整合素阻斷劑多肽及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了整合素阻斷劑多肽及其制備方法和用途，屬于生物制藥領(lǐng)域。該多肽Ⅰ-多肽Ⅹ，其氨基酸數(shù)目只有9—17個，采用固相合成法合成，雖然減少了氨基酸數(shù)目，但依然具有體內(nèi)免疫保護作用，對關(guān)節(jié)炎具有治療作用；具有抑制新生血管的作用；具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防或治療血管及炎癥相關(guān)疾病的效果，包括與新生血管相關(guān)的眼部疾病。對多種腫瘤保持了較高的抗腫瘤活性，大大降低了成本；具有較好的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用，增強了適應(yīng)性，增加了適用癥，拓展了其社會價值和經(jīng)濟價值。
【專利說明】整合素阻斷劑多肽及其制備方法和用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)藥物領(lǐng)域，具體涉及整合素阻斷劑多肽及其制備方法和制備 治療用于關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療、腫瘤治療、眼科疾病治藥物中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 關(guān)節(jié)炎、細(xì)菌引起的炎癥、腫瘤、目艮科疾?。ㄈ鏏MD)均被稱為血管相關(guān)性疾病。類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA)是臨床最常見的炎性關(guān)節(jié)病和主要致殘因素之 一。RA的病理過程中，血管新生是一種標(biāo)志性的組織學(xué)改變，新生血管形成伴隨滑膜增生和 炎細(xì)胞浸潤，是RA中血管翳形成及關(guān)節(jié)破壞的基礎(chǔ)。原來應(yīng)該沒有血管存在的關(guān)節(jié)軟骨因 某種異常變化，而形成新的血管，使得軟骨受到侵蝕，造成關(guān)節(jié)變形或疼痛。新生血管引起 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織發(fā)生異常變化，正常人的關(guān)節(jié)滑膜內(nèi)層僅1-2層細(xì)胞組成，而 RA患者的滑膜內(nèi)層通常有4-10層細(xì)胞（有時甚至超過20層）。這些細(xì)胞不僅在數(shù)量上異 常增多，而且在功能上處于異?；钴S的狀態(tài)，它們可以分泌大量的細(xì)胞因子、信號分子和蛋 白酶，加速關(guān)節(jié)破壞的進(jìn)程。另外，RA滑膜中還有大量炎性細(xì)胞的浸潤，如T細(xì)胞、B細(xì)胞和 單核細(xì)胞。
[0003] 此外，腫瘤、眼病、炎癥都是與血管相關(guān)的疾病。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴新生血管； 眼科疾病如年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD)主要表現(xiàn)是脈絡(luò)膜新生血管的生成；炎癥與血管新 生是兩個相互聯(lián)系，共同發(fā)展的病理過程。
[0004] 新生血管生成，在正常生理條件下，受到高度調(diào)節(jié)，在生殖、胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和 創(chuàng)傷愈合中是必不可少的過程。血管生成在多種病理條件下也會發(fā)生，所述病理條件包括： 腫瘤生長和轉(zhuǎn)移；炎性障礙，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、骨關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、克隆病、潰 瘍性結(jié)腸類以及其它炎性障礙。
[0005] 整合素是一類廣泛分布于細(xì)胞表面的受體，能介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞與細(xì) 胞之間的相互黏附，它們通過連接胞內(nèi)細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)分子的相互作用參與 血管生成。目前至少有8種的整合素（α?β?、α2β1、α3β1、α6β1、α6β4、α5β1、 α ν β 3、α ν β 5)參與血管生成，其中α ν β 3發(fā)揮著重要作用。α ν β 3能識別配體分子中的 精-甘-天冬序列（arg-gly-asp，RGD)。ανβ3可以表達(dá)于多種細(xì)胞類型，并與多細(xì)胞活 動過程中的多種配體結(jié)合參與腫瘤的血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移、炎癥、傷口愈合和凝血等生理 和病理過程。因此，含有R⑶序列的多肽具有整合素拮抗劑作用，R⑶序列可以作為一種載 體，靶向運輸?shù)叫律軆?nèi)皮，從而對新生血管性疾病達(dá)到更高效率的治療。因此，血管抑 制多肽通過抑制血管生成不僅可阻止向滑膜輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，且直接導(dǎo)致血管退化， 從而可能抑制RA滑膜增生。抑制新生血管的形成是治療這類疾病的關(guān)鍵，而內(nèi)皮細(xì)胞的增 殖和遷移是新生血管形成的關(guān)鍵步驟。
[0006] W02013097709A1的專利說明書公開了一種整合素阻斷劑多肽，其氨基酸序列 % ：X-Phe-Gln-Pr〇-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pr〇-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gl y-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Y, X 的序列為缺失或含有 Arg-Gly-Asp 序列的多肽，Y 的 序列為缺失或含有Arg-Gly-Asp序列的多肽。該整合素阻斷劑多肽具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞 的增殖和遷移及對腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
[0007] HM-3是由是在先公開的的整合素阻斷劑，含有18個氨基酸。經(jīng)前期研究研究發(fā)現(xiàn) HM-3具有顯著的抑制血管生成的作用和抗腫瘤的活性，具有極大的開發(fā)成抗腫瘤藥物的潛 能。
[0008] 對于長的氨基酸序列而言，其空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及四級結(jié)構(gòu)難以 確定。生產(chǎn)成本高。另外，多肽運用到體內(nèi)后，其半衰期較短，比如HM-3在大鼠體內(nèi)的半衰 期只有27min，但其體內(nèi)活性依然存在。這種情況的原因是因為一般蛋白質(zhì)多肽降解產(chǎn)物任 然具有活性，有些多肽是以降解的產(chǎn)物發(fā)揮作用。為此本實驗室合成了不同長度的多肽序 列，分別分析其抗血管生成及抗炎活性，發(fā)現(xiàn)這些多肽存在很好的活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 1、發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0010] 針對現(xiàn)有的HM-3半衰期短、容易在體內(nèi)降解的問題，本發(fā)明提供了整合素阻斷劑 多肽及其制備方法，少于17個氨基酸的序列構(gòu)成的整合素阻斷劑多肽，HM-3降解片段仍然 具有活性，可以用于制備用于治療和預(yù)防關(guān)節(jié)炎以及和治療、腫瘤治療、眼科疾病治藥物。
[0011] 2、技術(shù)方案
[0012] 整合素阻斷劑多肽，其結(jié)構(gòu)為下列中的一種：
[0013] 多膚 I Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly -Asp ；
[0014] 多膚 II Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-As P ;
[0015] 多膚III Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ;
[0016] 多膚IV Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ;
[0017] 多膚 V Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ;
[0018] 多膚VI Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ;
[0019] 多膚W Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ;
[0020] 多膚VDI Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ;
[0021] 多膚IX Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ;
[0022] 多膚 X Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。
[0023] 該多肽均是HM-3截短后的片段。與現(xiàn)有技術(shù)相比，含有的氨基酸數(shù)目大大減少、 結(jié)構(gòu)更加簡單，并具有與受體好的親和性和結(jié)合能力。
[0024] 研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明中的多肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)序列是整合素 的一個重要配體，含有RGD序列的多肽Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp能夠特異性的識別 整合素。
[0025] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽，用固相合成方法制成，是其以wang resin (Wang樹 脂）為起始原料，然后用保護氨基酸保護氨基酸Fmoc-精氨酸-0H依次接一肽至八、九、十 至十七肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得多肽粗品。將粗品進(jìn)行純化，首 先溶解，然后用制備型高效液相經(jīng)過兩次純化，最后濃縮凍干得到純品.
[0026] 其固相合成方法制得的多肽純度均大于95%。多肽純度98. 02%-98. 76%。
[0027] 本發(fā)明的的整合素阻斷劑多肽，能發(fā)揮體內(nèi)免疫保護作用，對關(guān)節(jié)炎具有治療作 用。
[0028] 本發(fā)明多肽在制備治療關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用，所述的關(guān)節(jié)炎包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、 骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎和創(chuàng) 傷性關(guān)節(jié)炎。
[0029] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽具有有抑制新生血管的作用。
[0030] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多對角膜新生血管具有的抑制作用。
[0031] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽對角膜抑制新生血管的作用是以BALB/c小鼠堿燒傷 誘導(dǎo)角膜新生血管為模型。
[0032] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽對虹膜新生血管具有抑制作用。
[0033] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽對虹膜新生血管的抑制作用，采用577nm氬離子激光 凝阻家兔視網(wǎng)膜主分支靜脈為動物模型。
[0034] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽對脈絡(luò)膜新生血管的抑制作用以大鼠為動物模型。
[0035] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽，多肽I -多肽X的序列即為RGD序列通過linker連 接上不同長度的內(nèi)皮抑素活性的短片段形成的多肽，內(nèi)皮抑素能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長進(jìn) 而抑制新生血管的生長。由此構(gòu)建出了十種與整合素有親和性和結(jié)合能力的整合素阻斷劑 多肽。由于R⑶序列的靶向性，多肽可以靶向到RA中血管翳形成過程中新生血管內(nèi)皮，抑 制新生血管形成，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防或治療血管及炎癥相關(guān)疾病的效果。
[0036] 本發(fā)明整合素阻斷劑多肽在治療眼科疾病藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的眼科 疾病包括虹膜新生血管性眼?。òㄐ律苄郧喙庋?、糖尿病視網(wǎng)膜病變或視網(wǎng)膜中央 靜脈栓塞引起的虹膜新生血管性眼病）、脈絡(luò)膜新生血管性眼?。ò挲g相關(guān)性黃斑變 性、中心性滲出性視網(wǎng)膜脈絡(luò)炎、眼組織胞漿菌病綜合征或葡行性脈絡(luò)膜病變脈絡(luò)膜新生 血管性眼?。?、視網(wǎng)膜新生血管性眼病（包括糖尿病、腫瘤、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜中央靜脈阻 塞、視網(wǎng)膜靜脈周圍炎、全身性紅斑狼瘡、Eales病或Coat病相關(guān)的視網(wǎng)膜新生血管性眼 ?。┗蚪悄ば律苄匝鄄。榻悄そ佑|鏡所致角膜新生血管性疾病，以及堿及其他化學(xué) 物質(zhì)燒傷、角膜手術(shù)、細(xì)菌感染、衣原體感染、病毒感染或原蟲感染引起的角膜新生血管性 眼?。?。
[0037] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽，對多種腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用。
[0038] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的腫瘤包括胃癌、肺 癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤和宮頸癌。
[0039] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽，具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性的作用。
[0040] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽，具有抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的作用，所述人臍靜脈 內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)用含5 (%胎牛血清和1XECGS的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0041] 3、有益效果
[0042] 本發(fā)明提供了整合素阻斷劑多肽及其制備方法和用途，抗體小型化，能提高親和 力和特異性，增加抗體的滲透性和靶標(biāo)的接觸概率，副作用小。并且與現(xiàn)有技術(shù)相比大大降 低合成成本。
[0043] 本發(fā)明雖然減少了氨基酸數(shù)目，但依然具有較好的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用， 增強了適應(yīng)性，增加了適用癥，拓展了其社會價值和經(jīng)濟價值。
[0044] 由于正常內(nèi)皮細(xì)胞突變率很低，內(nèi)皮抑素作為內(nèi)源性的抗腫瘤藥物，不會產(chǎn)生抗 藥性，并且具有抑瘤效果強，毒性小等特點。
[0045] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽，能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長進(jìn)而抑制新生血管的生 長。由于正常內(nèi)皮細(xì)胞突變率很低，內(nèi)皮抑素作為內(nèi)源性的抗腫瘤藥物，不會產(chǎn)生抗藥 性，并且具有抑瘤效果強，毒性小等特點，從而成為當(dāng)前研究的熱點之一。由此構(gòu)建出了 十種與整合素有親和性和結(jié)合能力的整合素阻斷劑多肽。由于RGD序列的靶向性，多肽可 以靶向到RA中血管翳形成過程中新生血管內(nèi)皮，抑制新生血管形成，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防或治療 血管及炎癥相關(guān)疾病的效果。
[0046] 本發(fā)明所述整合素阻斷劑多肽在佐劑誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型能發(fā)揮體內(nèi)免疫 保護作用，對AA大鼠關(guān)節(jié)炎具有治療作用。所述對AA大鼠關(guān)節(jié)炎具有治療作用多肽I 一多 肽W的治療效果較多肽V-多肽W優(yōu)。大鼠陽性對照組左后足足爪腫脹度與模型組比較，具 有極顯著性差異（P〈〇. 01);整合素阻斷劑多肽I -III的高劑量組左后足足爪腫脹度與模型 組比較，具有極顯著性差異（P〈〇. 01)，整合素阻斷劑多肽I -III的中劑量組和IV-W的高劑 量組左后足足爪腫脹度與模型組比較有顯著性差異（P〈〇. 05)，實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0047] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多對角膜抑制新生血管的作用，多肽I、多肽II和多肽III 種整合素阻斷劑均能夠極顯著抑制角膜新生血管的生長，多肽IV、多肽V和多肽VI整合素 阻斷劑能夠顯著的抑制角膜新生血管的生長。多肽I、多肽II和多肽III對小鼠角膜新生血 管抑制作用的抑制率分別為48. 24%、58. 89%、50. 01 %，HM-3組的抑制率為50. 15%，可見 與HM-3組相比較，多肽II和多肽III要比多肽HM-3的抑制率好。多肽IV、多肽V和多肽VI實 驗組⑶31陽性新生血管與對照組相比減少。多肽IV、多肽V和多肽VI對小鼠角膜新生血管 抑制作用的抑制率分別為46. 89%、48. 01 %、42. 83%。多肽W實驗組⑶31陽性新生血管與 對照組相比有減少，但效果不如前幾個多肽明顯，對小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率 為30. 42%。多肽W、多肽IX和多肽X對小鼠角膜新生血管抑制作用不明顯。實驗結(jié)果表明 多肽I、多肽II和多肽III種整合素阻斷劑均能夠極顯著抑制角膜新生血管的生長，多肽IV、 多肽V和多肽VI兩種整合素阻斷劑均能夠顯著的抑制角膜新生血管的生長能夠作為治療 角膜新生血管性眼病的藥物。
[0048] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽對虹膜新生血管的抑制作用，其多肽I 一多肽X能夠 抑制新生血管形成并使已形成的血管退化，其中多肽I 一多肽III與陰性組相比新生血管的 消退很明顯，治療效果優(yōu)于多肽IV-多肽X。
[0049] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽對脈絡(luò)膜新生血管具有抑制作用。其對角膜新生血管 的抑制作用，多肽I 一多肽νπ能夠有效的治療脈絡(luò)膜新生血管，多肽VDI-多肽X在給藥后 效果不是很明顯。
[0050] 本明的整合素阻斷劑多肽在治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述多肽I 一多肽III能有效 的抑制胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤和宮頸癌的增殖，其中對胃癌、 肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌的抑制率均在50 %以上。
[0051] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽，其多肽IV-VI能抑制胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色 素瘤的增殖，其中對胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌的抑制率均在40%以上，達(dá)到抑制這些腫瘤增 殖的效果。
[0052] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽，其多肽W-多肽X對胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色 素瘤的增殖抑制作用相比較前幾個多肽在同等的劑量下作用較弱，但對腫瘤細(xì)胞有增殖有 抑制作用。
[0053] 本發(fā)明的整合素阻斷劑多肽，其特征在于：所述抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性采用 transwell法測定，多肽I、多肽II、多肽III能抑制5 %的胎牛血清及ECGS誘導(dǎo)的HUVEC 的遷移作用，抑制率均大于68. 10%，對細(xì)胞遷移的抑制率與陰性對照相比有極顯著性 的差異（P〈〇. 01);在多肽IV、多肽V、多肽VI的作用下，遷移的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)與陰性對照相 比減少，抑制率均大于50. 57%，對細(xì)胞遷移的抑制率與陰性對照相比有顯著性的差異 (Ρ〈0· 05)。

【具體實施方式】
[0054] 以下結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明
[0055] 實施例1
[0056] 整合素阻斷劑多肽合成肽I 一 X的制備及檢驗
[0057] 采用多肽固相合成方法，其以wang resin (Wang樹脂）為起始原料，然后用保護氨 基酸Fmoc-精氨酸-0H依次接一肽至八、九、十至十七肽，接肽工作完成后充分洗漆，然后切 肽、后處理即得多肽粗品。將粗品進(jìn)行純化，首先溶解，然后用制備型高效液相經(jīng)過兩次純 化，最后濃縮凍干得到純品。具體步驟如下：
[0058] 一、合成：
[0059] 稱取Wang resinl3g，倒入1L的玻璃砂芯反應(yīng)柱中，加入CH2C12130ml使樹脂充分 膨脹。
[0060] 脫帽：加入六氫吡啶/DMF的脫帽液25mL，密封后放入振蕩器中反應(yīng)5分鐘，溫度 控制在室溫，5分鐘后將脫帽液抽干，中間用DMF洗滌一次，然后再加入一次20 %的脫帽液 25mL反應(yīng)15分鐘；
[0061 ] 洗滌：將脫帽液抽干，用DMF洗滌樹脂6次，抽干，取20顆樹脂在小試管內(nèi)，加入驗 色劑，在115°C加熱3分鐘。
[0062] 縮合：稱取保護氨基酸Fmoc-精氨酸-0H和H0Bt2. 790g，溶于15ml DMF和 3. 215mLDIC，然后倒入反應(yīng)釜中反應(yīng)1. 5左右小時，溫度控制在34°C左右。
[0063] 洗滌：將反應(yīng)液抽干，用DMF洗滌樹脂3次，抽干，取10-20顆樹脂在小試管內(nèi)，力口 入驗色劑，在115°C加熱3-5分鐘。
[0064] 切肽：把抽干的樹脂裝入500mL的圓底燒瓶中，加入切割液（按體積比比計三氟乙 酸：苯酚：水：苯甲硫醚：EDT = 82. 5 :5 :5 :5 :2. 5)，密封反應(yīng)2小時，用砂芯漏斗將樹脂與 多肽分離。
[0065] 后處理：先加無水乙醚到切割液中將多肽析出，然后離心，把清液倒掉，然后再用 無水乙醚洗滌多肽6次，抽干得多肽粗品8. 6g。
[0066]二、純化：
[0067] 溶解：精密稱取多肽粗品，加入適當(dāng)?shù)募兓涑扇芤?，攪拌至無顆粒狀澄清溶 液。
[0068] 過濾：將多肽的溶液用沙芯過濾器0. 45um的混合濾膜過濾.
[0069] 1、制備方法：
[0070] 通過一次純化、二次純化和三次純化得到多肽精制合格品，流動相為A相純水，B 相1%。TFA水溶液，C相乙腈，D相3%。醋酸溶液。
[0071] 將粗品溶解過濾，用輸液泵上樣，一次純化洗脫梯度如下（表1):
[0072] 表1 一次純化洗脫梯度
[0073] 時 |'"j min 流速（ml/min) C% B% 0 60 7 ()3 40 60 17 83
[0074] 收取在紫外波長220nm吸收大于220mV的溶液，通過檢測合并大于95%的液體樣 品待二次純化，梯度見表2。
[0075] 表2二次純化洗脫梯度
[0076] 時_mk 流速（ml/min) C% B% 0 60 6 94 40 60 16 84
[0077] 收取在紫外波長22〇11111吸收大于20〇11^的溶液，通過檢測純度大于98%的作為合 格。
[0078] 濃縮、過濾、凍干：將合格溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37°C減壓濃縮，除去殘留溶劑和注射 用水。最后用0. 22um濾膜過濾，濾液裝入凍干盤中，用冷凍干燥機進(jìn)行冷凍干燥，得純品。
[0079] 2、精制品的制備
[0080] 二次純化所得的樣品，收取其中在紫外波長220nm吸收大于220mV的溶液，通過檢 測合并大于98. 5%的液體樣品待三次純化，梯度見表3。
[0081] 表3三次純化洗脫梯度
[0082] 時_ min 流速（mL/min) C% B% 0 60 5 95 40 60 15 85
[0083] 收取在紫外波長220nm吸收大于220mV的溶液，通過檢測合并大于99. 5%的液體 樣品，即為精制合格品。
[0084] 將多肽精制合格品溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀37°C減壓濃縮，除去殘留溶劑和注射用水。 最后用0. 22 μ m濾膜過濾，濾液裝入凍干盤中，用冷凍干燥機進(jìn)行冷凍干燥，得到多肽的精 制合格品。
[0085] 三、純度檢測
[0086] 收集凍干后的純化產(chǎn)物，通過反相液相檢測多肽純度分析純度，分析條件為：
[0087] 流動相：ACN(+0. 1 % TFA)、Η20(+0· 1 % TFA) ;ACN 線性梯度：15 % -60 % ;流 速：lmL/min ;運行時間：30min ;上樣量：20μ 1 ;檢測波長：220nm ;分析柱：4. 6X250mm， Kromasil C18-5 ;待檢品溶液制備：多肽供試品適量，精密稱定，加水溶解配制成約lmg/mL 的供試品溶液。
[0088] 表4 RP-HPLC檢測整合素阻斷劑多肽I - X的純度
[0089] 多ft編 ttifij'IM 純度（％) I 1328097 98.53 II 1349502 98.87 III 1221094 98,02 W 1353677 98,39 ￥ 1298672 98.42 VI 1312974 98.27 VII 1285551 98,12 VI 1404323 98.4 J IX 1302837 98.58 X 1381038 98.76
[0090] 合成的整合素阻斷劑多肽經(jīng)反向液相色譜分析進(jìn)行純度鑒定結(jié)果見表4,多肽純 度均大于95%，符合設(shè)計要求。
[0091] 實施例2
[0092] 整合素阻斷劑多肽對佐劑型大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用
[0093] 構(gòu)建佐劑型大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型，研究整合素阻斷劑多肽對佐劑性關(guān)節(jié)炎 (Adjuvant arthritis，AA)大鼠的治療作用。采用大鼠作為受試動物，清潔級wistar大 鼠238只，雄性，體重為150g - 180g，隨機分成34組，分別是空白對照組，模型對照組，多 肽I - X低中高3個劑量組（3,6,9mg/kg)和陽性藥對照組（甲氨蝶呤lmg/kg)，再加一個 HM-3治療劑量組做比較。除空白組外，第0天各實驗組建立大鼠 AA模型，方法是在大鼠的 左側(cè)后足足跎注射含滅活的結(jié)核分枝桿菌（H37RA，10mg/ml)完全弗氏佐劑0.08ml造成大 鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。第19天出現(xiàn)繼發(fā)性炎癥開始皮下注射給藥：多肽I 一 X 3個劑量組 (3,6,9mg/kg):每日一次，連續(xù)10天；：多肽HM-3組（6mg/kg):每日一次，連續(xù)10天；陽性 藥對照組（甲氨蝶呤lmg/kg):每五天一次，連續(xù)3次；空白對照組和模型對照組（生理鹽 水）：連續(xù)10天。分別于造模后第1，4, 7,10,13,16,19, 22, 25, 28, 31天稱重，造模后第19， 22, 25, 28, 31天進(jìn)行關(guān)節(jié)評分以及左右后足足爪腫脹度的測量來觀察藥物對大鼠佐劑型關(guān) 節(jié)炎的影響。
[0094] 關(guān)節(jié)炎評價指標(biāo)如下：
[0095] 1)體重
[0096] 分別于造模后1，4, 7,10,13,16,19, 22,25, 28, 31天稱重，并記錄數(shù)據(jù)。
[0097] 2)關(guān)節(jié)評分
[0098] 四肢：按0- 4五級評分：0 =無紅斑或紅腫；1 =輕微的紅斑或腫脹，其中的一個 前/后趾關(guān)節(jié)有紅斑或腫脹；2 =多于一只趾出現(xiàn)紅斑或腫脹；3 =踝或腕關(guān)節(jié)下的足爪腫 脹；4 =包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。大鼠四只足分別評分，最高評分為16分。
[0099] 分別于造模后第19, 22, 25, 28, 31天進(jìn)行關(guān)節(jié)評分，并記錄結(jié)果。
[0100] 3)測量足爪腫脹度
[0101] 分別于造模前和造模后1，4, 7,10,13,16,19, 22, 25, 28, 31用排水法測量大鼠左 后足足爪腫脹度并記錄結(jié)果；造模前和造模后第19, 22, 25, 28, 31天測量大鼠右后足足爪 腫脹度并記錄結(jié)果。
[0102] 試驗結(jié)果的計量資料以數(shù)學(xué)平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)表示，用SPSS11. 0軟 件進(jìn)行各給藥組與對照組之間進(jìn)行t檢驗，表中*表示p〈0. 05, **表示p〈0. 01。
[0103] 結(jié)果：造模后大鼠與正常大鼠相比較，在大鼠左后足跎處注射含滅活的結(jié)核分枝 桿菌完全弗氏佐劑后，左后足會迅速產(chǎn)生原發(fā)性關(guān)節(jié)炎，出現(xiàn)明顯的腫脹，并伴有潰爛；右 后足大約19d后開始出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎。整合素阻斷劑多肽在佐劑誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎動物模 型體內(nèi)免疫保護作用結(jié)果見表5,由表可知，整合素阻斷劑多肽I 一ΥΠ 在佐劑誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié) 炎動物模型能發(fā)揮體內(nèi)免疫保護作用，整合素阻斷劑多肽W - X的作用效果較I 一νπ多肽 的作用弱，結(jié)果如下：
[0104] 大鼠陽性對照組左后足足爪腫脹度與模型組比較，具有極顯著性差異（Ρ〈0. 01); 整合素阻斷劑多肽I -III的高劑量組左后足足爪腫脹度與模型組比較，具有極顯著性差異 (P〈0. 01)，整合素阻斷劑多肽I - III的中劑量組和IV - W的高劑量組左后足足爪腫脹度與 模型組比較有顯著性差異（P〈〇. 05)，實驗結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0105] 表5整合素阻斷劑多肽對佐劑型類大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型體內(nèi)免疫保護作用
[0106] 只數(shù)劑 Μ:左足爪腫服度:彳《 id爪腫脹度 組別 臨床if分 體增加 (N) (nig/kg)(niL) (mL) il：常 -0,I2±0.I9*· 0.06±0.02** 0,00±0,00** 107.29±27.35** 對照 7 - ai 模別 1,55±0.23 0,98±0,26 7.17 土 0.41 33.67 士 15.24 i'l !!(s 7 - 組 PI I ·|1:_ 1.01 ±0.35** 0.23土(US** 4.67士 1.03** 30.17士22.28 對照 7 1 組 多肽 1.2! ±0.21* 0.49土0.19* 5.12 士0.56** 你 .42 土 Π.26 11M-3 7 6 ? 名肽 1.21 ±0.59* 049±0.19· 5.14±0.69** 45.8 壯21.64 7 3 I低 % 肽 1.12+0.38*· 0.34+0.24* 5.40+0.55** 54.40+22.86 7 6 I屮 名肽 1.0社CU4* 0.32 士 0.22? 5.43 土 0.79? 39.71±15.29 7 9 I ? 多肱 1,36±0,25 0.62±0.20 6.43土0.53* 43.29±-13.63 7 3 Π 低 多肽 Ui±0,21* 0.43±0,20* 5,86±0,69** 48.71 土 7.57 7 6 II中 多肽 U2 士 0J8** 0說±0,34 6.50±0.55* 45,35±24,54 7 9 II高 多肽 i,32±0,22 0.54±0.25 5,89土 52.13±11.09 7 3 111 低 0,46* 多肽 7 6 1.27士0.32* 0.57士0.26 5.45士 46.67土 21.45
[0107] 0.48** 多肽 L1WAW* 0,43 士 0.24* 5,95 士 48,89±25,59 7 9 III ft 0.61* 名肽 1.38±0.55 0.62 土 0.20 6.42 士 45.87 士〗2.87 7 3 丨V低 0.48* 多肽 U0±0.36 0.59±0.46 6.50= 48.55± 16.66 7 6 丨V屮 0.28* I；肽 1,27±?Μ7* 0.42±0.29* 6.44 土 47.67±25.86 7 9 IV ft 0.51* 多肽 1.36 士0.64 0,65土0,35 6,70士 47.54 士 19.43 7 3 V 低 0.52 名肽 1,35±0,56 0.60士0.30 6.63± 50.67 士 23.45 7 6 V 屮 0.35* 多肽 i.28±0.52* 0.63±0.29 6.5()土 48,04±25.13 7 9 ￥? 0.58* 名肽 1,39 丄0,29 0,70X0,2? 6.761 49,82丄 12.34 7 3 VI 低 0.37 多肽 1.35±0.37 0,68*0,47 6.73+ 47,67±22,65 7 6 VIΦ 0.50 多肽 1.3010.51* 0.6310.28 (ν62?· 48.38 丄 28.34 7 9 VI ft 0,54* 名肽 1.29 士 0.63* 0.75 土 0.57 6.87± 49.24士 21.73 7 3 V?低 0.37 多肽 1.42±0.38 0.76±0.30 6.74 士 47.98 土 13.43 7 6 VI丨屮 0.29 Z 肽 1.3 釷0.34 0.64土 0.38 6.64± 49.74 土丨 4.54 7 9 VII? 0.24* 多肽 1,47±〇,46 0.83±0.39 6.89± 50 J5 土 27,12 7 3 VIII 低 0.60
[0108] 多肽 1.48 士 0.39 0.78 士 0.53 6.71 土 47.18士 13.67 fmj _ 屮 0.31 名肽 1.43±0.63 0.76 士 0.51 6.75 士 47.55士 16.21 7 9 0.37 多肽 i,50±034 0.82士0.29 6M± 48,74土 19.46 η % IX 低 0.17 多肽 1,48 土0,35 0.79±0,34 6.98士 49.67± 19.45 n a IX 中 0.30 多肽 L44±0,43 0,77±0,35 6.88± 48,90±21·56 η ο IX 高 ^ 0.24 多肽 1.57±0.26 0.89±0,21 7,04 土 50.33± 18.45 7 3 X 低 0.31 多肽 1,55 士0,58 0.91士0.52 7.12± 48.34± 14.95 7 6 X 中 0J1 多肽 1.56土0.37 0,88±0,39 7.03± 4?.29±16,87 7 9 X 高 0.43
[0109] * 表示 ρ〈0· 05, ** 表示 ρ〈0· 01.
[0110] 結(jié)論：整合素阻斷劑多肽I 一X對ΑΑ大鼠關(guān)節(jié)炎具有治療作用，比較而言多肽 I -III組的治療效果較IV-ΥΠ 組優(yōu)，VDI-X組的治療效果比較弱，多肽I和多肽II的中、高 劑量組均較ΗΜ-3治療組的效果好，多肽III的高劑量組較ΗΜ-3治療組的效果好，多肽I的低 劑量組與ΗΜ-3治療組的效果相當(dāng)?？梢?，截斷后的多肽有仍有開發(fā)的價值。
[0111] 實施例3
[0112] 整合素阻斷劑多肽對小鼠角膜新生血管的作用
[0113] l)BALB/c小鼠堿燒傷誘導(dǎo)角膜新生血管模型的制備：
[0114] 健康BALB/c小鼠55只，雄性，體重20_25g，裂隙燈顯微鏡下檢查雙眼眼前段及附 屬器，排除眼部病變。堿燒傷模型制備前Id予0.3%氧氟沙星眼藥水點眼，每日2次。小鼠 經(jīng)腹腔注射1. 8% Avertin麻醉后，用鑷子夾住直徑為2mm的單層濾紙片，浸于lmol/L氫氧 化鈉溶液中，使其達(dá)飽和狀態(tài)，去除多余液體，將濾紙片置于BALB/c小鼠角膜中央40S，棄 掉濾紙，立即用15mL的PBS充分沖洗燒傷區(qū)及結(jié)膜囊lmin。棉簽拭去過多水分，于手術(shù)顯 微鏡下以角膜刮鏟平行于角膜緣的方式旋轉(zhuǎn)刮除角膜上皮，注意勿傷及上皮下基質(zhì)層及角 膜緣，術(shù)畢結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏預(yù)防感染。
[0115] (2)實驗動物分組及標(biāo)本獲取
[0116] 60只小鼠按隨機分組，標(biāo)記為多肽I實驗組、多肽II實驗組至多肽X實驗組共十 個實驗組、HM-3實驗組和對照組，每組5只，自堿燒傷后分別給予50 μ g多肽I 一X、HM-3 和生理鹽水玻璃體腔注射，每日1次，持續(xù)1周，堿燒傷后ld、7d、14d于裂隙燈顯微鏡下觀 察各組角膜的炎癥反應(yīng)及新生血管情況。堿燒傷后第14d于帶眼前段照相的裂隙燈顯微鏡 下拍照記錄各組角膜新生血管形成情況，隨即以頸椎脫白法處死所有小鼠并摘除眼球，生 理鹽水沖洗血跡，4%多聚甲醛固定1.5h，含30%蔗糖的PBS中脫水過夜，OCT冰凍切片包 埋劑包埋，_80°C冰箱中保存，8 μ m冰凍切片，免疫組織化學(xué)法檢測⑶31的表達(dá)。
[0117] (3)角膜組織微血管密度定量測定
[0118] 微血管密度（Microvessel density, MVD)是評價血管形成的指標(biāo)。我們采用抗 CD31抗體免疫組織化學(xué)法標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，計數(shù)單位面積中的微血管數(shù)目，由此來衡量 新生血管生成的程度。統(tǒng)計微血管的標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡下觀察角膜組織中與鄰近組織分界清楚， 并被染成棕黃色或褐色的內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞團均計入新生血管。在10X20鏡下計數(shù)整張切 片新生血管數(shù)目，角膜組織片照相后以圖像處理軟件Image J計算出整個角膜組織片面積， 求出該例整張切片的新生血管密度，并計算整合素阻斷劑多肽對血管新生的抑制率。
[0119] 表6整合素阻斷劑多肽對小鼠角膜新生血管的作用a
[0120] 分組 MVD 抑制率（％) 對照 Μ 72·66±6'31 - 多肽 ΗΜ-3 36.01±3.02? 50.15% 多肽 I 35.6〗±3.56_ 48.24% 多肽 II 29,87+3,43? 58.89% 多肽 m 35.92±4,19? 50.01% 多肽 IV 42.27土6.82* 46.89% 多肽 V 38.78 士2.87* 48.01% 多肽 VI 44.41 ±4.08* 42.83% 多肽 W 54.37+5.83 30.42% 多肽 VI 66.46±4.19 23.67% 多肽 IX 70.46±3.98 8.97%
[0121] 多肽 X 64.27 土2.67 12,08%
[0122] a:*p<0. 05, **P<0. Olvs. the negative control group ；
[0123] 整合素阻斷劑多肽對小鼠角膜新生血管的作用結(jié)果見表6 :⑶31作為微血管標(biāo)記 物，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)中，染色陽性細(xì)胞為血管內(nèi)皮細(xì)胞染成棕黃色或褐色，無 背景染色。多肽I、多肽II和多肽III實驗組⑶31陽性新生血管與對照組相比顯著減少。多 肽I實驗組切片MVD值為37. 61 ±3. 56,多肽II實驗組MVD值為29. 87 ±3. 43,多肽III實驗 組MVD值為35. 92±4. 19與對照組72. 66±6. 31比較有極顯著性差異，多肽I、多肽II和 多肽III對小鼠角膜新生血管抑制作用的抑制率分別為48. 24%、58. 89%、50. 01%，HM-3組 的抑制率為50. 15 %，可見與HM-3組相比較，多肽II和多肽III要比多肽HM-3的抑制率好。 多肽IV、多肽V和多肽VI實驗組⑶31陽性新生血管與對照組相比減少。多肽IV實驗組切 片MVD值為42. 27±6. 82,多肽V實驗組MVD值為38. 78±2. 87,多肽VI實驗組MVD值為 44. 41 ±4. 08與對照組72. 66±6. 31比較有顯著性差異，多肽IV、多肽V和多肽VI對小鼠角 膜新生血管抑制作用的抑制率分別為46. 89 %、48. 01 %、42. 83%。多肽W實驗組⑶31陽 性新生血管與對照組相比有減少，但效果不如前幾個多肽明顯，對小鼠角膜新生血管抑制 作用的抑制率為30.42%。多肽W、多肽IX和多肽X對小鼠角膜新生血管抑制作用不明顯。 實驗結(jié)果表明多肽I、多肽II和多肽III種整合素阻斷劑均能夠極顯著抑制角膜新生血管的 生長，多肽IV、多肽V和多肽VI兩種整合素阻斷劑均能夠顯著的抑制角膜新生血管的生長 能夠作為治療角膜新生血管性眼病的藥物。
[0124] 實施例4
[0125] 整合素阻斷劑多肽對家兔虹膜新生血管的作用
[0126] 采用577nm氬離子激光凝阻家兔視網(wǎng)膜主分支靜脈，經(jīng)眼底熒光素血管造影 (FFA)證實靜脈阻塞成功。5-12天后眼虹膜熒光素血管造影（IFA)顯示虹膜血管與正常對 照組對比熒光素滲漏明顯，證實虹膜新生血管化的動物模型（NVI)形成。
[0127] 取造模成功的12只眼，隨機分成4組，每組3只。分別標(biāo)記為陰性對照組、多肽 I 一X治療組和多肽HM-3治療組，分別以生理鹽水、150 μ g多肽I 一X和多肽HM-3玻璃體 腔注射給藥，每日1次，持續(xù)2周。第3周用光學(xué)及電子顯微鏡觀察。
[0128] 結(jié)果：光學(xué)顯微鏡下可觀察到虹膜前表面是主要由纖維組織組成的纖維血管膜殘 跡，僅有極少的開放血管腔。在虹膜基質(zhì)內(nèi)可看到血管殘存物，為壞死細(xì)胞及細(xì)胞碎片。而 光鏡下的對照眼的虹膜表面為有分枝的和潛在管腔的纖維血管膜。
[0129] 治療組虹膜的超微結(jié)構(gòu)為一系列的退行性改變。虹膜基質(zhì)中部的大血管的內(nèi)皮細(xì) 胞有正常的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞連接。虹膜基質(zhì)中及虹膜前表面有毛細(xì)血管殘跡，周圍 有細(xì)胞碎片和巨噬細(xì)胞浸潤。無潛在管腔的毛細(xì)血管及退變的壁細(xì)胞，表明新生血管消退。
[0130] 通過虹膜新生血管化的動物模型實驗，證明了多肽I 一X和多肽HM-3能夠抑制 新生血管形成并使已形成的血管退化，在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，其中多肽I 一III與陰性 組相比新生血管的消退很明顯，治療效果優(yōu)于HM-3組和多肽IV - X組，多肽HM-3組的血管 退化程度與多肽V相似。
[0131] 實施例5
[0132] 整合素阻斷劑多肽對大鼠脈絡(luò)膜新生血管的作用
[0133] 用846復(fù)合麻醉劑0. 5mL/kg腹腔注射充分麻醉6-8周雄性BN大鼠，激光光凝前 5min用復(fù)方托品酰胺眼液滴眼一次，充分散大雙眼瞳孔。固定動物，在-53. 00D角膜接觸鏡 輔助下，圍繞視盤并在距視盤2H)位置等距離行氪離子激光光凝，共計8個光凝斑，激光波 長為647. lnm，功率為350mW，光凝斑直徑和時間分別為50 μ m及0. 05s。光凝后立刻進(jìn)行眼 底照相。于光凝后3、7、14、21、28分別進(jìn)行FFA、組織病理及透射電鏡檢查。
[0134] 通過眼底照相及FFA檢查證實，光凝后第21天光凝斑熒光素滲漏達(dá)到高峰。同時 進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，光凝后21天，光鏡下顯示CNV呈現(xiàn)顯著的纖維血管增殖，其中可見大 量新生血管，管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞；鏡下顯示脈絡(luò)膜黑色素細(xì)胞間有毛細(xì)血管呈凝聚性改變， 內(nèi)皮細(xì)胞凝聚。表明21天后大鼠脈絡(luò)膜新生血管模型形成。
[0135] 將造模成功的60只大鼠，隨機分成12組，每組5只大鼠。分別標(biāo)記為空白對 照組、多肽I 一X治療組和多肽HM-3治療組，分別以生理鹽水、多肽I 一X (75 μ g)、 HM-3 (75 μ g)治療組玻璃體腔注射，每日1次，持續(xù)1周。給藥后3天、7天、14天及28天均 進(jìn)行FFA檢查。
[0136] 表7各實驗組給藥后不同時間CNV發(fā)生率
[0137] 檢測時間 鐘到 ?3 }< ml )< Ψ, 14 Λ 第 2? 大 (總255) <總'廣.9:數(shù)為丨) ? ￡v￡.Sf數(shù)+? 1W) !總光斑致+為ft9) I); * ik OJV CNV iiiWA 斑 ?Μ^?.? ('NV 發(fā) 數(shù) 'fi'VA-· <%)'& :d+:.1M%;S <%)數(shù) Ilf- (.%) #照姐 232,l±20,8 91.02% 142.2±17.4 73.68 0.? 89.8-10.5 82.40% 57.9±9.4 83,91% HM-3 I60.6±II.8 64.41% 79.6^9 J 40.02% 46 J± 10.4 41.23% 22.5±5.7 29,98%
[0138] 衫肽 I I77.4+I2.9 69.57% ￠5.4-10.2 49.43"i. 50.0+9.5 45.87? 28.0+6.1 25,58% Z\\kl\ !56.9±I0.3 62.75% 75.4=11.2 34.3±7.2 31.47% 20.4*4.9 29,57% ?Kill 151.5x15.4 61.64% 82.7-10.3 42.05% 45.5-H0.5 40.84 n*a 23.4丄4.5 34.89% tlJklV 丨 60.2 士 21.3 6432% IM.fcHJ 51.S5% 46.5±20.3 41.26% 36.3±5.7 49,79% 多駄 V+ 174.5±I3.6 68.42% 100J±10.6 50.98% 40.5±6.0 39.25% 3?.6±6.〇 50.46% 多肽 W ISS.fct 丨丨.2 63.25% l!3.4±11.2 58.CW?% 57,3±10,1 56,95% 40 J ±6.2 62^87% 多 KVII 1?6.9±13.3 67.62% 12(1.5 士 15-8 69.03% ?->.5 土4.5 59.42% 43.7土9.5 63,56% 多肽 W 180.9±123 71.55% 137.3-16.6 71.74% 69.5±10.2 65.01% 49 i> 士 10.6 65.66% 多肽.LX 176.9±15.2 70.12% 131,5 土 16,6 69.01% 74.5 士 20.5 71.90% 52,9±i0.1 75,76% 客肽―X 丨 86.9 士丨 4.3 7474% 145.6±145 74.05% 85 A 1(12 81.46% 53.4±9.2 76.64%
[0139] 結(jié)果：見表7,各實驗組給藥后不同時間CNV發(fā)生率（發(fā)生滲漏的光斑數(shù)/總光斑 數(shù)）。FFA檢測，給藥后3天，多肽I 一X治療組和HM-3治療組熒光素滲漏與用藥前相比無 明顯變化；給藥后7天，治療組I 一III和HM-3治療組熒光素滲漏比用藥前逐漸減輕；給藥 后14天,治療組I 一ΥΠ 和HM-3治療組熒光素滲漏比用藥前逐漸減輕；給藥后28天,熒光素 滲漏相比用藥后14天更少。說明七種整合素阻斷劑多肽能夠有效的治療大鼠脈絡(luò)膜新生 血管，有可能開發(fā)成為治療脈絡(luò)膜新生血管性眼病的藥物。治療組VDI - X在給藥后效果不 是很明顯。
[0140] 實施例6
[0141] 整合素阻斷劑多肽對多種腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用
[0142] 采用ΜΤΤ法檢測整合素阻斷劑多肽抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的活性。以多西他賽為 陽性藥（Taxol)，生理鹽水為陰性組。多種腫瘤細(xì)胞細(xì)胞在37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 至密度90%以上時用胰蛋白酶消化收集，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并在顯微鏡下計數(shù)，將細(xì)胞濃 度調(diào)整為3.0X104個/mL，將細(xì)胞懸液接種到96孔板中，每孔lOOyL，并于37°C，5% C02 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將多肽I 一X、HM-3、TaX〇l用培養(yǎng)液稀釋到各個預(yù)定濃度。待細(xì)胞 完全貼壁后，將各個稀釋液分別加入96孔板中，每孔100 μ L。以加入整合素阻斷劑多肽作 為給藥組，Taxol作為陽性對照組，以不加任何藥物的培養(yǎng)液作為空白對照組，在37°C，5% C02培養(yǎng)箱孵育48小時。向96孔板中每孔加入20 μ L5mg/ml的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。吸 去培養(yǎng)基，每孔加入100 μ L DMS0溶解。用酶標(biāo)儀在570nm下檢測，參比波長為630nm處測 定吸光值，并計算生長抑制率（proliferation inhibition, PI)，公式如下： Ν?
[0143] PI (%) = 1 - -- x 100% Noontrol
[0144] 其中Ntest為測試組的0D值，Ncontrol為空白對照組的0D值。
[0145] 表8-1整合素阻斷劑對多種腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用
[0146] 出色I(xiàn)瘤 m 肺癌廁1癌 乳腺癌 列腺癌 多肽編u FI (%) FI (%) PI (%) PI (%) P! (%) F1 (%) 多 肽 HM-3 57,99 60.47 60.75 61,57 52.25 59.37 (20pg/mL) 多肽 ? (2f^g/mL) 67.48 70.62 81.70 70.94 84.83 64.45 多肽 II (20μ§/ηιυ 77J4 72.03 79,19 70,02 78,87 70.45 多ΠΙ (2%g/mU 58.54 75.34 77.86 76,96 70.09 65.75 多肷 IV (2〇Hg/mL) 56.90 62.90 69.65 60,87 64,97 64.23 多肽 V (2(^g/mL) 49.24 66.89 67.44 66J1 68.35 50.34 多肽VI (20μ§/ηΛ) 45.56 60.98 60.46 62,45 69.67 47.75 多肽Vfl (20pg/mL) 39.78 48,78 61.78 48.78 34,87 45.46 多肽Wl (20pg/mL·-) 34.67 43.89 45.89 43,79 30.78 31.75 多肽丨X (20pg/mL) 28.45 18.56 40.78 32J7 10.90 37.96 多肽 X (20pg/mL) 12.67 24.23 10.54 6,32 2,12 10.01 Taxoi 90,89 89,21 90.05 91,76 86,54 87.29 (10^tg/mL)
[0147] 表8-2整合素阻斷劑對多種腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用（接上表）
[0148] 多肽編 結(jié)腸癌 膠質(zhì)瘤 貧麵 im癌 卵讓癌 mm '1 PI (%) PI (%) PI (%) PI (%) PI (%) PI (%) 客肽HM-3 1 50.35 49.76 55.03 60.76 57.67 58,75 (20pg/tnL) 多肽 i 77J6 52.88 72,83 77.53 75.64 74.57
[0149] (20pg/niL) 多肽 -- 80.87 47.28 77.77 68.32 65.93 57,75 (20pg/mL) 多肽 m 75.09 51.24 1329 70.12 70.29 60,33 (20pg/mL) 多肽 ，V 52.65 42.47 67^48 62.68 63.77 65,45 (20pg/mL) 多肽 V 50.45 39.55 48.39 59.34 54.54 51.89 (20pg/mL) 多肽 VI 45.56 31.37 3139 47.56 47.01 48,97 (lOpg/mL) 多肽 VII 29.93 21.67 33.38 32.79 30.43 34.89 (lOpg/mL) 多肽 VII 32,.65 22,19 20.42 15.93 14,65 24,09 (20pg/mL) 多肽 IX 12.90 16.62 18.38 20.45 12.54 10.47 (20pg/mL) 多肽 X 9,22 1538 17.28 10.75 9,34 11,89 (20pg/mL) Taxo! 85.65 75.53 77.00 89.55 81.04 79.46 (10pg/mL)
[0150] 整合素阻斷劑多肽對多種腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用見過如表8-1和8-2,多肽I 一 III能有效的抑制胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤和宮頸癌的增殖，其中 對胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌的抑制率均在70%以上；多肽IV-VI能抑制 胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤的增殖，其中對胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌的抑制率均在 60%以上，達(dá)到抑制這些腫瘤增殖的效果。多肽W - X對胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素 瘤的增殖抑制作用相比較前幾個多肽在同等的劑量下作用較弱，但實驗數(shù)據(jù)顯示其任對腫 瘤細(xì)胞有增殖抑制作用。與HM-3組相比較，多肽I組對肝癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤和宮頸癌的增 殖抑制率要高于HM-3組；多肽II組對胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤和宮頸癌的增殖 的增殖抑制率要高于HM-3組；多肽III組對胃癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、結(jié)腸癌和宮頸癌的 增殖抑制率要高于HM-3組；多肽IV組對肺癌、肝癌、黑色素瘤的增殖抑制率和HM-3組相當(dāng)。
[0151] 實施例7
[0152] 三維transwell法檢測多肽HM-3抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性
[0153] 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)用含5%胎牛血清和IXECGS的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液，在 37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至90%以上的匯合度時，采用transwell法檢測HM-3的抑制 內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性，內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC只用第2-8代，具體操作如下：
[0154] 用 10mg/mL MatrigelMatrigel 膠用 DMEM培養(yǎng)基以 1:4 稀釋，涂布于 transwell 小 室膜上，室溫風(fēng)干。
[0155] 將培養(yǎng)到對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞用0. 2% EDTA消化，收集，用PBS洗滌兩次后 用含有0. 1% BSA的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液重懸。在顯微鏡下計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整到IX 105個 /mT,n
[0156] 配制各組的試驗用液，用含0. 1% BSA的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋到100 μ L。
[0157] 分組如下：
[0158] 空白對照組：為不含藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液。
[0159] 恩度組：為用不含藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液將5mg/mL的恩度藥液稀釋到預(yù)定濃度。
[0160] 多肽I -X組：為用不含藥物的細(xì)胞培養(yǎng)液將多肽I -X稀釋到10 μ g/mL。
[0161] 將細(xì)胞接種到transwell小室中，每孔100 μ L，并且將各組試驗用液加入小室中。 24孔板中加入0. 6mL含5%胎牛血清和1XECGS的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液刺激細(xì)胞遷移，于5% C02,37°C 孵育 24h。
[0162] 棄去孔中培液，用90%酒精常溫固定30min，0. 1%結(jié)晶紫常溫染色lOmin，清水漂 凈，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞，顯微鏡下觀察并選擇四個視野拍照計數(shù)。按照公式計 算遷移抑制率（migration inhibition，MI): Ntest
[0163] MI (%) = 1 ---X 100% Ncontrol
[0164] 其中Ntest為測試組的細(xì)胞遷移數(shù)，Ncontrol為空白對照組的細(xì)胞遷移數(shù)。
[0165] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計：
[0166] 試驗獨立重復(fù)3次，試驗得到的結(jié)果計算mean土SD，并進(jìn)行統(tǒng)計t-test檢驗， P〈0. 05為顯著性差異，P〈0. 01為極顯著性差異。實驗結(jié)果見表9。
[0167] 由實驗結(jié)果可見在多肽I、多肽II、多肽III和多肽HM-3的作用下，遷移的內(nèi)皮細(xì) 胞數(shù)與陰性對照相比顯著減少，多肽I、多肽II、多肽III和多肽HM-3能抑制5%的胎牛血清 及ECGS誘導(dǎo)的HUVEC的遷移作用，抑制率為71. 95 %、73. 68 %、70. 27 %、68. 10 %，對細(xì)胞遷 移的抑制率與陰性對照相比有極顯著性的差異（P〈〇. 01);在多肽IV、多肽V、多肽VI的作 用下，遷移的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)與陰性對照相比減少，抑制率為61. 78 %、65. 19 %、61. 57 %，對細(xì) 胞遷移的抑制率與陰性對照相比有顯著性的差異（P〈〇. 05);多肽W、多肽IV、多肽X在該 劑量下對HUVEC的遷移作用比較弱，沒有前面多肽的抑制效果好，與陰性組對照沒有顯著 性差異。
[0168] 表9多肽I 一X對HUVEC的遷移抑制
[0169] 多肽序列 遷移細(xì)胞數(shù) Ml (%) Mt HM-3 414.75±44.(M) 68.10** 多肽 1 402.73±34.00 71.95? 多肽 II 373.67±75.51 73.68** 多肽 m 396.45±65.00 70,27** 多肽 IV 468.67 士 15,82 61.78* 多肽 V 433.87±25.03 65.19* 多肽 VI 457.67±67,54 61,57* 多肽 VII 786.19±46,04 35.86 多肽Μ 82436±56.39 27.87 多肽 IV 1012.36±45.81 10.75 多肽)（ 1385.30*67.54 4,87 Taxol 346.67± 160.81 76.70** 1488.00±485.72 0.00
[0170] a:a:*p〈0. 05, **P〈0. Olvs. the control group ;ES:endostar。
[0001] 氨基睡或核苷81序到表 SEQUENCE LISTING <11〇> lfe'.d: Λ'+1+'.物科技?/阪公 _J <120> 整介尜阻丨新劑名肽及K W備方法_川途 <130> <160> 10 <170> Patentln version 33 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> 人.1:斤:列 <400> 1 Val-Arg-Arg-AIa-Asp-Arg-AIa-AIa-Val-Pro-Gly-Giy-Gly-GIy-Arg-GIy-Asp 1 5 10 IS 17 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Α?::ΓΡ 列 <400> 2 Arg~Arg~Aia~Asp~Arg*-AIa~Ala~Val*-Pro~61y~Glv~GIy~61y~Arg~61y~Asp 1 5 10 15 16 <210> 3 <211> 15
[0002] <212> PRT <213>入工序列 <400> 3 Arg-Ala-Asp-Arg-AIa-Ala-Val-Pro-GIy-GIy-Gly-Gly-Arg-GIy-Asp 1 5 10 15 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213>人:1:汴列 <400> 4 AIa~Asp~Arg-AIa~AIa~VaI-Pro-GIy~Giy~Gly-GIy-Arg-GIy-Asp 15 10 14 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213>人:1:序列 <400> 5 Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-GIy-GIy-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp 1 5 10 13 <210> 6 <211> 12 <212> PRT
[0003] <2i3> 人 1:1-1:列 <400> 6 Arg-A! a -Al a -￥a i-P ro-G i y-G I y-G I y-G I y-A rg-G ly-As p 1 5 10 12 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213>人:丨:卟列 <400> 7 Ala-Ala-Val-Pro-Giy-Gly-Gly-Gly-Arg-GIy-Asp 1 5 10 11 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213>人丨:印列 <400> 8 Ala-Val-Pro-Gly-GIy-Gly-Gly-Arg-GIy-Asp 1 5 10 <210> 9 9 <212> PRT <213>人.丨:汴列
[0004]
【權(quán)利要求】
1. 整合素阻斷劑多肽，其所述的多肽的氨基酸序列為下列中的一種： 多膚 I Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-As P ; 多膚 II Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ; 多膚III Arg-Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ; 多膚IV Ala-Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ; 多膚 V Asp-Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ; 多膚VI Arg-Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ; 多膚W Ala-Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ; 多膚VDI Ala-Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ; 多膚IX Val-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ; 多膚 X Pr〇-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp。
2. 權(quán)利要求1所述的整合素阻斷劑多肽的制備方法，其特征在于：所述多肽采用固相 合成方法合成，所述固相合成方法是其以wang resin為起始原料，然后用保護氨基酸依次 接一肽至八、九、十至十七肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得多肽粗品， 將粗品進(jìn)行純化，首先溶解，然后用制備型高效液相經(jīng)過兩次純化，最后濃縮凍干得到純 品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的整合素阻斷劑多肽，其特征在于：所述固相合成方法制得的 多肽純度均大于95%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的整合素阻斷劑多肽在制備治療關(guān)節(jié)炎、抑制新生血管眼部疾 病、抑制腫瘤細(xì)胞增值或抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的活性藥物中的用途。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的整合素阻斷劑多肽的用途，其特征在于：所述整合素阻斷劑 多肽在佐劑誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎動物模型能發(fā)揮體內(nèi)免疫保護作用，對AA大鼠關(guān)節(jié)炎具有治 療作用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的整合素阻斷劑多肽的用途，其特征在于所述抑制新生血管的 作用為對角膜新生血管的抑制作用；對虹膜新生血管的抑制作用；對脈絡(luò)膜新生血管的抑 制作用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的整合素阻斷劑多肽的用途，其特征在于所述對角膜抑制新生 血管的作用，多肽I、多肽II和多肽III整合素阻斷劑均能夠極顯著抑制角膜新生血管的生 長，多肽IV、多肽V和多肽VI整合素阻斷劑能夠顯著的抑制角膜新生血管的生長；對虹膜新 生血管的抑制作用，多肽I 一多肽X能夠抑制新生血管形成并使已形成的血管退化，其中 多肽I 一多肽III與陰性組相比新生血管的消退很明顯，治療效果優(yōu)于多肽IV-多肽X ;多 肽I一多肽W能夠有效的治療脈絡(luò)膜新生血管。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的整合素阻斷劑多肽的用途，其特征在于多種腫瘤細(xì)胞增值的 抑制為對胃癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤和宮頸癌、前列腺癌、結(jié)直腸 癌、卵巢癌、鼻咽癌增殖具有抑制作用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的整合素阻斷劑多肽的用途，其特征在于：所述內(nèi)皮細(xì)胞為 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，所述人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞用含5%胎牛血清和1XECGS的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 液；多肽I、多肽II、多肽III能抑制5 %的胎牛血清及ECGS誘導(dǎo)的HUVEC的遷移作用，抑制 率均大于68. 10%，對細(xì)胞遷移的抑制率與陰性對照相比有極顯著性的差異（P〈0. 01);在 多肽IV、多肽V、多肽VI的作用下，遷移的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)與陰性對照相比減少，抑制率均大于 60. 57 %，對細(xì)胞遷移的抑制率與陰性對照相比有顯著性的差異（P〈0. 05)。
【文檔編號】C07K1/04GK104059132SQ201410324306
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年7月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月8日
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