專(zhuān)利名稱(chēng)：一種應(yīng)用miRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于miRNA的應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種應(yīng)用miRNA抑制炎癥狀態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病作為人類(lèi)的第一殺手，其高發(fā)病率和死亡率一直頗受世界關(guān)注。因此，積極探詢(xún)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制將對(duì)冠心病的治療和預(yù)后起重要作用。迄今為止，人們對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理仍未完全明了。一直以來(lái)，科學(xué)界比較公認(rèn)的是內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)。但近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)時(shí)其遷移活性便大大提高，這直接導(dǎo)致了動(dòng)脈粥樣硬化血管的正性重構(gòu)以及促發(fā)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的血管新生。正性重構(gòu)的動(dòng)脈粥樣硬化血管的特點(diǎn)是具有薄纖維帽、富含血管和脂質(zhì)核心的易損斑塊。 易損斑塊處于ー種生物不穩(wěn)定狀態(tài)，它的纖維帽以及斑塊內(nèi)豐富血管的破裂出血是引起包括急性心肌梗死在內(nèi)的急性冠狀動(dòng)脈綜合征發(fā)生的罪魁禍?zhǔn)?。因此，如何抑制炎性?xún)?nèi)皮細(xì)胞的遷移活性一直是預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化的焦點(diǎn)之一。血管內(nèi)皮炎癥發(fā)生的起始階段，在血管緊張素II等血管活性物質(zhì)刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎性活化?；罨膬?nèi)皮細(xì)胞主要表現(xiàn)為ETS-I等轉(zhuǎn)錄因子的激活以啟動(dòng)下游血管新生和炎性基因FLT1，VCAMl, MCPl等的表達(dá)。其中ETS-I屬于E26轉(zhuǎn)化特異序列(E26Transformation-specifc Sequence, ETS)轉(zhuǎn)錄因子家族。該家族成員表達(dá)譜廣泛并且含有相同的ETS功能域，該功能域能夠識(shí)別并特異結(jié)合于含有GGA (A/T)序列的啟動(dòng)/增強(qiáng)區(qū)的基因，從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。大量研究表明，轉(zhuǎn)錄因子ETS-I在內(nèi)皮細(xì)胞的激活直接導(dǎo)致了內(nèi)皮細(xì)胞的遷移活性增高并較易于形成新生血管。Zhan等運(yùn)用ETS-I敲除的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，該模型采用血管緊張素-II刺激后內(nèi)皮募集炎性細(xì)胞的能力以及血管重構(gòu)的程度大大降低，這與ETS-I下游基因VCAM-1，MCP-1, PAI-I和p21CIP的表達(dá)抑制相關(guān)。因此血管緊張素-II的促炎癥血管的新生和血管重構(gòu)作用主要是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子ETS-I引起的。MicroRNA是ー類(lèi)由多細(xì)胞動(dòng)物或植物基因的內(nèi)含子、miRNA獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位或基因簇編碼的19 — 25個(gè)核苷酸(nucleotide, nt)大小的內(nèi)源性單鏈RNA,它們?cè)谵D(zhuǎn)錄后水平沉默靶基因的翻譯從而對(duì)生物體基因表達(dá)起到精細(xì)調(diào)節(jié)的作用。如果miRNA與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)匹配完全或接近完全，則該復(fù)合體降解靶mRNA;若兩者序列部分匹配則通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯來(lái)沉默特定基因的表達(dá)。現(xiàn)已明確，它們?cè)谶M(jìn)化上有高度保守性，對(duì)諸如心血管疾病、腫瘤、干細(xì)胞分化和自我更新等生理病理過(guò)程起重要的調(diào)控作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種應(yīng)用miRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，該方法エ藝簡(jiǎn)單，成本低，采用miR-155有效的抑制了炎癥細(xì)胞的遷移，從而達(dá)到預(yù)防心血管疾病的目的。
本發(fā)明的一種應(yīng)用miRNA抑制炎癥內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，包括(I)篩選miR-155靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證，利用重組血管緊張素II刺激內(nèi)皮細(xì)胞，模擬動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；(2)利用miR-155模擬物增加該miRNA在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)量；(3)利用Western blot法檢測(cè)miR-155模擬物對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)的ETS-1蛋白表達(dá)的抑制作用；(4)利用劃痕法對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)。所述步驟(I)中的重組血管緊張素II的濃度為I U M，刺激時(shí)間為6h。 所述步驟(2)中的miR-155模擬物為包含miR-155核酸序列“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，主序列如下5’ -UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3’。
_3] 有益.效果本發(fā)明エ藝簡(jiǎn)單，成本低，采用miR-155有效的抑制了炎癥細(xì)胞的遷移，從而達(dá)到預(yù)防心血管疾病的目的。


圖I為計(jì)算機(jī)軟件分析顯示ETS-I的3’非翻譯區(qū)存在兩個(gè)miR-155的作用靶點(diǎn)；圖2為miR-155能夠抑制攜帶ETS-I靶序列螢光素酶的相對(duì)活性；圖3為miR-155能夠抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的ETS-I在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)；圖4為miR-155有效減少血管緊張素II誘導(dǎo)的炎性?xún)?nèi)皮細(xì)胞的遷移。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例II. miR-155靶基因的篩選方法運(yùn)用TargetScan、PicTar等軟件檢索miR-155可能的祀基因，發(fā)現(xiàn)ETS-1基因的3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)含有2個(gè)miR-155的靶位點(diǎn)(附圖I)。選定內(nèi)皮細(xì)胞炎癥相關(guān)的ETS-I作為候選基因。2.報(bào)告基因驗(yàn)證ETS-I是miR-155的靶基因構(gòu)建pGL3-ETSl-3’ UTR重組質(zhì)粒，與miR-155模擬物共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞293T，轉(zhuǎn)染24h后凍融細(xì)胞一次,用專(zhuān)用裂解液裂解細(xì)胞,姆孔IOOii I,吹打均勻，充分裂解后樣品備用。采用Promega公司的螢光素酶檢測(cè)試劑盒，在1.5ml離心管中加入LARII 50 和裂解液5 u I混勻，酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)螢光素酶；加入50 u I Stop&Glo溶液滅活螢火蟲(chóng)螢光素酶，酶標(biāo)儀檢測(cè)海腎螢光素酶。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染從10-60nM到不同濃度的miR-對(duì)照對(duì)螢光素的表達(dá)均無(wú)影響。而轉(zhuǎn)染10, 30,60nM不同濃度的miR-155模擬物后螢光素的表達(dá)分別下降了約20%，40%和50%左右(見(jiàn)附圖2)。3.利用Western blot法檢測(cè)miR-155模擬物對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)的ETS-1蛋白表達(dá)的抑制作用miR-155模擬物或miR-對(duì)照各40nM與轉(zhuǎn)染試劑混合，內(nèi)皮細(xì)胞按I X 105/ml密度接種于12孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。換無(wú)生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12h對(duì)其進(jìn)行饑餓干預(yù)。更換上述步驟中的培養(yǎng)液，加入重組血管緊張素II，使其在培養(yǎng)液中的濃度為I PM，刺激內(nèi)皮細(xì)胞6h。收集細(xì)胞蛋白樣品進(jìn)行電泳。電泳時(shí)，按每孔20 yg蛋白上樣量等量上樣。以150V電泳1.5h，100V電壓下轉(zhuǎn)膜lh。將膜放入自封袋中，加入5%脫脂奶粉/TBST，完全浸泡膜并封ロ，于室溫下振蕩封閉lh。加入TBST稀釋后的抗血管緊張素I型受體或?qū)φ誈APDH抗體ー抗(抗血管緊張素I型受體抗體按I :1000稀釋?zhuān)笹APDH抗體按I :1000稀釋)，4°C振蕩孵育過(guò)夜。吸凈ー抗，TBST漂洗膜5minX 3 ；加入稀釋后的ニ抗(均為I :5000稀釋)，水平搖床室溫孵育lh。吸凈ニ杭，TBST漂洗膜，5minX 3，等體積混合ECL (AB液)，充分覆蓋濕潤(rùn)NC膜表面，靜置Imin ;于暗室中用保鮮膜將NC膜封好，將X光片平放于NC膜上顯影并記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果可見(jiàn)，在血管緊張素II的刺激下，炎癥內(nèi)皮細(xì)胞ETS-I蛋白的表達(dá)量明顯升高。然而增加了 miR-155模擬物在炎癥內(nèi) 皮細(xì)胞的表達(dá)量后，血管緊張素II誘導(dǎo)的ETS-I蛋白的表達(dá)量明顯下降。(見(jiàn)附圖3)4.炎癥內(nèi)皮細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)采用“劃痕法”對(duì)炎癥內(nèi)皮細(xì)胞的遷移活性進(jìn)行研究。內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-155模擬物或miR-對(duì)照各40nM，按I X 105/ml密度接種于12孔板，做3復(fù)孔，24h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，總共48h。換無(wú)生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12h對(duì)其進(jìn)行饑餓干預(yù)。此時(shí)細(xì)胞應(yīng)布滿(mǎn)培養(yǎng)板底，形成單層細(xì)胞。用Iml滅菌藍(lán)色槍頭勻速勻カ的向ー個(gè)方向劃單層內(nèi)皮細(xì)胞，每孔平行的劃3次，形成3條無(wú)細(xì)胞劃痕區(qū)。PBS清洗細(xì)胞2次，加入無(wú)生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液。在倒置顯微鏡下用記號(hào)筆在培養(yǎng)板底部為細(xì)胞劃痕邊緣做記號(hào)并拍攝照片。加入血管緊張素II重組蛋白，使其濃度為1UM，刺激內(nèi)皮細(xì)胞12h后在倒置顯微鏡下觀察劃痕兩側(cè)的距離變化并拍照。用Image-pix) plus 6. 0軟件計(jì)算刺激前后劃痕兩 側(cè)的距離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在血管緊張素II的刺激下，轉(zhuǎn)染miR-対照的炎癥內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性大大增加，劃痕愈合率達(dá)65%左右。而運(yùn)用miR-155模擬物増加炎癥內(nèi)皮細(xì)胞miR-155的表達(dá)量能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞向劃痕區(qū)的遷移，劃痕愈合率為20%左右。(見(jiàn)附圖4)
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用miRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，包括 (1)篩選miR-155靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證，利用重組血管緊張素II刺激內(nèi)皮細(xì)胞，模擬動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)； (2)利用miR-155模擬物增加該miRNA在內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)量； (3)利用Westernblot法檢測(cè)miR-155模擬物對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)的ETS-I蛋白表達(dá)的抑制作用； (4)利用劃痕法對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種應(yīng)用miRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，其特征在于所述步驟(I)中的重組血管緊張素II的濃度為I μ Μ,刺激時(shí)間為6h。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種應(yīng)用miRNA抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，其特征在于所述步驟(2)中的miR-155模擬物為包含miR-155核酸序列“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，主序列如下5’ -UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGG⑶-3'
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用miRNA抑制炎癥狀態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞遷移的方法，包括(1)篩選miR-155靶基因并通過(guò)報(bào)告基因進(jìn)行驗(yàn)證，利用重組血管緊張素II刺激內(nèi)皮細(xì)胞，模擬動(dòng)脈粥樣硬化狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)；(2)利用miR-155模擬物增加該miRNA在炎癥內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)量；(3)利用Western blot法檢測(cè)miR-155模擬物對(duì)血管緊張素II誘導(dǎo)的ETS-1蛋白表達(dá)的抑制作用；(4)利用單層內(nèi)皮細(xì)胞劃痕法對(duì)炎癥狀態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，成本低，采用miR-155有效的抑制了炎癥內(nèi)皮細(xì)胞的遷移活性，同時(shí)為冠心病的防治提供有效干預(yù)靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102766594SQ20121017968
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者朱霓, 秦永文, 袁文俊, 趙仙先 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)