專利名稱：一種畢赤酵母表達載體的構(gòu)建和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種便于實現(xiàn)蛋白質(zhì)天然N端表達的畢赤酵母表達載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用示范。
背景技術(shù)：
、
隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，目前外源蛋白已經(jīng)能夠成功的在大腸桿菌、昆蟲細(xì)胞甚至哺乳類細(xì)胞中進行表達，雖然這些表達系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛的研究和應(yīng)用，但依然存在著許多缺點和不足。與之相比，畢赤酵母生長周期較短，遺傳操作簡單，具備真核細(xì)胞蛋白合成通路，能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)進行真核修飾(蛋白質(zhì)加工、折疊、翻譯后修飾等)，同時，畢赤酵母能在簡單培養(yǎng)基上進行高密度生長，即使在大規(guī)模發(fā)酵中，其包含的重組元件能夠穩(wěn)定遺傳，并且表達后的蛋白質(zhì)易于純化，因此近年來畢赤酵母已成為外源蛋白表達的優(yōu)選系統(tǒng)之一。目前使用最廣泛的巴斯德畢赤酵母宿主細(xì)胞為Cregg 1985年建立的GS115菌株。畢赤酵母GS115具有組氨酸脫氫酶缺陷型基因his4，因而可接受含HIS4的載體而具有HIS+表型以篩選轉(zhuǎn)化子。目前適合畢赤酵母GSl 15表達的載體有多種，如pPIC9、pPIC3、pPIC9k、pA0815、pA0804、pPICz 和 pPICza 系列等。pPIC9K是一種分泌性畢赤酵母表達載體，包含5' AOXl啟動子片段、多克隆位點(MCS)、轉(zhuǎn)錄終止和polyA形成基因序列(TT)、篩選標(biāo)記(His4)、3' AOXl基因片段，作為一個能在大腸桿菌中繁殖擴增的穿梭質(zhì)粒，它還含有PBR322序列。該質(zhì)粒在多克隆位點的前面包含能夠起到分泌作用的信號肽序列。在這個分泌信號的引導(dǎo)下，外源蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中經(jīng)修飾和加工后能夠由胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至胞外，將成熟的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外。目前PPIC9K僅能夠使用SnaBUEcoR I,Avr II和Not I四種酶切位點，其中僅EcoR I和Not I較為常用，若使用SnaBl和Avr II則通常需要分布酶切。同時由于所要表達的目的基因堿基具有一定的隨機性，經(jīng)常會存在包括EcoR I.Avr II等在內(nèi)的酶切位點，因此限制了該載體的使用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多克隆位點處包含多個單酶切位點的PPIC9K表達載體，該載體能能夠適用于內(nèi)部含有EcoR I.Avr II等酶切位點基因的表達。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種畢赤酵母表達載體PPIC9K11，所述表達載體能夠適用于內(nèi)部含有EcoR I.Avr II等酶切位點基因的表達，其特征在于，所述表達載體多克隆位點處添加了 AflII、BSSHII、Spe I和Mlu I四個原pPIC9K載體沒有的單酶切位點，PPIC9K11多克隆位點結(jié)構(gòu)如圖I所示。本發(fā)明公開了 pPIC9KD的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟I)引物設(shè)計及多克隆位點擴增a.根據(jù)PPIC9K中多克隆位點處序列設(shè)計引物9Kadd(SEQ IDNO 1)5' -GCGGCCGCACGCGTGCGCGCCTTAAGACTAGTCCTAGGGAATTCTACGTAA-3'
以PPIC9K質(zhì)粒為模板，使用引物9Kadd和PPIC9K通用引物5’ -AOXC -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')進行PCR，擴增出片段9KADD并連至pUCm_T載體上，新載體命名為pUCm-T-9KADD。2)pPIC9KD質(zhì)粒的構(gòu)建對pPIC9K和pUCm-T-9KADD載體分別使用限制性酶切位點BamH I和Not I進行雙酶切，純化酶切后的片段并進行連接，經(jīng)測序后獲得PPIC9K11質(zhì)粒。本發(fā)明還公開了 pPIC9KD質(zhì)粒的使用方法。具體包括以下步驟I)引物設(shè)計及目的基因的擴增a.選擇目的基因內(nèi)部沒有的酶切位點并以此設(shè)計上下游引物，根據(jù)限制性內(nèi)切酶緩沖液(以TAKARA公司為例)的不同可選擇的酶切位點組合有EcoR I和Not I以及EcoR
I、Afl II、BssHII、Spe I、Mlu I五種酶中任意兩種的組合,其他包括Avr II和Not I、AflII和Not I等在內(nèi)的組合則需要對載體進行分布酶切。b.使用設(shè)計好的引物以目的基因或包含目的基因的載體為模板進行PCR，回收目的條帶并與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序。2)載體與目的基因的酶切、連接及轉(zhuǎn)化a.選擇與引物對應(yīng)的酶對pPIC9KD質(zhì)粒及包含目的基因的T載體進行雙酶切。b.分別回收目的基因及酶切的pPIC9KD質(zhì)粒片段，并使用T4DNA連接酶進行連接。c.對包含目的基因的pPIC9KD進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子；按照手冊上的標(biāo)準(zhǔn)流程進行誘導(dǎo)表達獲得目的蛋白。


圖I :質(zhì)粒pPIC9KD的多克隆位點示意圖
具體實施例方式本發(fā)明中所涉及的生物材料均為已公開或商品化的材料，具體可通過以下方式獲得載體PPIC9K :購于 Novagen 公司；載體pUCm-T :購自上海生工生物工程公司；以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實施例僅用于詳細(xì)說明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例I質(zhì)粒pPIC9KD的構(gòu)建I)引物設(shè)計及多克隆位點擴增a.根據(jù)PPIC9K中多克隆位點處序列設(shè)計引物9Kadd:5' -GCGGCCGCACGCGTGCGCGCCTTAAGACTAGTCCTAGGGAATTCTACGTAA-3'以pPIC9K質(zhì)粒為模板，使用弓I物9Kadd和pPIC9K通用引物5 ’ -AOX (5' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3')進行 PCR，其反應(yīng)條件為94°C 5min ；2 個循環(huán)，94°C 30s, 45°C 30s,72 °C 70s ；28 個循環(huán)，94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 70s ；72°C IOmin ;10°C 保存，擴增出片段9KADD使用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與pUCm-T連接(pUCm-T_9KADD)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。
2)pPIC9KD質(zhì)粒的構(gòu)建對pPIC9K和pUCm-T_9KADD載體分別使用限制性酶切位點BamH I和Not I進行雙酶切，，酶切時間為4h，割膠回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下連接過夜(> 12h)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。實施例2甘露聚糖酶表達質(zhì)粒的構(gòu)建及異源表達I)合成引物 Man5A-F 5 ' -GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3 '、Man5A_R :5 '-ACGCGTTTA (A/G) GC (A/G) CTA (C/T) CAATAGCAG-3'，下劃線所示分別為 EcoR I 和 Mlu I 酶切位點。以載體pUCm-T-Man5A質(zhì)粒為模板，PCR獲得甘露聚糖酶基因Man5A (94°C 3min ；30個循環(huán)，94°C 30s，56°C 30s，72°C Imin ;72。。IOmin ;4°C 99min)，將PCR產(chǎn)物用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶并與PUCm-T連接(pUCm-T-Man5A)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)酶切鑒定正確后送上海生工測序。
2)將測序正確的pUCm-T_Man5A與pPIC9KD質(zhì)粒均用EcoR I和Mlu I進行雙酶切，回收的酶切產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接，得到重組質(zhì)粒pPIC9KD-Man5A，并對重組表達質(zhì)粒進行序列測定。3)用Sal I對pPIC9KD_Man5A進行線性化,按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)化、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子GS115/Man5A。該工程菌用2. 0%甲醇誘導(dǎo)96h，DNS法測得發(fā)酵液中重組甘露聚糖酶活性達82IU/mL。離心上清液為重組甘露聚糖酶粗酶液，經(jīng)截留分子量為IOkDa的超濾膜濃縮,再經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析和SephadexG-75凝膠過濾層析純化，純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測為單一條帶，并顯示重組甘露聚糖酶分子量為44. 3kDa，表明該酶已在新載體pPIC9KD中成功實現(xiàn)了分泌表達。
權(quán)利要求
1.一種包含多個多克隆位點的載體PPIC9K11，其特征在于它的多克隆位點結(jié)構(gòu)如圖I所示。
2.—種構(gòu)建載體pPIC9KD的方法，其特征在于具體構(gòu)建步驟包括 1)引物設(shè)計及多克隆位點擴增 a.根據(jù)pPIC9K中多克隆位點處序列設(shè)計引物9Kadd 5' -GCGGCCGCACGCGTGCGCGCCTTAAGACTAGTCCTAGGGAATTCTACGTAA-3' 以pPIC9K質(zhì)粒為模板，使用引物9Kadd和pPIC9K通用引物5’ -AOX(5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3丨)進行PCR，擴增出片段9KADD并連至pUCm_T載體上，新載體命名為pUCm-T-9KADD ； 2)pPIC9KD質(zhì)粒的構(gòu)建 對pPIC9K和pUCm-T-9KADD載體分別使用限制性酶切位點BamH I和Not I進行雙酶切，純化酶切后的片段并進行連接，經(jīng)測序后獲得PPIC9K11質(zhì)粒。
3.—種pPIC9KD質(zhì)粒的使用方法，其特征在于具體步驟包括 1)引物設(shè)計及目的基因的擴增 a.選擇目的基因內(nèi)部沒有的酶切位點并以此設(shè)計上下游引物，根據(jù)限制性內(nèi)切酶緩沖液(以TAKARA公司為例)的不同可選擇的酶切位點組合有EcoR I和Not I以及EcoR I、Afl II、BssHII、Spe I、Mlu I四種酶中任意兩種的組合,其他包括Avr II和Not I、Afl II和Not I等在內(nèi)的組合則需要對載體進行分布酶切； b.使用設(shè)計好的引物以目的基因或包含目的基因的載體為模板進行PCR，回收目的條帶并與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序； 2)載體與目的基因的酶切、連接及轉(zhuǎn)化 a.選擇與引物對應(yīng)的酶對pPIC9KD質(zhì)粒及包含目的基因的T載體進行雙酶切； b.分別回收目的基因及酶切的pPIC9KD質(zhì)粒片段，并使用T4DNA連接酶進行連接； c.對包含目的基因的pPIC9KD進行線性化，按照畢赤酵母表達手冊進行電轉(zhuǎn)、篩選，得到高拷貝的畢赤酵母重組子；按照手冊上的標(biāo)準(zhǔn)流程進行誘導(dǎo)表達獲得目的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種多克隆位點處包含多個單酶切位點的pPIC9K表達載體，該載體能能夠適用于內(nèi)部含有EcoR I、Avr II等酶切位點基因的表達。所述表達載體的特征在于，該表達載體的多克隆位點處添加了Afl II、BssH II、Spe I和Mlu I四個原pPIC9K載體沒有的單酶切位點，pPIC9KD多克隆位點結(jié)構(gòu)如圖1所示。
文檔編號C12N15/81GK102703496SQ20121018137
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月5日
發(fā)明者李劍芳, 鄔敏辰, 魏喜換 申請人:江南大學(xué)