結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白及其制備和應(yīng)用，具體涉及應(yīng)用基因 工程技術(shù)制備的三種結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白LTBIPrl、LTBIPr2及LTBIPr3及其制 備方法，屬于醫(yī)學(xué)免疫學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病是全世界范圍內(nèi)危害人類健康的主要傳染病之一。艾滋病流行、結(jié)核感染 者移民和部分人群生活貧困等原因使美國(guó)等歐美發(fā)達(dá)國(guó)家結(jié)核病發(fā)病率呈回升趨勢(shì)，尤其 是結(jié)核菌耐藥問(wèn)題、與人免疫缺陷病毒（HIV)合并感染使結(jié)核病治療更是雪上加霜。目前 全世界有結(jié)核病人約2000萬(wàn)，每年新增結(jié)核病人800~1000萬(wàn)，每年死亡人數(shù)約200萬(wàn)。
[0003] 我國(guó)的結(jié)核病疫情和結(jié)核菌感染情況都相當(dāng)嚴(yán)重，是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó) 家之一，結(jié)核病人數(shù)位居世界第二，僅次于印度。2000年第四次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣 調(diào)查初步結(jié)果表明，我國(guó)結(jié)核感染率為44. 5%，高于世界1/3的感染率，意味著我國(guó)約有5. 5 億人感染了結(jié)核菌。2010年第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查初步結(jié)果表明，15歲及以 上人群活動(dòng)性肺結(jié)核的患病率為459/10萬(wàn)，涂陽(yáng)的肺結(jié)核患病率為66/10萬(wàn)。結(jié)核病死亡 人數(shù)在傳染病中居第一位。結(jié)核病也是AIDS感染者死亡的主要原因，根據(jù)1996年WHO統(tǒng) 計(jì)每3個(gè)死亡的AIDS患者中就有1例死于合并結(jié)核，45-85%HIV死亡者是由于結(jié)核病診斷 延誤所致。面對(duì)這種嚴(yán)峻的形勢(shì)，結(jié)核病的預(yù)防和控制已引起國(guó)內(nèi)外政府及學(xué)者的高度重 視。
[0004] 結(jié)核潛伏感染（Latent tuberculosis infection, LTBI)指宿主感染結(jié)核分枝桿 菌后尚未發(fā)病，以結(jié)核菌素試驗(yàn)陽(yáng)性而無(wú)活動(dòng)性結(jié)核的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)改變?yōu)樘卣?。?伏感染者中未經(jīng)治療約有5%-10%會(huì)發(fā)展成活動(dòng)性結(jié)核，若同時(shí)伴有HIV感染，這種概率則 高達(dá)10%，結(jié)核潛伏感染者成為結(jié)核患者的重要來(lái)源。有調(diào)查顯示：85%-90%新診斷的活動(dòng) 性肺結(jié)核由LTBI演變而來(lái)。更為嚴(yán)峻的問(wèn)題，結(jié)核潛伏感染人群中存在一部分高危人群， 其體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌處于增殖狀態(tài)，但尚未出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，這類人群是進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核 的高風(fēng)險(xiǎn)人群，如果對(duì)這類人群給予監(jiān)管和預(yù)防性干預(yù)治療，將會(huì)降低結(jié)核的發(fā)病率。早期 篩查、診斷和治療結(jié)核潛伏感染是結(jié)核病防治的最有效手段之一。但是，目前對(duì)于潛伏性感 染的診斷仍缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和方法，因此，潛伏性感染早期診斷技術(shù)的突破成為當(dāng)前結(jié)核 控制中面臨的重要挑戰(zhàn)。
[0005] 目前國(guó)內(nèi)外診斷潛伏感染的方法主要包括結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)（tuberculin skin test，TST)及 Y 干擾素釋放試驗(yàn)（interferon gamma release assays，IGRA)。TST 及 IGRA 都是通過(guò)檢測(cè)機(jī)體主要的抗結(jié)核免疫即細(xì)胞免疫應(yīng)答來(lái)評(píng)價(jià)結(jié)核感染情況。下面就這兩種 試驗(yàn)方法進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。
[0006] 國(guó)內(nèi)現(xiàn)多將TST作為主要檢測(cè)手段，一般將純蛋白衍化物（PPD)強(qiáng)陽(yáng)性或短期內(nèi) 從陰性轉(zhuǎn)為陽(yáng)性而無(wú)臨床結(jié)核病證據(jù)者判斷為結(jié)核菌潛伏感染者。pro其作用于人體會(huì)激 發(fā)已致敏機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，激活τ淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，釋放大量細(xì)胞因 子，并使這些細(xì)胞增殖、聚集，包裹抗原形成結(jié)節(jié)，這就是遲發(fā)型變態(tài)（DTH)反應(yīng)，其反應(yīng)強(qiáng) 度與細(xì)胞免疫呈平行關(guān)系。Pro皮膚試驗(yàn)已成為目前臨床上最常用且最簡(jiǎn)便的一種結(jié)核 菌感染診斷方法，反應(yīng)越強(qiáng)，表示結(jié)核感染可能性越大，中國(guó)一直使用硬結(jié)> 5mm為陽(yáng)性， 彡20mm或有水泡、壞死、淋巴結(jié)炎等為強(qiáng)陽(yáng)性，3歲以下兒童彡15mm為強(qiáng)陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)。TST 特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，但PH)是從結(jié)核分枝桿菌中粗提的抗原混合物，包含200多種 蛋白，其中很多是非結(jié)核分枝桿菌及卡介菌的共同抗原成分，因此決定了 TST檢測(cè)特異性 差，在BCG接種人群和非結(jié)核分枝桿菌感染人群中易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。TST只能根據(jù)皮膚 的反應(yīng)強(qiáng)弱輔助診斷，其靈敏度只有70-80%。另外TST存在檢測(cè)費(fèi)時(shí)、需要受試者回訪 (72h)、皮試操作和結(jié)果解釋存在主觀依賴性等缺點(diǎn)。
[0007] 近年來(lái)，IGRA作為一種新型檢測(cè)手段用于結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)。IGRA是采用酶 聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)或酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISP0T)方法定量檢出受檢者全血或外周 血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原（ESAT6、CFPlO及TB7. 7)的IFN- γ檢測(cè)釋放反 應(yīng)，用于結(jié)核菌潛伏感染的診斷。2007年10月，應(yīng)用ESAT-6、CFP-10和TB7. 7作為特異性 抗原并經(jīng)過(guò)不斷改良的QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT-GIT)技術(shù)，成為FDA批準(zhǔn)使 用的檢測(cè)結(jié)核感染方法。2008年7月，由英國(guó)牛津免疫技術(shù)公司研發(fā)，利用ESAT6多肽和 CFPlO多肽分別刺激外周血中T淋巴細(xì)胞，然后檢測(cè)分泌IFN-γ的外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)目 的T SPOT-TB試驗(yàn)盒被FDA正式批準(zhǔn)。這兩種技術(shù)中所應(yīng)用的抗原ESAT6、CFP10及TB7. 7 選自結(jié)核分枝桿菌基因組差異區(qū)，其在BCG和大部分環(huán)境分枝桿菌中都表達(dá)缺失，可以避 免與這些菌種的交叉反應(yīng)，彌補(bǔ)了 TST的不足，提高了結(jié)核分枝桿菌感染檢測(cè)的特異性。但 是IGRA不能鑒別活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏結(jié)核感染。
[0008] 如前所述，目前國(guó)內(nèi)外診斷潛伏感染的方法包括TST及IGRA檢測(cè)方法。TST價(jià)格 低廉，國(guó)內(nèi)現(xiàn)多以其為主要檢測(cè)手段，但TST受到卡介苗和受試者免疫狀態(tài)的影響，容易出 現(xiàn)假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果，尤其我國(guó)新生兒卡介苗接種列為兒童計(jì)劃免疫項(xiàng)目，TST診斷潛伏 感染效率很低。IGRA難以區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏結(jié)核感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是為克服已有技術(shù)的不足，提供三種新型結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相 關(guān)蛋白LTBIPrl、LTBIPr2和LTBIPr3及其制備方法，作為結(jié)核病細(xì)胞免疫刺激劑，用于檢測(cè) 外周血中分泌結(jié)核特異性IFN-γ的T淋巴細(xì)胞，可提高結(jié)核潛伏感染檢測(cè)的靈敏度和特異 性，輔助結(jié)核病的診斷和鑒別診斷。
[0010] 一種結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白LTBIPrl，由結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原的關(guān)鍵 表位構(gòu)成；LTBIPrl蛋白抗原表位的核苷酸序列（DNA序列）如序列表中序列1所示。
[0011] 另一種結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白LTBIPr2,由結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原的關(guān) 鍵表位構(gòu)成；LTBIPr2蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
[0012] 第三種結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白LTBIPrf，由結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原的關(guān) 鍵表位構(gòu)成；LTBIPr3蛋白抗原表位的核苷酸序列如序列表中序列3所示。
[0013] LTBIPrl編碼磷酸果糖激酶（phosphofructokinase pfkB)，是結(jié)核分枝桿菌缺氧 相關(guān)的潛伏期抗原。發(fā)明人的研究顯示該蛋白抗原刺激潛伏感染人群PBMC后釋放IFN- γ 的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)顯著高于活動(dòng)性結(jié)核病人群。應(yīng)用LTBIPrlDNA疫苗免疫BALB/c小鼠，在 小鼠中可以誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫及Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答。
[0014] LTBIPr2 可能編碼 PhiRv2 噬菌體蛋白整合酶（PhiRv2prophage integrase)，位于 BCG缺失區(qū)RD11，是營(yíng)養(yǎng)缺乏相關(guān)的潛伏期抗原。發(fā)明人的研究顯示該蛋白抗原刺激結(jié)核 潛伏感染者外周血PBMC后產(chǎn)生IFN- γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)顯著高于活動(dòng)性結(jié)核患者。
[0015] LTBIPrf編碼一種假想蛋白，是結(jié)核分枝桿菌缺氧相關(guān)的潛伏期抗原。發(fā)明人的研 究顯示該蛋白抗原刺激潛伏感染人群外周血PBMC后分泌IFN- γ的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)顯著高于 肺結(jié)核人群。
[0016] 將上述的LTBIPrl、LTBIPr2及LTBIPr3三種結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白的抗 原表位分別克隆、表達(dá)、純化，在結(jié)核潛伏感染診斷及潛伏感染疫苗研究方面具有很大的潛 在價(jià)值。
[0017] 本發(fā)明提出的三種結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白LTBIPrl、LTBIPr2及 LTBIPr3,是選擇其關(guān)鍵的抗原表位，分別通過(guò)基因工程技術(shù)將其克隆、表達(dá)、純化。
[0018] 本發(fā)明提出上述三種重組蛋白LTBIPrl、LTBIPr2及LTBIPr3的制備及構(gòu)建方法。
[0019] 一種結(jié)核分枝桿菌潛伏感染相關(guān)蛋白LTBIPrl的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
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