專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于抑制口蹄疫病毒復(fù)制的RNAi及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制FMDV(ロ蹄疫病毒)防治技術(shù)領(lǐng)域，由抑制FMDV復(fù)制的兩對(duì)shRNA序列組成的一種用于抑制FMDV復(fù)制的RNAi，本發(fā)明還包括RNAi的制備方法。
背景技術(shù)：
ロ蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由 ロ 蹄疫病毒(foot-andnouth disease virus, FMDV)引起人畜共患的高度接觸性傳染病。為小RNA病毒科(Picornaviridae), ロ蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的成員。FMDV主要感染偶蹄類(lèi)動(dòng)物,在全球廣泛流行，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)危害極大。因此，國(guó)際獸疫局(OIE)將其列為需要上報(bào)類(lèi)傳染病，并嚴(yán)格控制其傳播。由于FMDV存在7個(gè)血清型(A型、O型、C型、Asia I型和南非I型、南非II型、南非III型)和70多個(gè)亞型，各型間不存在交叉保護(hù)作用，一種類(lèi)型的疫苗不能保護(hù)家畜免受另ー種類(lèi)型病毒的感染，如果用ー個(gè)型的疫苗免疫家畜，存在很大的盲目性。為了克服目前窘迫局面，研究具有廣譜抗FMDV作用的制劑有重要的實(shí)踐意義。另外，由于FMDV快速傳染性和強(qiáng)致病性的特點(diǎn)，給傳統(tǒng)的疫苗快速控制ロ蹄疫的流行帶來(lái)了障礙，所以?xún)H用疫苗和傳統(tǒng)的自然育種方法很難完全控制此病。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是廣泛存在于生物界的一種由內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA分子誘發(fā)的同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是許多生物具有的對(duì)抗入侵的核酸。隨著RNAi機(jī)制及其應(yīng)用研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)無(wú)論體內(nèi)還是體外試驗(yàn)，SiRNA均能夠抑制多種病毒的増殖。近年來(lái)，許多學(xué)者以人工誘導(dǎo)RNAi的方式進(jìn)行了病毒復(fù)制的干擾研究，取得了良好進(jìn)展。例如在抗こ型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、艾滋病毒(HIV)和脊髄灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都發(fā)現(xiàn)RNA干擾，對(duì)于抑制這類(lèi)病毒的復(fù)制效果極好，可能為這類(lèi)病毒病的治療創(chuàng)立新的、更有效的途徑。但是目前關(guān)于RNAi仍有很多問(wèn)題亟待解決，例如進(jìn)行RNAi的時(shí)間和靶位點(diǎn)；哺乳類(lèi)動(dòng)物中的干擾素反應(yīng)；RNAi作用的確切機(jī)制；脫靶效應(yīng)等。因此，今后的研究仍然集中在RNAi作用機(jī)制的探討上，以及如何改進(jìn)運(yùn)用RNAi的方法來(lái)研究基因的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服各型間不存在交叉保護(hù)作用，疫苗和傳統(tǒng)的自然育種方法難以控制FMD，提供ー種構(gòu)建靶向FMDV基因組的特定保守基因區(qū)段的慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，即ー種用于抑制ロ蹄疫病毒復(fù)制的RNAi。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案
ー種用于抑制ロ蹄疫病毒復(fù)制的RNAi，包含siRNA序列，通過(guò)構(gòu)建shRNA慢病毒表達(dá)載體，獲得復(fù)制缺陷型慢病毒、用獲得的慢病毒感染PK-15細(xì)胞，篩選出具有抑制ロ蹄疫病毒復(fù)制的PK-15細(xì)胞克隆。所述shRNA (short hairpin RNA即短發(fā)夾脫氧核糖核酸)序列SEQ ID NO: I至SEQ ID NO:4 包括3D1: 5，一 3’
SEQ ID NO: I T CACCGCGTCATGAGGATAATTTAACCGAAGTTAAATTATCCTCATGACGC
SEQ ID NO:2: B AAAAGCGTCATGAGGATAATTTAACTTCGG
TTAAATTATCCTCATGACGC
3D2: 5，一 3，
SEQ ID NO:3 TCACCGGACCACACAGGAGAAGTTGACGAATCAACTTCTCGTGTATGGTCC
SEQ ID NO:4: B AAAAGGACGATACAGGAGAAGTTGATTCG
TCAACTACTCCTGTATGGTCC
CTCCTCGTGCAACTGGC
所述shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建，包括shRNA克隆載體的構(gòu)建和表達(dá)載體的構(gòu)建。所述復(fù)制缺陷型慢病毒的獲得,包括shRNA表達(dá)質(zhì)粒與Packaging Mix(包裝混合物)共同轉(zhuǎn)染293-FT (人胚腎細(xì)胞株)細(xì)胞，收獲細(xì)胞上清，獲得復(fù)制缺陷型慢病毒。所述復(fù)制缺陷型慢病毒感染PK-15細(xì)胞，包括復(fù)制缺陷型慢病毒感染PK-15，blasticidin抗性篩選，獲得抑制ロ蹄疫病毒復(fù)制的PK-15細(xì)胞克隆。所述抑制ロ蹄疫病毒復(fù)制效果的驗(yàn)證方法，包括流式細(xì)胞術(shù)、間接免疫熒光、TCID50 (組織細(xì)胞半數(shù)感染量)及Real-time RT-PCR、。本發(fā)明還提供了 RNAi的制備及驗(yàn)證方法，包括以下步驟 a.設(shè)計(jì)并合成shRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列一ds oligo。b.利用T4 DNA連接酶將ds oligo克隆進(jìn)pEN/U6載體。c.轉(zhuǎn)化TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序檢驗(yàn)序列的保真性。d.將上述質(zhì)粒分別與pDEST載體進(jìn)行LR重組，獲得表達(dá)骨架。e.獲得的表達(dá)骨架與優(yōu)化好的Packaging Mix共轉(zhuǎn)染293-FT細(xì)胞，產(chǎn)生復(fù)制缺陷型慢病毒粒子。f.將產(chǎn)生的復(fù)制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15細(xì)胞，將ds oligo整合到宿主細(xì)胞的基因組上。g. blasticidin抗性篩選，建立穩(wěn)定抑制ロ蹄疫復(fù)制的PK-15細(xì)胞克隆。h.分別用流式細(xì)胞術(shù)、間接免疫熒光、TCID5tl (組織細(xì)胞半數(shù)感染量)及Real-time RT-PCR (實(shí)時(shí)定量-反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng))驗(yàn)證shRNA抑制效果。FMDV遺傳變異頻率高，抗原差異大，血清學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了 7種血清型和超過(guò)80種亞型，并且每個(gè)亞型都有許多基因組變異的毒，F(xiàn)MDV能夠通過(guò)表面結(jié)構(gòu)蛋白上的抗原決定簇變異逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，即便是面對(duì)RNAi，病毒仍能夠通過(guò)RNA中堿基的刪除或突變進(jìn)行逃逸。所以RNAi技術(shù)運(yùn)用于抗病毒研究首先就要解決病毒高度遺傳變異帶來(lái)的逃逸這ー關(guān)鍵問(wèn)題。解決上述問(wèn)題的辦法之一就是設(shè)計(jì)的shRNA靶向病毒基因組的高度保守區(qū)域。干擾靶序列的保守性越高，交叉抑制各種血清型FMDV的潛力就越大。3D基因?qū)儆贔MDV非結(jié)構(gòu)蛋白基因，均高度保守。3D為RNA依賴(lài)的RNA聚合酶，催化病毒RNA的合成。病毒以VPg-pU-pU作為引物，以3Dpol蛋白為RNA聚合酶，以2BC、3A及ー些宿主蛋白因子組成復(fù)制復(fù)合物，附著在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜上合成負(fù)鏈RNA，再以負(fù)鏈RNA為模板合成正鏈RNA。在FMDV不同的血清型和亞型中，3D的核苷酸序列高度保守。鑒于以上分析，本研究選擇了在FMDV復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用并且具有較高保守性的3D基因區(qū)域作為干擾靶區(qū)。 按照shRNA序列選擇的一般原則，利用Invitrogen公司的BLOCK-it RNAiDesigner在線設(shè)計(jì)程序初步篩選ー些shRNA序列，同時(shí)對(duì)干擾靶位序列進(jìn)行了同源性分祈。從BLAST檢驗(yàn)結(jié)果可以看出，所選shRNA干擾靶序列在較廣泛流行的Asia 1、0、C、A血清型間保守性較高，而且有的靶序列在7個(gè)血清型中都有很高的保守性。當(dāng)前較為常用的5種制備siRNAs的方法是體外轉(zhuǎn)錄法、直接化學(xué)合成法、長(zhǎng)片段dsRNAs經(jīng)RNase III類(lèi)(如Dicer)降解、PCR制備的siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)、siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體或病毒載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNAs五種。前三種涉及到RNA操作，對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求較高。利用表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA不僅可以避開(kāi)RNA操作，而且可以長(zhǎng)效、穩(wěn)定的產(chǎn)生RNAi效應(yīng)。常用siRNA表達(dá)載體的啟動(dòng)子屬于RNA聚合酶III (pol III)，主要·有鼠源的U6啟動(dòng)子、人源的U6啟動(dòng)子和人Hl啟動(dòng)子3種。各種siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄出的產(chǎn)物是可折疊形成的shRNA，然后在細(xì)胞中被Dicer酶切割成siRNA，進(jìn)而啟動(dòng)RNAi介導(dǎo)基因沉默。使用siRNA表達(dá)載體需要合成2條編碼shRNA序列的DNA單鏈，經(jīng)退火后插入對(duì)應(yīng)載體的pol III啟動(dòng)子下游。本發(fā)明使用的PEN/U6是含有人源U6啟動(dòng)子的shRNA表達(dá)載體，它是由Pol III啟動(dòng)子、卡那霉素抗性基因和大腸桿菌復(fù)制子等組成。利用已經(jīng)線性化載體的粘性末端的堿基特性，將合成的一對(duì)帶有4個(gè)堿基的突出端的50-mer的寡核苷酸退火并連接到上述PEN/U6載體。這種部分具有回文結(jié)構(gòu)的DNA序列在RNA pol III啟動(dòng)子的作用下可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出眾多的shRNA，從而啟動(dòng)RNA干擾過(guò)程。FMDV 3Dpol為RNA依賴(lài)的RNA聚合酶，催化病毒RNA的合成，而且高度保守，因此針對(duì)3D的RNAi可以突破血清型的壁壘，解決傳統(tǒng)疫苗免疫血清型間不能交叉保護(hù)的問(wèn)題。本發(fā)明注重干擾靶區(qū)的選擇和shRNA的初步篩選，在細(xì)胞水平上考察了所選shRNA對(duì)靶基因的干擾作用，并借助慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，篩選表達(dá)shRNA的陽(yáng)性PK-15細(xì)胞克隆，在細(xì)胞模型水平有助于闡明抑制FMDV復(fù)制的關(guān)鍵靶基因、病原感染過(guò)程及病原中該靶基因的生物學(xué)功能，并為轉(zhuǎn)基因抗病育種打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。


圖I為表達(dá)shRNA的3D1 ds oligo與pEN/U6載體連接的重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果示意 圖2為表達(dá)shRNA的3D1和3D2 ds oligo與pEN/U6載體連接的重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果示意 圖3為pENU6/3DI-shRNA與plentil6/DEST表達(dá)載體重組的測(cè)序結(jié)果示意 圖4為pENU6/3D2-shRNA與plentil6/DEST表達(dá)載體重組的測(cè)序結(jié)果示意 圖5為間接免疫熒光驗(yàn)證shRNA對(duì)FMDV復(fù)制的抑制效果；
圖6為T(mén)CID5tl測(cè)定shRNA抗病毒效果；
圖7為real-time RT-PCR驗(yàn)證shRNA對(duì)FMDV復(fù)制的抑制效果；圖8為流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證shRNA對(duì)FMDV復(fù)制的抑制效果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)敘述 實(shí)施例I
1、表達(dá)shRNA的dsoligo的生成
借助美國(guó)Invitrogen公司網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)軟件(BLOCK-iT RNAi Designer),確定針對(duì)PEN/U6載體要求的具體shRNA片段3D1及3D2對(duì)應(yīng)的DNA插入序列，送與寶生物工程(大連)有限公司合成并退火生成ds oligo。插入序列如下
3D1: 5，一 3’
SEQ ID NO:I T CACCGCGTCATGAGGATAATTTAACCGAAGTTAAATTATCCTCATGACGC
SEQ ID NO:2: B AAAAGCGTCATGAGGATAATTTAACTTCGG
TTAAATTATCCTCATGACGC
3D2: 5，一 3，
SEQ ID NO:3 TCACCGGACCACACAGGAGAAGTTGACGAATCAACTTCTCGTGTATGGTCC
SEQ ID NO:4: B AAAAGGACGATACAGGAGAAGTTGATTCGTCAACTACTCCTGTATGGTCC
2、dsoligo 與 pEN/U6 載體連接，構(gòu)建 pEN/U6_shRNA 連接反應(yīng)體系
2. I雙鏈寡核苷酸(ds oligo)的生成
(1)在O. 2ml的PCR擴(kuò)增管中建立下列體系
權(quán)利要求
1.一種用于抑制口蹄疫病毒復(fù)制的RNAi，其特征在于包含SiRNA序列，通過(guò)構(gòu)建ShRNA慢病毒表達(dá)載體，獲得復(fù)制缺陷型慢病毒，用所述慢病毒感染PK-15細(xì)胞，篩選表達(dá)shRNA的PK-15細(xì)胞克隆并驗(yàn)證其對(duì)FMDV的抑制效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于抑制口蹄疫病毒復(fù)制的RNAi，其特征在于所述shRNA 序列 SEQ ID NO: I 至 SEQ ID N0:4，包括3D1: 5，一 3’SEQ ID NO:I T CACCGGAGTTGAGCTGGACTCTTACCGAAGTAAGAGTCCAGCTCAACTCCSEQ ID NO:2 B AAAAGGAGTTGAGCTGGACTCTTACTTCGGTAAGAGTCCAGCTCAACTCC3D2: 5’ — 3’SEQ ID N0:3 T CACCGCGGTTGGTTGTAATCCTGATCGAAATCAGGATTACAACAACCGCSEQ ID NO:4 B AAAAGCGGTTGGTTGTAATCCTGATTTCGA TCAGGATTACAACCAACCGC 。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的一種用于抑制口蹄疫病毒復(fù)制的RNAi，其特征在于所述shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建，包括shRNA克隆載體的構(gòu)建和表達(dá)載體的構(gòu)建。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于抑制口蹄疫病毒復(fù)制的RNAi，其特征在于所述完整慢病毒的獲得是將shRNA表達(dá)質(zhì)粒與Packaging Mix共同轉(zhuǎn)染293-FT細(xì)胞，收獲細(xì)胞上清，獲得具有感染性的慢病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于抑制口蹄疫病毒復(fù)制的RNAi，其特征在于所述用收獲復(fù)制缺陷型慢病毒感染PK-15細(xì)胞，采用滅瘟素blasticidin進(jìn)行抗性篩選獲得表達(dá)shRNA的PK-15細(xì)胞陽(yáng)性克隆。
6.一種如權(quán)利要求I所述RNAi的制備方法，包括以下步驟 a.設(shè)計(jì)并合成shRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列一dsoligo ； b.利用T4DNA連接酶將ds oligo克隆進(jìn)pEN/U6載體； c.轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆，測(cè)序檢驗(yàn)序列的保真性； d.將上述pEN/U63Dl和3D2兩種質(zhì)粒分別與pDEST載體進(jìn)行LR重組，獲得表達(dá)骨架； e.獲得的表達(dá)骨架與PackagingMix共轉(zhuǎn)染293-FT細(xì)胞，產(chǎn)生復(fù)制缺陷型慢病毒粒子; f.將產(chǎn)生的復(fù)制缺陷型慢病毒粒子感染PK-15細(xì)胞； g.blasticidin抗性篩選，獲得表達(dá)shRNA的PK-15細(xì)胞陽(yáng)性克隆； h.分別用流式細(xì)胞術(shù)、間接免疫熒光、TCID5tl及Real-timeRT-PCR驗(yàn)證抑制效果。
全文摘要
一種用于抑制口蹄疫病毒復(fù)制的RNAi及其制備方法，所述包含siRNA序列、shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建、復(fù)制缺陷型慢病毒的獲得、慢病毒感染PK-15細(xì)胞(豬腎細(xì)胞)以及抑制口蹄疫病毒復(fù)制效果的驗(yàn)證方法，該序列具有明顯抑制口蹄疫病毒在敏感細(xì)胞上復(fù)制的作用。本發(fā)明對(duì)口蹄疫病毒體內(nèi)外復(fù)制進(jìn)行RNA干擾的探索，構(gòu)建靶向口蹄疫病毒基因組的特定保守基因區(qū)段的慢病毒載體介導(dǎo)的穩(wěn)定整合的RNA干擾技術(shù)，有望構(gòu)建靶向口蹄疫病毒的siRNA的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。為RNAi應(yīng)用于口蹄疫病毒的基因功能研究以及口蹄疫的防治積累了必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為動(dòng)物的抗病育種提供前期準(zhǔn)備。
文檔編號(hào)C12N15/867GK102660546SQ20121018050
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者劉永杰, 劉湘濤, 吳錦艷, 尚佑軍, 尹雙輝, 張克山, 楊順利, 王光祥, 田宏, 陳妍, 靳野, 魏衍全 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所