阿魏酸鈉對(duì)cxcl1基因的調(diào)控在防治動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了阿魏酸鈉及其調(diào)控CXCL1基因的表達(dá)在防治動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制中的應(yīng)用，涉及阿魏酸鈉對(duì)氧化低密度脂蛋白損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株保護(hù)作用，并探討作用機(jī)制。采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過MTT、劃痕試驗(yàn)、流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡法測(cè)定阿魏酸鈉對(duì)氧化低密度脂蛋白處理的HUVEC增殖、遷移及凋亡的影響，并提取細(xì)胞總RNA，用博奧生物全基因芯片進(jìn)行標(biāo)記雜交實(shí)驗(yàn)，對(duì)差異表達(dá)基因通過聚類分析、GO功能和富集度及pathway關(guān)聯(lián)度等的分析，篩選出差異因，得到基因表達(dá)譜，采用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)表達(dá)的差異基因在HUVEC中的轉(zhuǎn)錄和翻譯情況進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)阿魏酸鈉能下調(diào)CXCL1基因表達(dá)，對(duì)Ox-LDL損傷的HUVEC具有明顯的保護(hù)作用。
【專利說明】阿魏酸鈉對(duì)CXCL1基因的調(diào)控在防治動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種中藥阿魏酸鈉對(duì)CXCLl基因的調(diào)控在防 治動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 動(dòng)脈粥樣硬化的流行在100多年來呈越演越烈之勢(shì)，在世界范圍內(nèi)，動(dòng)脈粥樣硬 化血栓形成導(dǎo)致的死亡人數(shù)占全部死亡人數(shù)的52%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了第二位死因的腫瘤（24% )，成為名副其實(shí)的死亡第一殺手。動(dòng)脈粥樣硬化是一種全身性疾病，可導(dǎo)致全身主要器官， 如心、腦、腎乃至肢體等功能障礙而嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，還給家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來沉重 負(fù)擔(dān)。因此，尋找高效、低毒藥物預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化顯得十分必要。
[0003] 動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明，曾有多種學(xué)說從不同角 度來闡述，諸如脂肪浸潤學(xué)說、血栓形成和血小板聚集學(xué)說、損傷反應(yīng)學(xué)說和克隆學(xué)說等， 但目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化為動(dòng)脈壁的細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、血液成分（尤其是單核 細(xì)胞、血小板和LDL)、局部血液動(dòng)力學(xué)、環(huán)境和遺傳等因素間一系列復(fù)雜作用的結(jié)果，因而 不可能是單一的病因。盡管血栓形成、脂質(zhì)浸潤等假說曾在一定時(shí)間內(nèi)成為動(dòng)脈粥樣硬化 的"病因"，但它們都各自強(qiáng)調(diào)病因的某一側(cè)面。隨著對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病理生理過程的認(rèn)識(shí) 的不斷深入，AS發(fā)生的細(xì)胞及其分子機(jī)制日益受到人們重視。近年來，損傷反應(yīng)學(xué)說開始 為人們所公認(rèn)，亦即動(dòng)脈粥樣硬化病變始于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
[0004] 血管內(nèi)皮細(xì)胞（vascularendothelialcell,VEC)是介于血液與血管壁組織之間 的半通透性天然屏障，它在機(jī)體的自我調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。VEC在正常生理狀態(tài)下能分 泌多種血管活性物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)血管張力、血小板功能、凝血功能及纖溶活性，也參與血管 壁的修復(fù)和重塑等等。VEC是最易受到損傷的靶細(xì)胞，其損傷會(huì)引起內(nèi)皮功能出現(xiàn)障礙，與 動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因而如何保護(hù)血管內(nèi)皮功能不 受損傷成為近年來心腦血管疾病防治的研究熱點(diǎn)。研究表明受損的VEC易于導(dǎo)致血管的損 傷，繼而啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。目前多數(shù)認(rèn)為，受損的VEC會(huì)發(fā)生一種慢性的炎癥性增 生反應(yīng)，是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的基礎(chǔ)，在AS形成中扮演著起始機(jī)制，而且影響AS的進(jìn)程。
[0005] 阿魏酸鈉（SodiumFerulate，SF)是阿魏酸（4-輕基-3-甲氧基肉桂酸）的鈉鹽， 阿魏酸（FerulicAcid,FA)不僅是傳統(tǒng)活血化瘀中藥當(dāng)歸、川彎等的主要成分，而且也存在 于常見的水果和蔬菜如西紅柿、玉米當(dāng)中。許多體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究表明，SF和FA的藥理 作用廣泛，具有抗脂質(zhì)過氧化和自由基清除的作用，具有抗細(xì)胞凋亡，拮抗再灌注損傷、抗 血小板聚集、抗血栓形成和抗過敏等作用，對(duì)腎臟、肝臟、心血管和免疫系統(tǒng)均有保護(hù)作用。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SF可以明顯減少高膽固醇誘導(dǎo)的高脂血癥家兔動(dòng)脈粥樣斑塊的面積。 近年研究還發(fā)現(xiàn)SF能抑制低密度脂蛋白的氧化，抑制氧化低密度脂蛋白所致的平滑肌細(xì) 胞的增殖，能拮抗ET的作用調(diào)節(jié)ET和NO的生成，進(jìn)一步表明SF對(duì)于預(yù)防和延緩動(dòng)脈粥樣 硬化的發(fā)生發(fā)展，治療心腦血管疾病具有重要意義。
[0006] 但是，阿魏酸鈉對(duì)Ox-LDL(人源氧化低密度脂蛋白）損傷VEC拮抗作用的分子機(jī) 制又是如何？特別是在這個(gè)過程中是通過什么基因來調(diào)控的？這些在以往的研究當(dāng)中并 未見報(bào)道。以往的研究結(jié)果和傳統(tǒng)的分子生物學(xué)研究方法，只能對(duì)一個(gè)或幾個(gè)基因的表達(dá) 變化情況進(jìn)行研究，無法闡明AS形成過程中多個(gè)基因的復(fù)雜作用機(jī)制及其相互作用和調(diào) 控關(guān)系。近年來發(fā)展起來的高通量的基因表達(dá)分析平臺(tái)--基因芯片技術(shù)則可以滿足此 要求，為全面了解基因譜變化提供了技術(shù)保證。
[0007] 炎癥趨化因子（chemokines)CXCLl是具有吸引白細(xì)胞移行到感染部位的一種低 分子量（多為8-10KD)的蛋白質(zhì)，在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。趨化因子基因上調(diào)后，與靶 細(xì)胞表面其的受體結(jié)合后激活，募集淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受損部位，增強(qiáng)單核細(xì)胞 與內(nèi)皮細(xì)胞之間的粘附，刺激單核細(xì)胞的聚集和活化，促進(jìn)單核細(xì)胞通過內(nèi)皮細(xì)胞屏障，并 最終形成泡沫細(xì)胞，從而參與了動(dòng)脈粥樣硬化的形成。對(duì)CXCLl的研究，過去多集中在對(duì)腫 瘤方面的影響，對(duì)其在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用研究較少。
[0008] 傳統(tǒng)的研究方法側(cè)重于SF調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)、調(diào)節(jié)代謝和改善血液流變學(xué)、抗 LDL氧化等方面在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用，未能對(duì)基因的表達(dá)變化情況進(jìn)行研究。那么我們 應(yīng)用人類全基因組芯片對(duì)Ox-LDL致HUVEC的損傷過程中基因發(fā)生的變化，特別是與SF拮 抗后基因表達(dá)譜的變化進(jìn)行檢測(cè)，從而尋找動(dòng)脈粥樣硬化形成中的關(guān)鍵性調(diào)控基因。對(duì)篩 選AS的分子生物學(xué)標(biāo)志物，預(yù)防和治療AS，開發(fā)新的心血管疾病治療藥物等具有重要的理 論意義和實(shí)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種中藥的有效成分阿魏酸在制備治療或預(yù) 防動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的作用機(jī)制，及調(diào)控CXCLl基因的表達(dá)在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣 硬化藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明是應(yīng)用基因芯片技術(shù)，通過Ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC-CRL1730)的體外試驗(yàn)來探討Ox-LDL致AS的形成中基因表達(dá)的影響，以及應(yīng)用阿魏酸鈉保 護(hù)后基因表達(dá)的改變，從而發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵性調(diào)控基因CXCLl。從基因表達(dá)及調(diào)控水平，進(jìn)一步 揭示Ox-LDL致AS以及SF對(duì)AS保護(hù)作用的分子機(jī)制，為早期預(yù)防和治療AS提供新的科學(xué) 依據(jù)和研究思路，有利于發(fā)揮傳統(tǒng)中藥優(yōu)勢(shì)在防治AS中的作用。本發(fā)明的具體
【發(fā)明內(nèi)容】
如 下： A.阿魏酸（購買于美國Sigma公司），是傳統(tǒng)活血化瘀中藥當(dāng)歸、川芎等的主要成 分，而且也存在于常見的水果和蔬菜如西紅柿、玉米當(dāng)中，無毒副作用。
[0011] B.阿魏酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作用：對(duì)數(shù)生長期的內(nèi)皮細(xì)胞，以2XIO5Ail的密 度接種于96孔板中培養(yǎng)24h后，細(xì)胞已長成良好單層，更換成無血清培養(yǎng)基，將2. 5、5、10、 20、40、80、160、320和640umol/L濃度SF分別加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100iil，每 個(gè)濃度重復(fù)8孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，以3- (4, 5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍(lán)，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，倒置相差 顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。
[0012] C.阿魏酸對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作用：收集對(duì)數(shù)生長期的內(nèi)皮細(xì)胞， 以2XIOVml的密度每孔100ill接種于96孔板中置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后， 細(xì)胞已長成良好單層。按①對(duì)照組：當(dāng)細(xì)胞生長到609T70%滿時(shí)換無血清DMEM培養(yǎng)液； ②Ox-LDL組：當(dāng)細(xì)胞生長到609T70%滿時(shí)換含有濃度50mg/L的Ox-LDL的無血清DMEM培 養(yǎng)液；③SF低濃度組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70%滿時(shí)換含有濃度5umol/L的SF的無血清DMEM 培養(yǎng)液；孵育Ih后加入Ox-LDL使終濃度達(dá)到50mg/L，繼續(xù)孵育24h后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。④ SF中濃度組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70%滿時(shí)換含有濃度lOumol/L的SF的無血清DMEM培養(yǎng)液， 余下同SF低濃度組；⑤SF高濃度組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70%滿時(shí)換含有濃度20umol/L的SF 的無血清DMEM培養(yǎng)液，余下同SF低濃度組，進(jìn)行分組，分別培養(yǎng)6h、12h、24h、48h。分別在 達(dá)到各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)前4h每孔加入20ill的MTT(5mg/ml)37°C繼續(xù)培養(yǎng)；4h后取出并小心 吸去上清，每孔加入100 DMS0,在水平搖床上緩慢振蕩lOmin，以溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶 物。在酶標(biāo)儀上490nm處測(cè)定其光吸收值（0D值)，以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸，繪制出細(xì)胞 生長曲線。每次設(shè)三個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0013] D.阿魏酸對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的作用：取對(duì)數(shù)生長 期細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化后制成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行如下分組：①對(duì)照組：當(dāng)細(xì)胞生長至 609T70%滿時(shí)換無血清DMEM培養(yǎng)液；②Ox-LDL損傷組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70%滿時(shí)換含有濃 度50mg/L的Ox-LDL的無血清DMEM培養(yǎng)液；③SF保護(hù)組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70%滿時(shí)換含有 濃度20umol/L的SF的無血清DMEM培養(yǎng)液；孵育Ih后加入Ox-LDL使終濃度達(dá)到50mg/L。 以上各組繼續(xù)孵育24h后進(jìn)行總RNA的提取。利用基因芯片22KHumanGenomeArray( 來源于博奧生物有限公司（CapitalBio))進(jìn)行標(biāo)記雜交實(shí)驗(yàn)，MAS(MoleculeAnnotation System)法對(duì)基因芯片的掃描結(jié)果進(jìn)行差異基因分析，篩選出差異基因。
[0014] E.阿魏酸對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CXCLl基因表達(dá)的作用：取對(duì)數(shù)生 長期細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化后制成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行如下分組：①對(duì)照組：當(dāng)細(xì)胞生長至 609T70%滿時(shí)換無血清DMEM培養(yǎng)液；②Ox-LDL損傷組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70%滿時(shí)換含有濃 度50mg/L的Ox-LDL的無血清DMEM培養(yǎng)液；③SF保護(hù)組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70%滿時(shí)換含有 濃度20umol/L的SF的無血清DMEM培養(yǎng)液；孵育Ih后加入Ox-LDL使終濃度達(dá)到50mg/L。 以上各組繼續(xù)孵育24h后進(jìn)行總RNA的提取。用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)基因芯片篩選出的差 異基因CXCLl的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
[0015] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果： 1.阿魏酸（FerulicAcid,FA)不僅是傳統(tǒng)活血化瘀中藥當(dāng)歸、川彎等的主要成分，而且 也存在于常見的水果和蔬菜如西紅柿、玉米當(dāng)中，無任何毒副作用。
[0016] 2.本發(fā)明表明，一定濃度的SF對(duì)HUVEC有促進(jìn)增殖的作用，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。 濃度在20剛以下時(shí)存在劑量反應(yīng)關(guān)系，40剛時(shí)增殖效果最好，濃度超過320剛時(shí)SF對(duì)細(xì)胞 有毒性作用。因此，SF濃度為40MM以下應(yīng)作為拮抗細(xì)胞損傷的最佳濃度范圍。
[0017] 3.本發(fā)明表明，SF能夠抑制Ox-LDL引起的HUVEC存活率降低，對(duì)HUVEC損傷具 有拮抗作用，從而順利構(gòu)建體外HUVEC損傷和保護(hù)模型 4、本發(fā)明表明，SF主要保護(hù)了ox-LDL對(duì)能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移，使凋亡減少，在 保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞完整性的同時(shí)加速其損傷后的內(nèi)皮化，恢復(fù)損傷內(nèi)皮的結(jié)構(gòu)和功能。
[0018] 5、本發(fā)明表明，SF降低OX-LDL導(dǎo)致關(guān)鍵CXCLl基因的高表達(dá)，減少了炎癥反應(yīng)在 動(dòng)脈粥樣硬化中促進(jìn)作用，從而發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1.表示不同劑量SF對(duì)HUVEC存活率的比較； 圖2.表示SF對(duì)Ox-LDL致HUVEC形態(tài)學(xué)的影響，不同因素處理24h后用倒置顯微鏡觀 察的結(jié)果； 圖3.表示不同濃度SF對(duì)Ox-LDL致HUVEC增殖影響； 圖4.表示CXCLl基因的表達(dá)； 圖5.表示CXCLl基因?qū)崟r(shí)定量RT-PCR結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面用SF進(jìn)行關(guān)于對(duì)OX-LDL處理的HUVEC保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究及機(jī)制進(jìn)行探 討，說明其在制藥領(lǐng)域的新用途。
[0021] 實(shí)施例1 :一定濃度的SF對(duì)HUVEC有促進(jìn)增殖的作用 1實(shí)驗(yàn)材料 1. 1實(shí)驗(yàn)藥物 SF:購于美國Sigma公司。
[0022] 1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象 HUVEC:人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)株CRL-1730購自ATCC公司。
[0023] 1. 3 試劑 3-(4,5_二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍(lán)，MTT)購自美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO)購自美國Sigma公司；氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)購自北京協(xié) 和三友科技開發(fā)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有 限公司；胰蛋白酶購自Sigma，USA。
[0024] 1.4 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國SHEL-LAB公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1F型）購蘇州安泰空 氣技術(shù)有限公司；倒置相差顯微鏡購自O(shè)lympus,Japan;突光酶標(biāo)儀Bio-Rad,USA。
[0025] 2實(shí)驗(yàn)方法： 2. IHUVEC細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存的HUVEC解凍復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基， 在37°C、5%的CO2體積分?jǐn)?shù)的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。經(jīng)2-3天細(xì)胞生長成單層融合狀態(tài) 后，用0. 25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。試驗(yàn)所用的細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。
[0026] 2.2分組及給藥方法 收集對(duì)數(shù)生長期的內(nèi)皮細(xì)胞，以2XIO5Ail的密度接種于96孔板中培養(yǎng)24h后，細(xì)胞已 長成良好單層，更換成無血清培養(yǎng)基，將2.5、5、10、20、40、80、160、320和640 11111〇1/1濃度 SF分別加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100iU，每個(gè)濃度重復(fù)8孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，置 于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞改變情況并記錄。
[0027] 2. 3MTT法 將培養(yǎng)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的細(xì)胞處理結(jié)束后，吸出細(xì)胞孔中的殘余液體，用預(yù)熱至37°C的PBS溶液漂洗2次，每孔加入20ill的MTT(5mg/ml) 37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h;小心吸去上清 后，每孔加入IOOylDMSO,在水平搖床上緩慢振蕩lOmin，以溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物。在 酶標(biāo)儀上490nm處測(cè)定其光吸收值，測(cè)定出的OD值計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的生長率。
[0028] 生長率（%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）X100%。
[0029] 2. 4觀測(cè)的指標(biāo) (1) 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變； (2) MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。
[0030] 2. 5數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以X±s表示，多組均數(shù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，各組間的比較采用Tukey法。
[0031] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 倒置相差顯微鏡觀察顯示，正常的HUVEC細(xì)胞排列緊密、邊界清楚、呈鵝卵石樣鋪開排 列的單層細(xì)胞，傳代后的細(xì)胞體積增大，胞漿豐富，可見雙核及核分裂細(xì)胞，說明細(xì)胞生長 旺盛。
[0032] 如圖1所示（與對(duì)照組相比，<ft ，一定濃度的SF對(duì)HUVEC有促進(jìn)增殖的作 用。濃度在20剛以下時(shí)存在劑量反應(yīng)關(guān)系，40剛時(shí)增殖效果最好，濃度超過320剛時(shí)SF對(duì) 細(xì)胞有毒性作用。因此，SF濃度為40剛以下應(yīng)作為拮抗細(xì)胞損傷的最佳濃度范圍。
[0033] 實(shí)施例2 :SF對(duì)Ox-LDL致內(nèi)皮細(xì)胞增殖的拮抗作用 1實(shí)驗(yàn)材料 1. 1實(shí)驗(yàn)藥物 SF:購于美國Sigma公司。
[0034] 1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象 HUVEC:同實(shí)施例1。
[0035] 1. 3 試劑 3-(4,5_二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（噻唑藍(lán)，MTT)購自美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO)購自美國Sigma公司；氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)購自北京協(xié) 和三友科技開發(fā)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有 限公司；胰蛋白酶購自Sigma，USA。
[0036] 1.4 儀器 同實(shí)施例1。
[0037] 2實(shí)驗(yàn)方法： 2. IHUVEC細(xì)胞的培養(yǎng) 同實(shí)施例1。
[0038] 2.2分組及給藥方法 取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行如下分組：①對(duì)照組：當(dāng) 細(xì)胞生長到609T70%滿時(shí)換無血清DMEM培養(yǎng)液；②Ox-LDL組：當(dāng)細(xì)胞生長到609T70%滿時(shí) 換含有濃度50mg/L的Ox-LDL的無血清DMEM培養(yǎng)液；③SF低濃度組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70% 滿時(shí)換含有濃度5umol/L的SF的無血清DMEM培養(yǎng)液；孵育Ih后加入Ox-LDL使終濃度達(dá) 到50mg/L，繼續(xù)孵育24h后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。④SF中濃度組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70%滿時(shí)換含 有濃度10um〇l/L的SF的無血清DMEM培養(yǎng)液，余下同SF低濃度組；⑤SF高濃度組：當(dāng)細(xì)胞 長至609T70%滿時(shí)換含有濃度20umol/L的SF的無血清DMEM培養(yǎng)液，余下同SF低濃度組。
[0039] 2. 3MTT法 收集對(duì)數(shù)生長期的內(nèi)皮細(xì)胞，以2XIO5Ail的密度每孔100iil接種于96孔板中置于 37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)24h后，細(xì)胞已長成良好單層。按上述2. 2方法進(jìn)行分組， 分別培養(yǎng)6h、12h、24h、48h。分別在達(dá)到各培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)前4h每孔加入20ill的MTT(5mg/ ml) 37°C繼續(xù)培養(yǎng)；4h后取出小心吸去上清，每孔加入100illDMS0,在水平搖床上緩慢振 蕩lOmin，以溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物。在酶標(biāo)儀上490nm處測(cè)定其光吸收值（0D值)。
[0040] 2.4觀測(cè)的指標(biāo) (1)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變。
[0041] (2)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 2. 5數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)以X±s表示，多組均數(shù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，各組間的比較采用Tukey法。
[0042] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖2所示(不同因素處理24h后用倒置顯微鏡觀察的結(jié)果。200X，a為正常對(duì)照組 細(xì)胞；b為50mg/L的Ox-LDL處理后細(xì)胞；c為SF(10剛)+Ox-LDL(50mg/L)處理后細(xì)胞)，經(jīng) Ox-LDL處理后光鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，細(xì)胞變小、形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙變大；加入SF 保護(hù)后，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的改變明顯好轉(zhuǎn)。
[0043]SF對(duì)Ox-LDL致HUVEC的增殖抑制起到拮抗作用。在同一時(shí)間點(diǎn)不同SF濃度 組與損傷組比較(如圖3示與Ox-LDL組相比均顯示有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (/Yft郵，而且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，其中以中濃度（10剛）及高濃度（20剛）時(shí)差異更加明 顯（/Yft似）。在同一劑量不同時(shí)間點(diǎn)與損傷組比較，SF孵育611、1211、2411、4811對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞 增殖均有促進(jìn)作用，而且存在時(shí)間一反應(yīng)關(guān)系，以24h促進(jìn)作用最為明顯。
[0044] 實(shí)施例3 :SF對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC的基因表達(dá)譜的作用 1實(shí)驗(yàn)材料 I. 1實(shí)驗(yàn)藥物SF:同實(shí)施例1。
[0045] 1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象 HUVEC:同實(shí)施例1。
[0046] 1. 3 試劑 氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)購自北京協(xié)和三友科技開發(fā)有限公司；二甲基亞砜 (DMSO)購自美國Sigma公司；氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)購自北京協(xié)和三友科技開發(fā) 有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白 酶購自Sigma,USATRIZOL試劑購自上海生物工程公司產(chǎn)品；RNAClean-upKit購自麗 公司；基因芯片22KHumanGenomeArray來源于博奧生物有限公司（CapitalBio);晶芯? cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒CapitalBio公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司；乙醇、異 丙醇、正庚烷、正己烷、乙腈均為色譜級(jí)，購自上海國藥集團(tuán)；三氯乙酸、氫氧化鈉、氫氧化 鉀、氯仿均為化學(xué)純，購自上海國藥集團(tuán)。
[0047]I. 4 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國SHEL-LAB公司；超凈工作臺(tái)（YJ-1450型）購自蘇州凈化 設(shè)備公司；倒置相差顯微鏡購自德國LEICA公司。LuxScanIOKA雙通道激光掃描儀，基因 芯片22KHumanGenomeArray購自博奧生物有限公司；（CapitalBio)LuxScan3.0圖像 分析軟件購自博奧生物有限公司；突光顯微鏡購自O(shè)lympus,Japan;UV-2000紫外可見分光 光度計(jì)購自上海UNICON公司。
[0048] 2?實(shí)驗(yàn)方法： 2.IHUVEC細(xì)胞的培養(yǎng) 同實(shí)施例1。
[0049] 2.2分組及給藥方法 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化后制成單細(xì)胞懸液，并進(jìn)行如下分組：①對(duì)照組： 當(dāng)細(xì)胞生長至609T70%滿時(shí)換無血清DMEM培養(yǎng)液；②Ox-LDL損傷組：當(dāng)細(xì)胞長至609T70% 滿時(shí)換含有濃度50mg/L的Ox-LDL的無血清DMEM培養(yǎng)液；③SF保護(hù)組：當(dāng)細(xì)胞長至 609T70%滿時(shí)換含有濃度20umol/L的SF的無血清DMEM培養(yǎng)液；孵育Ih后加入Ox-LDL使 終濃度達(dá)到50mg/L。以上各組繼續(xù)孵育24h后進(jìn)行總RNA的提取。
[0050] 2. 3RNA的提取及檢測(cè) 2. 3. 1 總RNA的提?。═RIZ0L法） 1) 均質(zhì)化：取3ml左右細(xì)胞加入適量的Trizol試劑（Trizol的量一般是每IOcm2的 面積加Iml的Trizol)，用移液器反復(fù)吹打； 2) 均質(zhì)化的樣品在室溫放置10分鐘，然后加入200ill氯仿，振蕩混勻，離心：4°C， 12000rpm，15min;離心后上清液中，加入500ill異丙醇，混勻后室溫靜置15min; 3) 離心：4°C，12000rpm，15min; 4) 倒掉上清液，加入Iml75%乙醇，振蕩混勻； 5) 離心MUSOOrpnuSmin; 6) 倒掉上清液，并在超凈臺(tái)中將乙醇揮發(fā)干凈； 7) 加入 40?60iilDEPCH20,65°C5min使之溶解； 8) -20°C冷凍保存； 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的產(chǎn)量，在260nm處的吸光度，I0D=40l^g/ml; 9) 1.2% (mg/ml)瓊脂糖電泳。
[0051] 2. 3. 2RNA的純化（QIAGENRNeasyTotalRNAIsolationkit) 具體方法按QIAGEN公司隨試劑盒提供的操作手冊(cè)進(jìn)行； 樣品RNA的熒光標(biāo)記(使用晶芯?cRNA擴(kuò)增標(biāo)記試劑盒） 按試劑盒說明書操作后在反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，以RandomPrimer為引物進(jìn)行KLENOW酶標(biāo) 記。在互補(bǔ)DNA鏈的延伸過程中摻入熒光素Cy5-dCTP、Cy3-dCTP(GEHealthcareCat-No.PA55021/PA53021) 進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后的產(chǎn)物用PCRNucleoSpinExtractIIKit純 化并抽干。
[0052] 2. 4. 1芯片雜交與清洗 用80W配制好雜交液(含3XSSC，0. 2%SDS，5XDenhart's，25%甲酰胺）溶解標(biāo)記 好的DNA，并在42°C下進(jìn)行雜交過夜。雜交結(jié)束后，用42°C左右含0. 2%SDS，2XSSC的液 體進(jìn)行清洗5min，而后在室溫下0. 2XSSC中再清洗5min。玻片甩干后即可掃描。
[0053] 2.4.2芯片掃描 用LuxScanIOKA雙通道的激光掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描。
[0054] 2.4.3芯片圖像采集 (1)采用LuxScan3.0圖像分析軟件采集芯片圖像，并把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)， 用于以下分析處理； ⑵芯片間的校正：根據(jù)cy5和cy3總體信號(hào)反映出的的global mean的不同，對(duì)它們 進(jìn)行片間線性校正，使各張芯片的global mean值相同； (3) 歸一化。用Lowess方法使片內(nèi)數(shù)據(jù)歸一化； (4) 圖像結(jié)果分類。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度和圖像質(zhì)量對(duì)基因表達(dá)情況進(jìn)行分類標(biāo)記。
[0055] 2. 4. 4數(shù)據(jù)整理及分析 數(shù)據(jù)結(jié)果分別clusterf. 0軟件進(jìn)行聚類分析，用晶芯生物分子功能注釋系統(tǒng)V4. 0(MoleculeAnnotationSystem，MAS)進(jìn)行分子功能分析。
[0056] 3?芯片表達(dá)結(jié)果分析 從基因芯片結(jié)果看，由Ox-LDL對(duì)細(xì)胞造成的氧化應(yīng)激導(dǎo)致基因發(fā)生改變，差異基因中 絕大部分為上調(diào)表達(dá)（53/55)，主要包括趨化因子、炎癥因子和前生長因子、集落因子等。與 損傷組對(duì)比，用SF保護(hù)后有42條基因發(fā)生改變，全部下調(diào)。對(duì)照組與保護(hù)組之間的差異表 達(dá)基因較少，全部為下調(diào)，說明SF保護(hù)后基因表達(dá)水平接近于對(duì)照組，起到了較好的保護(hù) 作用（如圖4)。芯片結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，有32條基因呈一致性表達(dá)趨勢(shì)，即在Ox-LDL的氧化應(yīng)激 下這些基因上調(diào)，加入SF保護(hù)因素后表達(dá)下調(diào)，利用MAS分析軟件，對(duì)32條基因分別進(jìn)行 了GoTerm的富集程度進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)：與炎癥反應(yīng)有關(guān)的趨化因子CXCLl的差異比較顯 著。
[0057] 實(shí)施例4 :SF對(duì)ox-LDL處理HUVEC細(xì)胞CXCLl基因表達(dá)的作用 1實(shí)驗(yàn)材料 I. 1實(shí)驗(yàn)藥物SF:同實(shí)施例1。
[0058] 1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象 HUVEC:同實(shí)施例1。
[0059] 1. 3 試劑 氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)購自北京協(xié)和三友科技開發(fā)有限公司；四甲基偶氮唑鹽 (MTT)購自二甲基亞砜（DMSO)購自美國Sigma公司；氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)購自 北京協(xié)和三友科技開發(fā)有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自杭州四季青生物工程 材料有限公司；胰蛋白酶購自Sigma，USATRIZOL試劑購自上海生物工程公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn) 錄試劑盒購自美國Promega公司；乙醇、異丙醇、正庚燒、正己燒、乙腈均為色譜級(jí),購自上 海國藥集團(tuán)；三氯乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氯仿均為化學(xué)純，購自上海國藥集團(tuán)。
[0060] 1.4 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國SHEL-LAB公司；超凈工作臺(tái)（YJ-1450型）購自蘇州 凈化設(shè)備公司；倒置相差顯微鏡購自德國LEICA公司；定量PCR儀（7300SequenCe DetectionSystem)購于美國ABI公司；激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)購自德國Zeiss公司。
[0061] 2實(shí)驗(yàn)方法 2.IHUVEC細(xì)胞的培養(yǎng) 同實(shí)施例1。
[0062] 2.2分組及給藥方法 同實(shí)施例3。
[0063] 2. 3RNA的提取及檢測(cè) 2. 3. 1 總RNA的提?。═RIZ0L法） 同實(shí)施例3。
[0064] 2. 3. 2RNA的純化（QIAGENRNeasyTotalRNAIsolationkit) 同實(shí)施例3。
[0065] 2. 4RNA逆轉(zhuǎn)錄-Oligo(dT)I5 法RNA逆轉(zhuǎn)錄 2. 4.IcDNA第一鏈合成 (1) 從-80°C冰箱中取出RNA，在20?25°C下解凍，然后在0. 2mlPCR管中配制反應(yīng) 溶液； 總RNA2. 5iig Oligo(dT)15 2ul(500ug/ml)dNTPIuI(IOmMeach) DEPCH2OlL5uI總體積18iiI; (2) 將反應(yīng)管置于PCR儀中，65°C預(yù)變性5分鐘，冰浴5min; (3) 變性反應(yīng)結(jié)束后在PCR管中配制cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系 5Xfirst-strandbuffer4. 0uI 0.IMDTT2. 0uI RNaseInhibitor0.5uI(40U/uI) M-MLV(200U/ul)LOul ddH20(DEPC)XuI 總體積20iiI; (4) 將PCR管子置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，25°C保溫10分鐘后，37°C變性I小時(shí)，4°C保 存。加入5ill的I. 5MNaOH終止逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，70°CIOmin;加入Iill10N乙酸中和；加滅 菌水至50iU;4°C低溫保存。
[0066] 2. 4. 2Real-TimePCR反應(yīng) 反應(yīng)體系 Template(cDNA)Iul2XPCRBufferforEvaGreen10uI 20XEvaGreen染料 0? 6iiI Primer(Forward) 0. 6uI(lOuM) Primer(Reverse) 0. 6uI(lOuM) CapTaq酶 0?I(5U/iiI) Nuclease-FreeH2O 總體積20uIRealTimePCR程序 酶激活95°C，5分鐘；擴(kuò)增反應(yīng)? 95°C，15秒；60°C，15秒；72°C，20秒； 76°C，3秒；共40個(gè)循環(huán)。
[0067] 2. 4. 3CXCLl基因引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)如下： ForwardPrimer：AAACCGAAGTCATAGCCACAC ReversePrimer:GCTCAAACACATTAGGCACAA。
[0068] 2.5統(tǒng)計(jì)、作圖方法 (1)通過一系列的參數(shù)設(shè)定分析，得到不同樣本相對(duì)于不同基因的Ct值。
[0069] Ct值，C代表Cycle(循環(huán)），t代表threshold(閾值），Ct值的含義是：每個(gè)反應(yīng) 管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
[0070] (2)研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起 始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因?yàn)楸容^的是轉(zhuǎn)錄水平的差異，所以通過檢測(cè)每個(gè)樣品的管家 基因，將目的基因歸一化。PCR產(chǎn)物的增長形式為2n，如果各種試劑和外部所加條件均理想 化，N就是循環(huán)數(shù)。所以先得到ACt=Ct待測(cè)基因-Ct管家基因，再轉(zhuǎn)換為原始模板濃 度=2_ACt。
[0071] 2.6重復(fù)性檢驗(yàn) 每個(gè)樣品3個(gè)平行樣，計(jì)算同一樣品的3個(gè)平行樣Ct值的變異系數(shù)，分析樣品目標(biāo)基 因定量結(jié)果的批內(nèi)變異系數(shù)。
[0072] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果如圖5所示，其進(jìn)一步驗(yàn)證了基因芯片結(jié)果，證實(shí)阿魏酸鈉能 降低ox-LDL導(dǎo)致的HUVEC細(xì)胞中CXCLl基因的高表達(dá)。
【權(quán)利要求】
1.阿魏酸鈉作為唯一活性成分在生產(chǎn)用于調(diào)控CXCLl基因的表達(dá)來治療或預(yù)防動(dòng)脈 粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/192GK104306365SQ201410334269
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月23日
【發(fā)明者】張東獻(xiàn), 陶俊良, 滿永宏, 李巍, 薛士鵬, 張東意, 畢勇毅 申請(qǐng)人:南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校