一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的myl3基因及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，提供了一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYL3基因cDNA序列的克隆方法，該基因的cDNA序列如SEQIDNO.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。應(yīng)用該基因可以通過(guò)對(duì)其表達(dá)調(diào)控進(jìn)行操作，為實(shí)現(xiàn)培育生長(zhǎng)速度快的綿羊品種奠定基礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYL3基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼 肌生長(zhǎng)的MYL3基因及其在綿羊育種中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 肌球蛋白輕鏈3(MYL3)為肌球蛋白輕鏈家族中的一員，是一種基本性輕鏈，對(duì)肌 球蛋白構(gòu)型的維系起主要作用，主要在骨骼肌快肌中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)該基因在斑馬魚(yú)的骨 骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化為快肌纖維的早期階段表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)在增殖速度較慢的成肌細(xì)胞中高 表達(dá)，因而認(rèn)為該基因可能具有抑制成肌細(xì)胞增殖而促進(jìn)肌細(xì)胞的分化的功能。目前，在綿 羊基因組中可見(jiàn)MYL3基因的預(yù)測(cè)序列，還未見(jiàn)到該基因的確切序列報(bào)道，并且關(guān)于該基因 對(duì)肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制還不清楚。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 基于上述的原因，本發(fā)明提供了一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYL3基因， 其cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly (A)外長(zhǎng)為925bp ;該序列中的開(kāi)放讀碼框編碼 199個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。該基因具有調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)的功能，應(yīng)用 該基因可以通過(guò)對(duì)該基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行操作，為實(shí)現(xiàn)培育生長(zhǎng)速度快的綿羊品種奠定基 礎(chǔ)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0004] 本發(fā)明所提供的調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYL3基因，其CDNA序列如SEQ ID NO. 1所示，除poly(A)外長(zhǎng)為925bp ;該序列中的開(kāi)放讀碼框編碼199個(gè)氨基酸，氨基酸序 列如SEQ ID NO. 2所示。
[0005] 上述的MYL3基因是通過(guò)如下方法獲得的：
[0006] (1)小尾寒羊肌肉總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄：
[0007] 采用TRIzoI法提取小尾寒羊肌肉組織總RNA，提取的RNA以 Agilent2100Bioanalyzer進(jìn)行檢測(cè)，要求總RNA含量在IOyg以上且RIN(RNA完整性指 標(biāo)）> 7. 5,并根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)經(jīng)Roche公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈； [0008] (2)MYL3基因 cDNA序列保守區(qū)的擴(kuò)增：
[0009] 比對(duì)已有物種MYL3基因的cDNA序列，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)上下游引物，以步驟⑴中 的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增克隆測(cè)序得到保守區(qū)序列；
[0010] ⑶應(yīng)用3'降落巢式PCR法對(duì)MYL3基因 cDNA序列的3'端進(jìn)行擴(kuò)增：
[0011] 根據(jù)所得保守區(qū)序列設(shè)計(jì)MYL3基因的3'特異內(nèi)側(cè)和外側(cè)引物；
[0012] 以3'特異外側(cè)引物和3'通用外側(cè)引物采用退火溫度逐漸降落法對(duì)上述cDNA第 一鏈進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；
[0013] 然后以3'特異內(nèi)側(cè)引物和3'通用內(nèi)側(cè)引物采用同樣的退火溫度逐漸降落法對(duì) 第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；
[0014] 對(duì)第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序得到MYL3基因 cDNA序列的：V端序列；
[0015] (4)應(yīng)用Y RACE法對(duì)MYL3基因 cDNA序列的5'端進(jìn)行擴(kuò)增：
[0016] 對(duì)小尾寒羊肌肉組織經(jīng)TRIzoI法所提總RNA依次進(jìn)行常規(guī)的去磷酸化處理、"去 帽子"反應(yīng)、與接頭序列連接并以TaKaRa公司的Y -Full RACE Kit With TAP試劑盒反 轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈；
[0017] 根據(jù)所得保守區(qū)序列設(shè)計(jì)MYL3基因的5'特異外側(cè)和特異內(nèi)側(cè)引物；
[0018] 以5'特異外側(cè)和5'通用外側(cè)引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；
[0019] 以Y特異內(nèi)側(cè)和Y通用內(nèi)側(cè)引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增；
[0020] 內(nèi)側(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序得到MYL3基因 cDNA序列的Y端序列；
[0021] (5)全長(zhǎng)序列拼接及克隆測(cè)序驗(yàn)證：
[0022] 根據(jù)重疊區(qū)域?qū)ι鲜霾襟E獲得的cDNA的保守區(qū)、5'和3'所得序列進(jìn)行拼接，獲 得MYL3基因的全長(zhǎng)cDNA序列；設(shè)計(jì)兩端序列為上下游引物，PCR擴(kuò)增并克隆測(cè)序得到MYL3 基因的全長(zhǎng)cDNA序列，具有如SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
[0023] 對(duì)該cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到該基因編碼產(chǎn)生含有199個(gè)氨基酸的蛋 白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0024] 之后發(fā)明人利用qRT-PCR法測(cè)定MYL3基因在小尾寒羊心、肝、肌肉等組織中的表 達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因主要在小尾寒羊的心肌和背最長(zhǎng)肌中表達(dá)，表明該基因具有調(diào)控骨骼肌 生長(zhǎng)的功能。
[0025] 綜上所述，本發(fā)明提供了一種可以調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYL3基因，該基因 具有調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)的功能，應(yīng)用該基因可以通過(guò)對(duì)該基因的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行操作，為實(shí)現(xiàn) 培育生長(zhǎng)速度快的綿羊品種奠定基礎(chǔ)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明中小尾寒羊MYL3基因 cDNA保守區(qū)擴(kuò)增圖，
[0027] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；另一條為MYL3基因 cDNA保守區(qū)序列；
[0028] 圖2為本發(fā)明中小尾寒羊MYL3基因3'端擴(kuò)增圖，
[0029] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；另一條為MYL3基因 cDNA的3'端序列；
[0030] 圖3為本發(fā)明中小尾寒羊MYL3基因 Y RACE擴(kuò)增圖，
[0031] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；另一條為MYL3基因 cDNA的5'端序列；
[0032] 圖4為本發(fā)明中小尾寒羊MYL3基因 cDNA全長(zhǎng)序列擴(kuò)增圖，
[0033] 圖中M為DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；另一條為MYL3的全長(zhǎng)cDNA序列；
[0034] 圖5為本發(fā)明中MYL3在小尾寒羊不同組織中的表達(dá)水平柱狀圖，
[0035] 圖中a、b、c表示小尾寒羊各組織間的差異顯著性（p〈0. 05) ;MYL3主要在心肌和 背最長(zhǎng)肌中表達(dá)。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的上述
【發(fā)明內(nèi)容】
作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。應(yīng)理解，這些實(shí)施 例僅為了說(shuō)明本發(fā)明而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條 件或常規(guī)方法，如Sambrook等編著的分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件。
[0038] 實(shí)施例I :小尾寒羊背最長(zhǎng)肌組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
[0039] 取小尾寒羊背最長(zhǎng)肌約20g，使用康為世紀(jì)公司的總RNA提取試劑盒（No. CW0580)提取肌肉組織的總RNA ;將提取的RNA采用Roche公司的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (No. 05081955001)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040] 實(shí)施例2 :cDNA保守區(qū)序列的克隆與測(cè)序
[0041] (1)引物的設(shè)計(jì)：從NCBI上下載人、豬、牛、鼠等各物種MYL3基因的cDNA序 列，以DNAMAN6. 0軟件進(jìn)行比對(duì)獲得保守區(qū)序列，設(shè)計(jì)該基因 cDNA的保守區(qū)引物為：Fl : GGAGGCTCACCTACCCTG，如 SEQ ID NO. 3 所示，和 F2 :GCCATGATGTGCTTGACAAATGC，如 SEQ ID NO. 4所示；
[0042] (2) PCR擴(kuò)增：以實(shí)施例1獲得的cDNA第一鏈為模板，采用TIANGEN的PCR MasterMix試劑盒（KT201)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；50μ 1擴(kuò)增體系中包含：PCR MasterMix25y 1 ; Fl(10X)2y I ;F2(10X)2y I ;cDNA 第一鏈 2μ 1。擴(kuò)增條件為：94°C，5min ;(94°C 30s， 58°C 30s，72°C lmin)35cycles ;72°C，10min。擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)附圖 I ;
[0043] (3)擴(kuò)增條帶的回收：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖的TAE凝膠進(jìn)行電泳凝，切取相 應(yīng)條帶；采用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒（#0691)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收；
[0044] (4)回收產(chǎn)物與載體連接：載體與片段的摩爾比控制在1:3-1:8 ;根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物回 收后凝膠電泳情況將回收產(chǎn)物稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度，依PMD18-T載體試劑盒說(shuō)明書(shū)（No. 6011) 進(jìn)行連接反應(yīng)。
[0045] (5)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：取適量連接產(chǎn)物，依TIANGEN公司的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5a (CB101)使用說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)化及細(xì)菌的培養(yǎng)操作；
[0046] (6)菌液PCR鑒定：吸取1?2 μ 1菌液作模板，依據(jù)⑵中PCR擴(kuò)增體系和條件 進(jìn)行擴(kuò)增，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶；
[0047] (7)克隆產(chǎn)物的測(cè)序分析：如果凝膠檢測(cè)含有目的條帶且較純，則吸取Iml菌液測(cè) 序分析，得到長(zhǎng)為658bp的一條保守區(qū)目標(biāo)序列。
[0048] 實(shí)施例3 :cDNA3'端序列的克隆與測(cè)序
[0049] 采用降落巢式PCR法克隆cDNA序列的3'端，具體步驟如下：
[0050] (1)引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)實(shí)施例2所得MYL3基因 cDNA保守區(qū)的測(cè)序 結(jié)果，設(shè)計(jì)兩條上游嵌套式引物，3 ^ GSP :GGACACCGGCACCTATGAGGAC，如SEQ ID NO. 5 所示，和 V NGSP :GAGAAGCTGATGGCGGGGCAAG，如 SEQ ID NO. 6 所示；并合成兩條下 游 3 '通用引物，3 ' -UP :GACTCGAGTCGATCGA，如 SEQ ID NO. 7 所示，和 OligodT-AP : GACTCGAGTCGATCGA(T)18jnSEQIDN0.8K*。
[0051] ⑵反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈：取IOOpg?1μ g實(shí)施例1中提取的RNA，加入 OligodT-AP為反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈；
[0052] (3)夕卜側(cè)PCR擴(kuò)增：以3 ' GSP和OligodT-AP為上下游引物，依實(shí)施例2中PCR 反應(yīng)試劑盒體系進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8°C，30s ;(98°C，10s ;70°C，30s ;72°C，30s)3cycles ; (98 °C,l〇s ；68 〇C,30s；72 °C, 30s)4cycles ； (98 °C,l〇s ；66 〇C,30s；72 °C, 30s) 5cycles ； (98 °C, 10s ；64 °C, 30s ；72 °C, 30s) 6cycles ； (98 °C, 10s ；62 °C, 30s ；72 °C, 30s) 8cycles ； (98〇C, 10s ；60°C, 30s ；72〇C, 30s) IOcycles ；72〇C, IOmin ；4°C ；
[0053] (4)內(nèi)側(cè)PCR擴(kuò)增：以3' NGSP和3' -UP為上下游引物，步驟（3)的擴(kuò)增產(chǎn)物稀 釋30倍為模板，依上述步驟（3)中反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序進(jìn)行目的條帶的擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn) 附圖2;
[0054] (5)PCR產(chǎn)物的克隆測(cè)序：擴(kuò)增條帶的回收、與載體連接、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及測(cè)序 同實(shí)施例2,得到長(zhǎng)為341bp的一條序列。
[0055] 實(shí)施例4 :cDNA 5'端序列的克隆與測(cè)序
[0056] 采用5' RACE法克隆5'端序列，步驟如下：
[0057] (1)引物的設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)實(shí)施例3所得MYL3基因 cDNA保守區(qū)的測(cè)序結(jié)果， 設(shè)計(jì)兩條下游嵌套式引物，5 ' GSP :GTTCTTGGAGATGTGCTGGA，如SEQ ID NO. 9所示，和 5' NGSP:CGTGATCTTCATCTCGCACTTG，如 SEQ ID NO. 10 所示；并合成兩條上游 Y 通用引 *，5,-0uterPrimer:CATGGCTACATGCTGACAGCCTAjnSEQIDN0.1lK*jP5，-Inner Primer :CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG，如 SEQ ID NO. 12 所示。
[0058] (2)mRNA的去磷酸化處理 [0059] ①配制去磷酸反應(yīng)液：

【權(quán)利要求】
1. 一種調(diào)控小尾寒羊骨骼肌生長(zhǎng)的MYL3基因，其特征在于：具有如SEQ ID NO. 1所示 的cDNA序列，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MYL3基因，其特征在于：其來(lái)源于小尾寒羊骨骼肌的肌球蛋 白輕鏈3。
3. 權(quán)利要求1所述的調(diào)控骨骼肌生長(zhǎng)的MYL3基因，在綿羊育種中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：通過(guò)對(duì)MYL3基因的調(diào)控實(shí)現(xiàn)培育生長(zhǎng)速 度快的綿羊育種。
【文檔編號(hào)】C07K14/47GK104212811SQ201410472965
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月17日
【發(fā)明者】王建民, 張春蘭, 劉冠卿, 紀(jì)志賓, 秦孜娟, 王桂芝 申請(qǐng)人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)