專利名稱：結(jié)核分枝桿菌Rv3120的重組蛋白、其制備方法及其在細(xì)胞免疫診斷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥體外診斷試劑領(lǐng)域，特別涉及一種新型結(jié)核病免疫標(biāo)志物Rv3120的重組蛋白、其制備方法及其在細(xì)胞免疫診斷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病由病原體——結(jié)核分枝桿菌感染機體所致，至今仍為人類重要的傳染病?？焖?、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染，對于結(jié)核病的控制具有重要意義。MTB感染的診斷方法有很多，目前臨床最為常用的方法仍然依靠傳統(tǒng)的痰涂片細(xì)菌學(xué)檢查，但檢出率低；MTB培養(yǎng)可做為結(jié)核病確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其培養(yǎng)時間太長，一般4-6周，難以滿足臨床 需要；BaCteC技術(shù)雖縮短了培養(yǎng)時間，但費用較高，短時間內(nèi)難以推廣普及；X線和CT檢查僅提供影像學(xué)可能性診斷；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)及其它基因診斷方法作為臨床診斷尚存在操作復(fù)雜，對技術(shù)和人員專業(yè)素質(zhì)要求較高，且仍不能用于菌陰結(jié)核病的快速診斷?？菇Y(jié)核免疫主要是細(xì)胞免疫，包括致敏的T淋巴細(xì)胞和被激活的巨噬細(xì)胞。致敏的T淋巴細(xì)胞可直接殺死帶有結(jié)核桿菌的靶細(xì)胞，同時對釋放多種作用于世噬細(xì)胞的淋巴因子，使巨噬細(xì)胞聚集在病灶周圍形成以單核細(xì)胞為主的增生性炎癥。被激活的巨噬細(xì)胞極大地增強對結(jié)核桿菌的吞噬消化，抑制繁殖，阻止擴散，甚至銷毀的能力，充分分揮細(xì)胞免疫的作用。目前廣泛應(yīng)用的結(jié)核病細(xì)胞免疫診斷技術(shù)仍依賴于皮試檢測試劑一結(jié)核分枝桿菌純蛋白衍生物(Pro)。然而pro存在與環(huán)境分枝桿菌以及BCG疫苗株的交叉反應(yīng)，所以診斷價值偏低。因而發(fā)現(xiàn)新的結(jié)核病細(xì)胞免疫標(biāo)志物，并建立新的結(jié)核病細(xì)胞免疫診斷方法是結(jié)核病診斷所亟需的。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明的一個目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通過使用pET32a質(zhì)粒，在Rv3120該天然蛋白序列前面加了一段Trx · Taq和S · Taq融合標(biāo)簽及His · Tag純化標(biāo)簽。所述Trx · Taq和S · Taq融合標(biāo)簽及His · Tag純化標(biāo)簽的氨基酸序列由SEQ IDNO: I中從氨基末端第I至第153位氨基酸殘基序列組成。SEQ IDNO: I中從氨基末端第154至第353位氨基酸殘基序列組成天然Rv3120蛋白氨基酸序列。本發(fā)明的另一個目的是提供一種編碼上述的Rv3120重組蛋白的核苷酸序列，其具有選自下列C)、d)或e)的核苷酸序列c) SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；d)不同于SEQ ID NO: 2但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO: 2所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列；e)在嚴(yán)格雜交條件下與上述c)或d)中的序列雜交，并且編碼具有所述Rv3120重組蛋白活性的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一個目的在于提供所述的結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(I)制備結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA ；(2)擴增 Rv3120 基因;(3)Rv3120基因插入表達質(zhì)粒；(4)將構(gòu)建的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞；(5)誘導(dǎo)表達蛋白Rv3120 ； (6)分離純化誘導(dǎo)表達產(chǎn)物，得到Rv3120重組蛋白，其中，在制備結(jié)核分枝桿菌Rv3120基因中采用的引物為Rv3120_F和Rv3120_R，所述引物Rv3120-F的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，所述引物Rv3120_R的核苷酸序列如SEQ ID No:4 所示。本發(fā)明的另一目的在于提供所述結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白在制備檢測或診斷結(jié)核病的試劑中的應(yīng)用。所述Rv3120重組蛋白的基因引物為Rv3120-F和Rv3120_R，所述Rv3120-F的核苷酸序列為如SEQ ID No:3所示，所述Rv3120_R的核苷酸序列為如SEQID No:4 所示。本發(fā)明的另一目的在于提供所述結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白、其特異性抗體或其基因引物在制備結(jié)核病檢測試劑盒中的應(yīng)用。所述Rv3120重組蛋白的基因引物為Rv3120-F和Rv3120-R，所述Rv3120_F的核苷酸序列為如SEQ ID No: 3所示，所述Rv3120_R的核苷酸序列為如SEQ ID No:4所示。本發(fā)明的另一目的在于提供一種結(jié)核病檢測試劑盒，其組分中的檢測抗原是所述結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白。本發(fā)明的目的是提供一種包含所述結(jié)核分枝桿菌Rv3120基因的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種新型結(jié)核診斷試劑，其含有所述結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白。本發(fā)明的再一個目的是提供上述試劑的制備方法。本發(fā)明的一個方面，提供了一種包含所述結(jié)核分枝桿菌Rv3120基因的重組質(zhì)粒，即將Rv3120基因序列插入商用表達質(zhì)粒序列中。Rv3120基因NCBI登陸號為NC_000962. 2 ;蛋白號為CAB08377. I。本發(fā)明的“Rv3120基因序列”也包括對NC_000962. 2中一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與NC_000962. 2核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼相同的氨基酸序列。該術(shù)語還包括在中度嚴(yán)密條件下，更佳地在高度嚴(yán)密條件下與NC_000962. 2的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與NC_000962. 2的核苷酸序列同源性至少70%，更佳地至少90%的核苷酸序列。本發(fā)明的重組質(zhì)粒，通常將Rv3120基因插入表達質(zhì)粒的多克隆位點處得到。本發(fā)明的重組質(zhì)粒在制備過程中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，然后將編碼本發(fā)明的核苷酸序列可操作性地連接于表達調(diào)控序列，從而形成蛋白表達載體。本發(fā)明中可采用的載體有pET32a等。本發(fā)明的一個實施例中，所用的質(zhì)粒為pET32a。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種結(jié)核分枝桿菌相關(guān)重組蛋白，該蛋白是將插入Rv3120基因的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞而得到的。用作檢測試劑的Rv3120重組蛋白與NCBI上的CAB08377. I蛋白序列相比，加入了載體相關(guān)序列和純化標(biāo)簽。例如，使用pET32a質(zhì)粒時，蛋白序列前面加了 pET32a上的一段Trx · Taq和S · Taq融合標(biāo)簽和一段His Tag純化標(biāo)簽。所用的宿主細(xì)胞應(yīng)當(dāng)與表達質(zhì)粒相匹配。可使用原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞等，例如常用的大腸桿菌(E. coli)。用于轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以是BL21 (DE3)或BL21 plysS (DE3)菌株等。本發(fā)明的一個實施例中所用的就是BL21 plysS (DE3)菌株。本發(fā)明的另一方面，提供了上述結(jié)核分枝桿菌相關(guān)蛋白的制備方法，包括以下步驟(I)結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA的制備；(2) Rv3120 基因的擴增；(3)Rv3120基因插入表達質(zhì)粒；(4)將構(gòu)建的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞；(5)誘導(dǎo)表達蛋白Rv3120 ；(6)分離純化誘導(dǎo)表達產(chǎn)物，得到Rv3120重組蛋白。上述制備方法中，各種實驗參數(shù)均按常規(guī)操作選擇，可視具體實驗條件而定。本發(fā)明的Rv3120基因序列可以用PCR擴增法獲得?？筛鶕?jù)本發(fā)明所公開的相關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的基因組DNA為模板，擴增而得到相關(guān)序列。本發(fā)明中，重組蛋白所用的表達質(zhì)粒可以是pET32a等。本發(fā)明的一個實施例中，重組蛋白Rv3120按如下方法得到設(shè)計引物(Rv3120_F(SEQ ID No:3):CAAGGTACCATGAGTCCGTCTCCATCG;Rv3120-R (SEQ ID No:4):CCTAAGCTTCTACAGTGACCGTTGGGC)以H37Rv株基因組DNA為模板，PCR擴增Rv3120基因，該基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后雙酶切，克隆構(gòu)建質(zhì)粒。測序表明所插入的序列與GeneBank中H37Rv結(jié)核全基因組對應(yīng)基因序列(Rv3120基因NCBI登陸號為NC_000962. 2;蛋白號為CAB08377. I)完全一致。將驗證好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞進行蛋白表達。
本發(fā)明中，表達Rv3120蛋白所用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌的BL2KDE3)菌株或BL21plysS (DE3)菌株。本發(fā)明中，誘導(dǎo)表達Rv3120蛋白可采用多種方法，如使用異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。本發(fā)明中，分離純化重組Rv3120蛋白也可采用多種方法，如親和層析、離子交換
層析等。本發(fā)明的一個實施例中，重組Rv3120蛋白可以按如下方法獲得將鑒定好的重組質(zhì)粒加入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置45min，42°C水浴鍋中熱擊90秒，冰浴3min，加入500ul的不含抗生素的預(yù)熱的LB培養(yǎng)基。37°C搖床，220rmp,培養(yǎng)45_60min。取一定量在含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布，室溫干燥后倒置于37°C溫箱中培養(yǎng)過夜。挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液體培養(yǎng)基中，220rmp, 37°C培養(yǎng)OD至O. 6左右，加入IPTG，37°C 3h，收集IPTG誘導(dǎo)后的菌體，重懸后超聲破碎。目的蛋白含于上清中，IOOOOg離心30min，收集上清。用IMAC親和色譜柱進行親和純化(2CV去離子水沖洗，5CV含5mM咪唑的washing BufferI平衡,6CV含目的蛋白上清上樣，6CV含5mM咪唑的washingBuffer I 沖洗，6CV 含 IOmM 咪唑的 washing Buffer 2 沖洗，IOCV 含 500mM 咪唑的 ElutionBuffer洗脫)，收集過柱純化的目的蛋白，用20mM Tris-HCl，pH 8. O的溶液透析，IOkDa超濾管對透析后的目的蛋白液進行濃縮，用BCA法測定純化后目的蛋白的濃度。本發(fā)明的另一方面，提供了重組蛋白Rv3120在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用。Rv3120是鑰輔因子生物合成蛋白E的一個成員，位于RD5區(qū)。本發(fā)明的重組蛋白用于結(jié)核病檢測試劑盒的制備，可以用重組Rv3120進行免疫反應(yīng)，也可以用Rv3120基因引物對患者血液抽提物進行PCR，從而達到檢測目的。 本發(fā)明提供了一種檢測結(jié)核病的診斷方法，它含有重組蛋白Rv3120。本發(fā)明的方法主要基于ELI SPOT檢測原理細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子,此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過ELISP0T酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果O其實施方法參考實施例3。與天然結(jié)核分枝桿菌Rv3120蛋白相比，該重組蛋白更易采用親和層析的方法進行純化，純度可達90%以上，不僅大大降低了其生產(chǎn)成本，而且也具有更高的穩(wěn)定性，該重組蛋白在不凍干的情況下4°C可保存I周，-20°C可保存3個月，_80°C至少保存I年。
本發(fā)明基于免疫組學(xué)的研究成果，首次報道了 Rv3120特異性抗原可以應(yīng)用于結(jié)核病診斷，且是一個活性較強的T細(xì)胞靶抗原，用于結(jié)核病細(xì)胞免疫學(xué)診斷，具有較高的敏感性高，而且相比皮試試驗，更為快速和安全可靠。


圖I是重組蛋白Rv3120經(jīng)進一步純化及濃縮后的SDS-PAGE圖。I是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2是純化濃縮后的目的蛋白(5yg)，3是純化濃縮后的目的蛋白(2.5yg)。圖2是抗原ESAT6，CFP10, Rv3120及對照組試驗。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用，但不能限制本方面的內(nèi)容。實施例I重組質(zhì)粒pET32a_Rv3120的構(gòu)建(I)靶基因引物設(shè)計
Rv3120-F (SEQ ID No:3) CAAGGTACCATGAGTCCGTCTCCATCGRv3120-R (SEQ ID No:4) CCTAAGCTTCTACAGTGACCGTTGGGC酶切位點分別為Kpn I、Hind III。(2)靶基因的PCR擴增、克隆及序列測定以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模 板，Rv3120_F和Rv3120_R為引物，應(yīng)用Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)，通過PCR直接擴增Rv3120蛋白基因。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5min ；(94°C,30s ；58°C,30s ；72°C,40s)35 個循環(huán)；72°C延伸 5min ;4°C保存。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，后用DNA回收試劑盒(Invitrogen)回收。用Kpn I和Hind III酶切，克隆構(gòu)建入pET32a質(zhì)粒Kpn I和Hind III酶切位點中。測序表明所插入的序列和GeneBank中H37Rv結(jié)核全基因組相應(yīng)基因序列(Rv3120基因NCBI登陸號為NC_000962. 2 ;蛋白號為CAB08377. I)完全一致。實施例2重組蛋白Rv3120的誘導(dǎo)表達及純化將O. 5ul測序正確的重組pET32a-Rv3120質(zhì)粒放入IOOul大腸桿菌BL21 (DE3)PhysS感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)中，冰上放置45min，42°C水浴鍋中，熱擊90s，冰上靜置3min，加入500ul的不含抗生素的預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37°C搖床，220rmp,培養(yǎng)45_60min。取一定量在含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布，室溫干燥后倒置于37°C溫箱中培養(yǎng)過夜。挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液體培養(yǎng)基中，220rmp，37°C培養(yǎng)OD至O. 6左右，加入終濃度為IOmM IPTG，37°C 3h，收集IPTG誘導(dǎo)后的菌體，按IOml Washing BufferI每克濕菌的比例重懸后超聲破碎。結(jié)果目的蛋白含于上清中。IOOOOg離心30min，收集上清。用IMAC親和色譜柱(Bio-Rad)進行親和純化(2CV去離子水沖洗，5CV含5mM咪唑的washing Buffer I平衡，6CV含目的蛋白上清上樣，6CV含5mM咪唑的washing Buffer I沖洗，6CV 含 IOmM 咪唑的 washing Buffer 2 沖洗，IOCV 含 500mM 咪唑的 Elution Buffer 洗脫)，收集過柱純化的目的蛋白(如圖I所示)，用20mM Tris-HCl，pH 8. O的溶液透析，IOkDa超濾管對透析后的目的蛋白液進行濃縮，用BCA法測定純化后目的蛋白的濃度，SDS-PAGE電泳分析目的蛋白純度。本實施例的重組蛋白鎳柱親和純化后，純度可達90%以上，不僅大大降低了其生產(chǎn)成本，而且也具有更高的穩(wěn)定性，該重組蛋白在不凍干的情況下4°C可保存I周，_20°C可保存3個月，_80°C至少保存I年。實施例3重組Rv3120抗原作為檢測試劑對臨床可疑結(jié)核病人檢測。具體步驟是操作步驟I、樣本采集無菌采集人外周靜脈血約5ml至肝素抗凝管中，樣本采集后可于室溫下保存，不要放置在冷藏或冷凍室；并做好標(biāo)記。2、外周血單個核淋巴細(xì)胞的分離、收集及計數(shù)a、取5ml的全血，加入等體積的RTPMI-1640無血清培養(yǎng)液，并混勻。b、取一支15ml離心管加入4ml的淋巴細(xì)胞分離液，并將混勻的血樣緩緩加入到淋巴細(xì)胞分離液的表面，兩者之間的界限要明顯，不要混勻，蓋緊管蓋，輕拿輕放。C、將離心管放入水平離心機，IOOOg,室溫，離心22min，小心取出后可見血液成分分層。
d、用一次性吸管將單個核淋巴細(xì)胞層轉(zhuǎn)移到新的15ml離心管中，并加入IOmlRTPMI-1640無血清培養(yǎng)液進行混勻，放入離心機中600g離心洗滌lOmin，在加入無血清培養(yǎng)液,350g離心IOmin ；e、取出離心管棄上清，加入400 μ I的RPMI_1640含血清培養(yǎng)液，吹打細(xì)胞混勻，吹打時要輕柔，盡量避免細(xì)胞受外力的損傷。f、取120ul于自動計數(shù)儀(Sysmex，XT_2000i)上進行淋巴細(xì)胞計數(shù)。g、調(diào)整細(xì)胞濃度至2. 5 XlOfVml，配制500 μ I ；3、板的活化200μ I/we 11RPMI-1640 含血清培養(yǎng)液，5-lOmin，傾倒。4、按照實驗設(shè)計安排每個檢測樣本需2個孔，加入不同的樣本細(xì)胞100 μ I/well ο陰性對照每孔加入10 μ 1RPMI-1640含血清培養(yǎng)液陽性對照每孔加入10 μ IPHA測試孔a:每孔加入10 μ I結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT6(根據(jù)下文的常規(guī)方法制備)5ug/ml測試孔b:每孔加入10 μ I結(jié)核分枝桿菌特異性抗原CFPlO (根據(jù)下文的常規(guī)方法制備)5ug/ml刺激抗原每孔加入IOul結(jié)核分枝桿菌重組抗原Rv312010ug/ml其中結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT6和CFPlO是現(xiàn)有常用的診斷抗原，ESAT6和CFPlO重組蛋白的常規(guī)制備方法為以結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，用蛋白的特異性引物按常規(guī)基因工程方法構(gòu)建pET2 la-esat6或Pet32a_cf p 10重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3 )PhysS表達菌株，ImMIPTG 37°C誘導(dǎo)3h即可獲得大量的重組蛋白，鎳柱親和純化其純度達90%以上，將重組蛋白用20mM Tris-HCl，pH 8. O透析后超濾濃縮，BCA法檢測蛋白濃度，按Img/管分裝,凍干保存。5、當(dāng)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)16_20hr(17h)；6、在取出培養(yǎng)板之前半個小時，準(zhǔn)備好拍水紙、加樣槽(洗液)、洗瓶、將50X洗液放置室溫下平衡一會，配制IXWashing buffer,根據(jù)實驗方案而定。7、洗板傾倒孔內(nèi)液體，200 μ I/well的IXWashing buffer,洗漆5次，每次30sec，拍干，要用力拍，拍干凈；PBS洗液；8、加已經(jīng)稀釋好的酶標(biāo)抗體，50 μ l/well，4°C溫箱，孵育Ihr ;—步法反應(yīng)。9、洗板傾倒孔內(nèi)液體，200 μ I/well的IXWashing buffer,洗漆5次，每次30sec，拍干，要用力拍，拍干凈；10、顯色加入配好的顯色液，100 μ 1/well,室溫避光保存7min ；
11、待斑點生長到適合的大小后，以去離子水洗滌2遍，終止顯色過程。拍干之后取下保護層，自然晾干。勿將板放置烤箱內(nèi)，防止膜發(fā)脆破裂；也可直接用自來水直接沖洗，但不能將孔直接對著水流，而應(yīng)將板子豎著用水沖洗，水流要和緩，并可將板條取下，輕輕沖洗底面后甩干，放置待自然晾干。12、ELISP0T板斑點計數(shù),并記錄斑點的各種參數(shù)，做統(tǒng)計分析(如圖2所示)。
結(jié)果判斷當(dāng)測試孔A或B達到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽性結(jié)果(I)如果陰性對照孔斑點數(shù)為0-5，用測試孔A或B的斑點數(shù)減去陰性對照孔斑點數(shù)彡6 ；(2)如果陰性對照孔斑點數(shù)彡6，測試孔A或B的斑點數(shù)必須大于2倍的陰性對照孔斑點數(shù)。結(jié)果解釋陽性結(jié)果提示檢測樣本中含有針對結(jié)核分枝桿菌特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞；陰性結(jié)果提示檢測樣本中不含有針對結(jié)核分枝桿菌特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。表2是是重組蛋白Rv3120與現(xiàn)有的ESAT6，CFPlO分別刺激臨床標(biāo)本產(chǎn)生致敏T淋巴細(xì)胞實驗結(jié)
果O表IELISPOT試驗設(shè)計
權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌RV3120重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通過使用pET32a質(zhì)粒,在Rv3120該天然蛋白序列前面加了一段Trx · Taq和S · Taq融合標(biāo)簽及His · Tag純化標(biāo)簽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的Rv3120重組蛋白，其特征在于，所述Trx· Taq和S · Taq融合標(biāo)簽及His · Tag純化標(biāo)簽的氨基酸序列由SEQ ID NO: I中從氨基末端第I至第153位氨基酸殘基序列組成。
3.一種編碼權(quán)利要求I或2的Rv3120重組蛋白的核苷酸序列，其特征在于具有選自下列C)、d)或e)的核苷酸序列c)SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； d)不同于SEQID NO: 2但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO: 2所編碼的氨基酸序列相同的核苷酸序列； e)在嚴(yán)格雜交條件下與上述c)或d)中的序列雜交，并且編碼具有所述Rv3120重組蛋白活性的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)制備結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA； (2)擴增Rv3120基因； (3)Rv3120基因插入表達質(zhì)粒； (4)將構(gòu)建的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞； (5)誘導(dǎo)表達蛋白Rv3120； (6)分離純化誘導(dǎo)表達產(chǎn)物，得到Rv3120重組蛋白， 其中，在制備結(jié)核分枝桿菌Rv3120基因中采用的引物為Rv3120-F和Rv3120_R，所述引物Rv3120-F的核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示，所述引物Rv3120_R的核苷酸序列如SEQID No:4 所示。
5.權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核分枝桿菌Rv3120蛋白在制備檢測或診斷結(jié)核病的試劑中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Rv3120重組蛋白的基因引物為Rv3120-F和Rv3120-R，所述Rv3120-F的核苷酸序列為如SEQ ID No: 3所示，所述Rv3120-R的核苷酸序列為如SEQ ID No:4所示。
7.權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白、其特異性抗體或其基因引物在制備結(jié)核病檢測試劑盒中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述Rv3120重組蛋白的基因引物為Rv3120-F和Rv3120-R，所述Rv3120_F的核苷酸序列為如SEQ ID No: 3所示，所述Rv3120_R的核苷酸序列為如SEQ ID No:4所示。
9.一種結(jié)核病檢測試劑盒，其特征在于，其組分中的檢測抗原是權(quán)利要求I或2所述的結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種結(jié)核分枝桿菌特異性標(biāo)志物Rv3120的重組蛋白，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供所述結(jié)核分枝桿菌Rv3120重組蛋白的編碼核苷酸序列、所述重組蛋白的制備方法及其用途。本發(fā)明基于免疫組學(xué)的研究成果，首次報道了一種結(jié)核分枝桿菌免疫優(yōu)勢抗原Rv3120。用于結(jié)核病細(xì)胞免疫學(xué)診斷，具有較高的敏感性高，而且與傳統(tǒng)皮試試驗相比，具有更為快速和安全可靠的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK102718848SQ20121017966
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月1日
發(fā)明者余曉麗, 孫戰(zhàn)強, 張舒林, 王洪海, 趙俊偉 申請人:上海交通大學(xué)