tǒng)檢測與EV71 VP1是否會產(chǎn)生結(jié)合，在培養(yǎng)基上觀察是否可形成菌落(圖2)，結(jié)果顯示，6個對照組都無法形成菌落，僅有篩選出來的scFv克隆產(chǎn)生菌落，這證明抗體與EV71 VP1的抗原結(jié)合特異性。
實施例2純化候選scFv為了在酵母雙雜合系統(tǒng)確認所選擇的scFv克隆的抗原特異性，將選定的scFv克隆的DNA片段導入E.coli的表達載體pET27b+中(Novagen Co.，Germany)，和BL21(pLys)型E.coli中。經(jīng)過1mMIPTG在37℃的誘導表達4h后，將經(jīng)過6組氨酸標記與HSV標記的scFv蛋白在內(nèi)含體(inclusion body)中表達與沉淀。再將內(nèi)含體溶于6M胍-HCl緩沖液(5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)并在4℃下?lián)u動過夜。離心(16000xg，20min)后，收集上清液并用0.45μm濾紙過濾，并通過2ml的Ni-NTA親和柱。以10ml洗滌緩沖液I(6M胍-HCl緩沖液，5mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)與洗滌緩沖液II(6M胍-HCl緩沖液，20mM咪唑，0.5M NaCl，20mMTris-HCl)清洗柱。最后，用析出緩沖液(6M胍-HCl緩沖液，50mM咪唑，0.5M NaCl，20mM Tris-HCl)析出scFv(圖3)。將純化出的scFv蛋白與復性緩沖液(renaturing buffer)透析2天來恢復蛋白質(zhì)折疊，復性緩沖液包含0.5M L-精氨酸(100mM Tris，pH8.0，1mM EDTA，1mM DTT，20％甘油，0.5％肌氨酰，0.5M L-精氨酸)(Lin et al.，2001，Anal.Biochem.29444)。
實施例3純化VP1為了了解scFv的活性，發(fā)明人將在酵母菌表達載體中的VP1基因區(qū)段導入載體pETblue2 vector中(Novagen Co.，Germany)成為重組的VP1蛋白，并以(His)6標記修飾其C端。表達、純化與重新折疊VP1蛋白的流程與scFv類似(圖4)。
實施例4用ELISA檢驗scFv的結(jié)合特異性(binding specificity)發(fā)明人用ELISA檢驗選定的克隆對重組VP1的結(jié)合特異性(圖5)。將純化的VP1在500ng/孔，0.1M NaCO3，pH＝9.6的條件下包被在96孔培養(yǎng)板中，并在4℃下培養(yǎng)過夜。再將包被過的培養(yǎng)板以300μl/孔，5％脫脂奶于PBS中，在37℃下封閉1小時。將培養(yǎng)板用含有0.05％Tween-20的PBS 400μl/孔清洗5次。
純化的scFv抗體分別用含0.1％明膠的PBS稀釋至0.5μg/ml，1.0μg/ml，1.5μg/ml與2.0μg/ml，在每一包被后的培養(yǎng)板中以100μl/孔加入。在37℃培養(yǎng)2小時。將所有板真空抽吸，并用含有0.05％Tween-20的PBS以400μl/孔清洗5次。將二抗鼠抗HSV(mouseanti-HSV)以20ng/孔加入，在37℃下反應1小時。將所有板真空抽吸，并用含有0.05％Tween-20的400μl/孔PBS清洗5次。用與抗鼠IgG的抗體(1∶5000稀釋至1mg/ml，100μl/孔)綴合的辣根過氧化物酶檢測已附著的抗體，在37℃下作用1小時。將所有板真空抽吸，并用含有0.05％Tween-20的400μl/孔PBS清洗5次。最后將所有板用100μl/孔TMB染色，并以650nm為標準記錄450nm處的吸收值(圖5)。
用BIAcore2000(Pharmacia Co.，USA)測量抗體與重組VP1的結(jié)合親和力(圖6)。首先將選定的scFv蛋白200μM接上Ni-NTA小片(Pharmacia Co.，USA)。再將不同濃度的VP1蛋白(50nM到1000nM)通過小片，并以BIAcore程序計算結(jié)合相關圖。由此可以畫出不同濃度的VP1的結(jié)合與分離曲線圖，并可計算選定的scFv的親和力。
實施例5計算scFv的中和反應將純化的scFv蛋白與病毒粒共同培養(yǎng)以計算其中和力價(Baxt etal.，1984，J.Virol.51298；Wiley et al.，1990，Viral Immunol.3137)。首先在進行中和檢驗的前一天，將2×104個細胞/孔的人類橫紋肌肉瘤細胞(rhabdomyosarcoma，RD)植入96孔培養(yǎng)板中。隔天，用病毒m.o.i.(感染復數(shù))＝10-3兩倍稀釋scFv蛋白(2-1～2-10)，在37℃下培養(yǎng)1小時后，涂抹在含2％的牛胎兒血清的DMEM培養(yǎng)液中的單層RD細胞上，再培養(yǎng)3天。用10％福爾馬林固定培養(yǎng)細胞，并用1％結(jié)晶紫染色存活的細胞。
scFv的中和活性是用每孔在570nm的光學密度計算的。每個樣本都有三次重復。scFv的IC50為能夠阻止EV71 50％的感染性scFv濃度。發(fā)明人檢驗了其中兩個scFv克隆，scFv-G334與scFv-G336，并用一個無關的克隆scFv-G74作為對照組。根據(jù)實驗結(jié)果scFv-G334與scFv-G336對EV71的IC50分別為3μg/ml與5μg/ml(圖7)。
實施例6用空斑數(shù)降低測定法(plaque reduction assay)測定scFv的中和活性將EV71病毒顆粒(200個病毒顆粒)與稀釋后的scFv蛋白或是對照組PBS混合，在37℃下反應1小時，再加到6孔平皿內(nèi)的雙倍或三倍單層RD細胞1小時，進行病毒吸收。將未附著的病毒顆粒洗掉后，用含0.3％瓊脂糖的培養(yǎng)液收獲細胞，在37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)4天。將細胞固定后，以結(jié)晶紫染色以計算空斑數(shù)。
發(fā)明人檢測了8個scFv克隆，分別為scFv-G333～cFv-G336，scFv-G621～scFv-G625，對EV71-B(圖8A)與EV71-C(圖8B)的中和活性。每個待測抗體濃度為5μg/ml。實驗發(fā)現(xiàn)來源于scFv的抗體，相對于PBS對照組，可降低空斑數(shù)10％～50％。
實例7以桿狀病毒表達系統(tǒng)制造完全抗體為制造完整的抗體，發(fā)明人以IgG重鏈信號肽，scFv-G625重鏈可變區(qū)域(VH)與IgGγ1恒定區(qū)域(pCEF/DB625-huCg1，圖9A)組成IgG重鏈。另外以IgGκ輕鏈信號肽，scFv-G625輕鏈可變區(qū)域(VL)與IgGκ恒定區(qū)域(pCEF/DB625-huCk，圖9B)組成IgG輕鏈。發(fā)明人用PCR方法擴增G625重鏈，擴增過程為使用ThermalAceDNA聚合酶(Invitrogen，USA)與一對引物H625F(5’-TGC TCT AGAGCC ACC ATG AAG CAT CTG TGG TTC)與H625R(5’-TCA TCATTT ACC CGG AGA CAC)，進行30次循環(huán)(94℃×30sec，60℃×30sec與72℃×2min)。將擴增后的重鏈片段在Xba I與Stu I酶切位點克隆入桿狀病毒載體pAcDB3(Pharmigen，USA)，得到載體pAcDB3-G625Cr1(圖9C)。
發(fā)明人以PCR擴增G625輕鏈，流程為使用ThermalAce DNA聚合酶(Invitrogen，USA)與一對引物SmaLK(5’-TCC CCC GGG GCCACC ATG AGG GTC CCC GCT CAG)與L625R(5’-GGA AGA TCTTCA ACA CTC TCC CCT GTT)，進行30次循環(huán)(94℃×30sec，60℃×30sec與72℃×2min)。將擴增后的輕鏈片段在Xma I與Bgl II酶切割位點克隆入桿狀病毒載體pAcDB3-G625Cr1，得到載體pAcDB3-G625Cr1Ck(圖9)。
發(fā)明人根據(jù)BaculoGold表達系統(tǒng)(Pharmigen，USA)準備重組桿狀病毒。將Sf9細胞在無血清的培養(yǎng)液(Gibco)中懸浮培養(yǎng)，再以m.o.i.為10的重組桿狀病毒感染細胞。將病毒與細胞在27℃下培養(yǎng)72小時。
以1000xg離心10min以收獲細胞，用1xPBS洗滌細胞兩次，再將細胞用含有1mM PMSF和1％Tween-20的PBS在冰上溶解20min。將上清液經(jīng)離心20分鐘20000xg后收集，再以蛋白A親和柱純化。
首先將含有1ml蛋白A樹脂(HiTrapr ProteinA 1ml，Pharmacia，USA)柱用10ml的1xPBS平衡，再加入上清液，然后用10ml的0.1M甘油，pH4.5的溶液沖洗柱，并以pH3.0，0.1M甘氨酸析出蛋白質(zhì)。將析出的部分合并用透析緩沖液(10mM HEPES，150mM KCl，1mMEDTA，50％甘油，pH8.0)透析。
發(fā)明人用如上述的空斑數(shù)降低實驗檢驗完整的G625抗體的中和反應。首先讓稀釋的完整G625抗體(1，5與10μg/ml)、10μg/ml人類IgG(Sigma，USA)和透析緩沖液接受檢驗。實驗發(fā)現(xiàn)與對照組相比較，完整G625抗體(5μg/ml)能減少75％的EV71-B空斑數(shù)(圖10A)與50％的EV71-C空斑數(shù)(圖10B)。人類IgG與透析緩沖液所減少的空斑數(shù)則與只有病毒的對照組無顯著差異。該結(jié)果證實EV71對宿主細胞的感染與增殖可以被某些抗VP1的單克隆抗體所阻止。
序列表<110>財團法人生物技術開發(fā)中心<120>重組腸道病毒71型中和抗體及其用途<130>無<160>29<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>759<212>DNA<213>人工<220>
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20 25 30Trp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Gly Gln Asp Gly Ser Gln Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Cys65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Ala Leu Asp Asp Ser Ala Gly Trp Phe Glu Phe Asp Phe Trp100 105 110Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly115 120 125Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Phe130 135 140Thr Pro Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ala Pro Gly Arg Thr Val145 150 155 160Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp165 170 175Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ser Ala Pro Asn Val Leu Ile180 185 190Tyr Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly195 200 205Pro Lys Ser Gly Thr Pro Ala Ser Pro Ala Ile Thr Ala Phe Gln Ala210 215 220Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser225 230 235 240Gly Glu Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu245 250<210>27<211>297<212>PRT<213>Enterovirus 71 strain TW/1743/98<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(297)<223>enterovirus 71 strain TW/1743/98 VP1 subunit<400>27Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val1 5 10 15Ser Lys Ala Leu Thr Pro Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Pro Asp Thr20 25 30Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Lys Val Pro Ala Leu Gln35 40 45Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Ser Met Ile50 55 60Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu65 70 75 80Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro85 90 95Leu Lys Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp100 105 110Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr115 120 125Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly130 135 140Arg Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala145 150 155 160
Pro Lys Pro Asp Ser Arg Asp Ser Leu Ala Trp Pro Thr Ala Thr Asn165 170 175Pro Ser Val Phe Val Lys Ser Ser Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val180 185 190Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr195 200 205Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala210 215 220Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Ser225 230 235 240Ser Lys Ser Glu Tyr Ser Leu Val Ile Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys245 250 255His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu260 265 270Phe Lys Ser Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asp Ser Ile Lys Pro Thr Gly275 280 285Thr Ser Arg Thr Ala Ile Thr Thr Leu290 295<210>28<211>891<212>DNA<213>Enterovirus 71 strain TW/1743/98<220>
<221>CDS<222>(1)..(891)<223>enterovirus 71 strain TW/1743/98 capsid protein VP1<400>28gga gat agg gtg gca gat gtg att gag agt tct ata ggg gac agc gtg 48agc aga gcc ctc acc cga gct cta ccg gca cct acc ggc caa gac aca 96cag gta agc agc cat cga tta gat act ggt aaa gtt cca gca ctc caa 144gcc gct gaa att gga gca tca tca aat gct agt gat gag agt atg att 192gag aca cgg tgt gtt ctt aat tca cat agc aca gct gag acc act ctt 240gat agc ttc ttc agc aga gca gga tta gtt gga gag ata gac ctc cct 288ctt gaa ggc aca acc aac ccg aat ggg tac gca aac tgg gac ata gac 336ata aca ggt tac gcg caa atg cgt aga aag gtg gag ctg ttc acc tac 384atg cgt ttt gac gca gag ttc acc ttt gtt gca tgc acc cct acc ggg 432gaa gtt gtc ccg caa ttg ctc caa tat atg ttt gta cca ccc gga gcc 480ccc aag cca gac tcc aga gaa tct ctc gca tgg caa act gcc act aat 528ccc tcg gtt ttt gtg aag ctg tca gac ccc cca gca cag gtt tct gtt 576cca ttc atg tca cct gcg agc gcc tat caa tgg ttt tat gac ggg tat 624ccc aca ttc ggt gaa cac aaa cag gag aaa gac ctt gaa tac ggg gca 672tgc cca aac aac atg atg ggt acg ttc tca gtg cgg act gta ggc acc 720tcg aag tcc aag tac cca ttg gtg atc agg att tac atg agg atg aag 768cac gtc agg gcg tgg ata cct cgc cca atg cgt aac cag aac tat cta 816ttc aaa gcc aac cca aat tat gct ggt aat tct att aaa cca act ggt 864gcc agt cgc aca gca atc acc act ctc 891<210>29<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<221>primer<222>(1)..(22)<223>Primer for VP1 cDNA<400>29tcctcctgcg aagctgctga ct2權利要求
1.一種抗腸道病毒EV71型的抗體，其包含如SEQ ID NO.14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的氨基酸序列或其活性同系物。
2.如權利要求1所述的抗體，其氨基酸序列為SEQ ID NO.26。
3.如權利要求1所述的抗體，其氨基酸序列是由一包含SEQ IDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的多核苷酸所編碼的。
4.如權利要求1所述的抗體，該抗體是人類單克隆抗體。
5.如權利要求1所述的抗體，該抗體為一單鏈Fv抗體。
6.如權利要求1所述的抗體，其氨基酸序列可用于制造雙特異性抗體。
7.如權利要求6所述的抗體，其中的雙特異性抗體包含兩個可變區(qū)域且其中一個可變區(qū)域是權利要求1所述的氨基酸序列。
8.如權利要求1所述的抗體，其連接于一抗病毒藥物或是可檢測的標記上。
9.如權利要求8所述的抗體，其中抗病毒藥物或可檢測的標記選自由以下所組成的組化療制劑、放射性制劑、放射性同位素、酶、前體藥物或細胞因子。
10.如權利要求8所述的抗體，其可用于治療或手術。
11.如權利要求8所述的抗體，其中可檢測的標記可應用于檢測或定量腸道病毒。
12.如權利要求11所述的抗體，其中檢測或定量的樣本是在生物體外檢測。
13.一種獲得如權利要求5的抗體的方法，包括(a)酵母抗體文庫中篩選含有該抗體的酵母細胞；(b)將宿主細胞在能表達該抗體的條件下培養(yǎng)，以及(c)從培養(yǎng)液中收獲所篩選到的抗體。
14.如權利要求13所述的方法，其中酵母表達文庫是根據(jù)以下步驟制備的(a)周血液細胞用RT-PCR制備VH與VL的DNA區(qū)段，(b)VH與VL的編碼區(qū)用接頭連接起來，和(c)含有連接好的VH與VL的載體轉(zhuǎn)化酵母菌。
15.如權利要求14所述的方法，其中載體是用于復制和表達可產(chǎn)生權利要求1所述抗體的DNA。
16.如權利要求15所述的方法，其中載體選自質(zhì)粒、病毒或噬菌體載體。
17.一種制備如權利要求1的抗體的方法，該方法包括(a)表達抗體的條件下培養(yǎng)宿主細胞，(b)培養(yǎng)物中收獲抗體；其中宿主細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染從而可以表達如權利要求1所述的抗體。
18.如同權利要求17所所述的方法，其中宿主細胞是細菌、酵母菌、哺乳類或昆蟲細胞。
19.一種藥物組合物，其包含權利要求1的抗體及藥學上適用的載體或溶劑，其中的抗體連接到抗病毒藥物或可檢測的標記上。
20.如權利要求19所述的藥物組合物，其可用于治療腸道病毒71型感染。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗腸道病毒71型的抗體，其包含如SEQ ID NO14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26所示的氨基酸序列或其活性同系物。本發(fā)明還提供了一種獲得該抗體的方法，包括(a)從酵母抗體文庫中選擇表達上述抗體的酵母細胞，(b)在上述抗體被表達的條件下培養(yǎng)該酵母細胞，和(c)從培養(yǎng)物中收集上述抗體。本發(fā)明還提供了一種制備該抗體的方法，該方法包括(a)在該抗體被表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞，(b)從培養(yǎng)物中收集該抗體，其中宿主細胞經(jīng)過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染用以表達抗腸道病毒71型的抗體。
文檔編號A61P31/12GK1869069SQ20051007392
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月25日 優(yōu)先權日2005年5月25日
發(fā)明者張子文, 許晉銓, 羅麗華, 陳念宜, 林陽生 申請人:財團法人生物技術開發(fā)中心