專利名稱：一種提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，屬于微生物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
普海茶(Pu-erh tea)以云南的大葉茶(C sinensis var. assamica)等大葉種茶的曬青毛茶(普洱青茶，Pu-erh green tea)為原料，經(jīng)過后發(fā)酵工藝生產(chǎn)而成的散茶和緊壓茶?，F(xiàn)代普洱茶生產(chǎn)工藝中渥堆發(fā)酵是生產(chǎn)普洱茶的關(guān)鍵工序，其生產(chǎn)過程中的微生物種類和數(shù)量直接影響普洱茶風(fēng)味的形成，因此，微生物在普洱熟茶的渥堆發(fā)酵中起著重要的作用。然而，目前以形態(tài)學(xué)和生理生化指標(biāo)為主要指標(biāo)的檢測和分類方法由于受到培養(yǎng)條件和模擬培養(yǎng)技術(shù)的限制，實(shí)際上所能檢測到的微生物與實(shí)際上含有的微生物還有較大的差別。近些年，以DNA為主要指針研究環(huán)境中微生物的群落組成及基因功能能直接從分子水平對微生物進(jìn)行研究。如何獲得完整的、純度高的普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA是對普洱茶中微生物分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。但是由于普洱茶茶葉本身含有很復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，在渥堆過程中在微生物的作用下使普洱茶的成分轉(zhuǎn)化分解的更為復(fù)雜，無機(jī)與有機(jī)化合物繁多，茶多酚、茶多糖、茶色素等交織混合，加之生產(chǎn)過程粗獷，金屬離子等都存在其中，這些因素都嚴(yán)重的影響普洱茶微生物總DNA的高質(zhì)量提取。因此，建立普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的提取工藝對研究其微生物分子生物學(xué)研究、普洱茶品質(zhì)的提升及普洱茶生產(chǎn)工藝的改進(jìn)都有重要意義。目前對普洱茶微生物總DNA的提取的主要問題就是微生物以普洱茶茶葉為底物進(jìn)行復(fù)雜的次生代謝，微生物表面甚至體內(nèi)都粘附殘存有大量的茶多酚、茶多糖、醌類等，使得提取較高質(zhì)量的微生物總DNA非常困難。按照目前的方法提取出的普洱茶微生物總DNA，提取過程難以避免茶多酚、醌類等與DNA結(jié)合，提取出來的DNA雜質(zhì)含量偏高，不能直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增等后續(xù)分子生物學(xué)的研究；目前的方法還存在提取過程中細(xì)胞裂解率不充分，DNA與茶多酚、醌類等結(jié)合導(dǎo)致提取過程中損失過大等，導(dǎo)致提取率偏低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，該方法通過對普洱茶樣品震蕩洗滌，分離并洗滌微生物，減少茶多酚，醌類，金屬等對DNA提取的影響，獲得高純度，大片段的微生物總DNA，提取出的DNA能直接用于PCR等后續(xù)分子生物學(xué)的研究。本發(fā)明提供的普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的提取方法包括以下步驟
(I)樣品的預(yù)處理取l_3g普洱茶渥堆發(fā)酵過程中的茶葉，剪碎至0. 5-lcm，在茶葉中
加入20-30mL洗滌緩沖液，靜置20min后，超聲波清洗儀中震蕩處理10_15min，再渦旋震蕩45-60s,取上清液；將上清液置于60-70°C水浴處理3_9min，低速離心后，取上清液高速離心收集菌體，在菌體中加入5-10mL洗滌緩沖液，混勻，再在60-70°C水浴處理3_9min，高速離心收集菌體；重復(fù)上述洗滌過程2-3次，直到菌體顏色接近白色，離心沉淀后上清液無顏色；
(2)DNA的粗提向步驟(I)中所收集到的菌體中加入液氮，使菌體在液氮的作用下結(jié)成塊狀，充分研磨后，在普洱茶中以I. OmL/g的量加入DNA提取液，繼續(xù)研磨充分后，加入蛋白酶 K，55°C水浴處理30min，60-701水浴處理45 60min ;然后加入等體積的的氯仿-異戊醇混合液，搖勻后IOOOOg離心lOmin，回收水相，重復(fù)提取一次；在回收的水相中加入水相等體積的異丙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后-20°C放置30-45分鐘，1300(Tl5000g離心15 20分鐘，沉淀用體積百分比濃度為75%的乙醇洗滌2次，室溫干燥后，加入50 150 ii LddH2O,即得粗提的DNA溶液；
(3)DNA的純化在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶，37°C水浴l_2h，用雙蒸水稀釋至500 u L后，加入等體積Tris飽和酹,充分混勻，室溫下IOOOOg離心IOmin,回收水相并在其中加入等體積的氯仿-異戍醇混合液，充分混勻，室溫下IOOOOg離心IOmin,回收水相，在回收的水相中加入2倍水相體積的無水乙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后_20°C放置20-30分鐘，最后在1300(Tl5000g下離心15 20分鐘，取沉淀室溫干燥后，力口A 50-150 u LddH2O,即得純化后的 DNA。本發(fā)明中所述洗滌緩沖液為含有8(Tl00mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，2(T50mM乙二胺四乙酸二鈉，I 2%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮，0.05 0. 1%(V/V)吐溫20 ,Tl. 5M NaCl,PH為7. 5^8. 0的溶液；
本發(fā)明中所述低速離心是指10(T200g離心2min,高速離心是指600(T8000g離心6 8min。本發(fā)明中所述DNA提取液是含有8(Tl00mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，2(T50mM乙二胺四乙酸二鈉，I I. 5M NaCl, T2% (W/V)十六烷基三甲基溴化銨和I 2% (V/V)0-巰基乙醇的混合溶液。本發(fā)明中所述蛋白酶K的添加量為0. 05^0. lmg/mL。本發(fā)明中所述氯仿-異戊醇混合液是氯仿和異戊醇按體積比24 1混合的溶液。本發(fā)明中所述RNaseA酶在粗提DNA溶液中的添加量為0. 25 0. 5mg/ mL。本發(fā)明中所述的普洱茶樣本為任何工藝規(guī)模下渥堆發(fā)酵過程中的普洱茶熟茶。本發(fā)明在提取DNA之前，對渥堆發(fā)酵過程中的普洱茶樣品剪碎，加入洗滌緩沖液靜置一段時(shí)間，有助于增加普洱茶吸水膨脹，增加與洗滌緩沖液接觸面積，更好的使菌體洗滌出來；在對分離出的菌體進(jìn)行洗滌去除與菌體表面附著的茶多酚、茶色素等代謝產(chǎn)物的時(shí)候，使用渦旋震蕩與水浴相結(jié)合的方法，渦旋震蕩使洗滌緩沖液高強(qiáng)度的沖刷菌體表面從而有利于分離黏著在菌體表面的茶多酚、茶色素等代謝產(chǎn)物，水浴使分離的菌體在熱作用下，表面附著的茶多酚、茶色素等代謝產(chǎn)物洗滌的更加徹底。本方法分離出的菌體顏色接近白色，提取出的DNA沉淀為白色。本發(fā)明所提取得到的粗提DNA即可達(dá)到PCR的要求，能夠使用細(xì)菌及真菌通用引物進(jìn)行PCR，說明普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物所黏著的茶多酚，茶色素等得到有效的去除，通過本方法獲得的總基因組片段大小為15kb以上，加入RNase A純化后，0D260/0D280=1. 8"
I.9，0D260/0D230=!. 6 I. 7，可以滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需求。
本發(fā)明方法簡單高效，不需要購買試劑盒，所用試劑均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑，提取及純化DNA操作簡單，成本低，DNA提取率高，獲得的DNA完整性好，純度高，不經(jīng)過純化和稀釋即能達(dá)到PCR的要求，純化后DNA能滿足分子生物學(xué)研究的要求，同時(shí)所提取的DNA覆蓋細(xì)菌和真菌，能滿足后續(xù)微生物多樣性和功能基因、宏基因組學(xué)等研究的要求。


圖I為利用本發(fā)明以渥堆發(fā)酵過程中的普洱茶為樣品，所提取的未經(jīng)純化的粗提微生物總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M為15kb Marker ;1、2、3分別為三個(gè)不同發(fā)酵程度的普洱茶樣品的粗提總DNA。圖2為利用本發(fā)明以渥堆發(fā)酵過程中的普洱茶為樣品，所提取的純化后的微生物總DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M是2kb Marker ； 1、2、3分別為三個(gè)不同發(fā)酵程度的普洱余樣品的純化后總DNA。圖3為以本發(fā)明所得未經(jīng)純化的普洱茶微生物的總DNA為模版，PCR擴(kuò)增的16SrDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M是15kb Marker ;1、2、3分別是以三個(gè)樣品的粗提總DNA為模版的細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4以本發(fā)明所得未經(jīng)純化的普洱茶微生物的總DNA為模版，PCR擴(kuò)增的18S rDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M是15kb Marker ;I、2、3分別是以三個(gè)樣品的粗提總DNA為模版的細(xì)菌18S rDNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式下面通過附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中試劑如無特殊說明均為常規(guī)試劑或用常規(guī)方法配制的試劑。實(shí)施例I :本提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，具體操作如下 普洱茶渥堆發(fā)酵的樣品采至正在生產(chǎn)過程中的普洱茶生產(chǎn)車間，采樣點(diǎn)為普洱茶堆表
面以下3cm處，多點(diǎn)采樣混勻?yàn)镮個(gè)樣品(編號(hào)為1)，取樣時(shí)間為渥堆發(fā)酵10天(為一翻過后3天)，堆芯溫度64°C，含水量為23. 88%。(I)樣品的洗漆每個(gè)樣品稱取3g普海茶樣品,剪碎至0. 5-lcm間大小,轉(zhuǎn)入50mL離心管中，向樣品加入30mL洗滌緩沖液，靜置20min，超聲波清洗儀中震蕩lOmin，渦旋震蕩60s后，取上清液；將上清液置于60°C水浴處理9min，IOOXg離心2min，收集上清液，上清液6000 X g離心8min，棄上清，在菌體沉淀中加入IOmL洗滌緩沖液，混勻后轉(zhuǎn)入IOmL離心管中，潤旋震蕩混勻，再在65°C水浴處理6min,6000g離心8min收集菌體,按照此方法重復(fù)洗滌2次菌體，洗滌至所得菌體顏色接近白色，離心沉淀后上清液無顏色；
(2)DNA的粗提向步驟(I)中所收集到的菌體中加入液氮，使沉淀在液氮的作用下結(jié)成塊狀，置于研缽中，加入液氮充分研磨后，在普洱茶中以I. OmL/g的量加入DNA提取液，繼續(xù)研磨充分后，提取液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入蛋白酶K (蛋白酶K的添加量為0. 05mg/mL),在55°C下水浴處理30分鐘，60°C水浴60分鐘；然后加入等體積的的氯仿-異戊醇混合液(體積比24 :1)，搖勻后以IOOOOg離心lOmin，回收水相于新的離心管中，重復(fù)提取一次；在回收的水相中加入水相等體積的異丙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后-20°C放置45分鐘，15000 Xg下離心15分鐘，沉淀用體積百分比濃度為75%的乙醇洗滌2次，室溫干燥后，加入150 u LddH20,即得粗提的DNA溶液；
(3)DNA的純化在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶(添加量為0. 25mg/ mL), 37°C水浴60min,用雙蒸水稀釋至500 u L后加入等體積Tris飽和酹,充分混勻，室溫下IOOOOg離心lOmin，回收水相于新離心管中，加入等體積氯仿-異戊醇混合液(體積比24 :1)，充分混勻，室溫下IOOOOg離心lOmin，回收水相于新離心管中，在回收的水相中加入2倍水相體積無水乙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后_20°C放置30分鐘，最后在15000 Xg下離心15分鐘，取沉淀室溫干燥后，加入150 u LddH2O,即得純化后的的DNA。應(yīng)用于本實(shí)施例中的洗滌緩沖液為含有IOOmM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，50mM乙二胺四乙酸二鈉，1% (W/V)聚乙烯吡咯烷酮，體積百分百0. 05% (V/V)吐溫20，I. 5MNaCl，pH為8.0的溶液;
DNA提取液為含有IOOmM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，20mM乙二胺四乙酸二鈉，I. 5MNaCl，2% (W/V)十六烷基三甲基溴化銨，1% (V/V) P -巰基乙醇的混合溶液；
分別對未純化的粗提DNA和純化后的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用的瓊脂糖電泳濃度為0. 8% (W/V)，電泳緩沖液為1XTAE，Marker最大條帶為15kb，所使用的核酸染料為bioteke核酸染料GL0DVIEW，結(jié)果分別為圖I泳道1，圖2泳道I。分別使用細(xì)菌16S rDNA、真菌的18 rDNA序列中保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并檢測結(jié)果，操作步驟如下
選擇細(xì)菌的 16S rDNA 擴(kuò)增通用引物 27F (5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3)和 1492R (5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物間隔長度約1500bp。20 ii L的PCR反應(yīng)體系為0. 5 ii L未經(jīng)純化的DNA為模版，250 U M dNTP each，引物 0. Iii M，10 X Buffer (with MgCl2) 2 ii L，TaqDNA 聚合酶 1U，加去離子水補(bǔ)足至 20 U L,擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C退火35s，72。。延伸1.5min，32個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 7min。選擇真菌的18S rDNA 擴(kuò)增通用引物 ITS3: (5-GCATCGATGACGCAGC -3)和 ITS4 :(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物間隔長度約300bp，
20 ii L的PCR反應(yīng)體系為0. 5 ii L未經(jīng)純化的DNA為模版，250 ii M dNTP each，引物
0.Iii M，10 XBuffer (with MgCl2) 2 ii L，TaqDNA 聚合酶 1U，加去離子水補(bǔ)足至 20 yL，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30min，32個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，DNA分子標(biāo)記采用大小為2000bp的Maker，其余方法按照上述微生物總DNA的瓊脂糖電泳方法進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果圖3泳道I、圖4泳道I。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA結(jié)果(見圖I泳道1，圖2泳道I)表明，所提取的DNA完整性好；經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)菌通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果(圖3泳道I)與真菌通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果(圖4泳道1)，表明分別在1500bp和300bp左右有明顯的擴(kuò)增條帶，符合細(xì)菌和真菌的特征條帶，表明該方法提取的微生物總DNA能同時(shí)提取出普洱茶渥堆發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌的總DNA，同時(shí)驗(yàn)證該種方法所提取的DNA即使沒有后面 的純化步驟和稀釋步驟依然能達(dá)到PCR反應(yīng)的要求；此外，純化后的DNA經(jīng)過紫外分光光度儀上測定0D260/0D280=1. 87,0D260/0D230=!. 65，表明純化后所提取的DNA純度高，雜質(zhì)含量少，提取的DNA可以滿足分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)需求。
實(shí)施例2 :本提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，具體操作如下
普洱茶渥堆發(fā)酵的樣品采至正在生產(chǎn)過程中的普洱茶生產(chǎn)車間，采樣點(diǎn)為普洱茶堆表面以下3cm處，多點(diǎn)采樣混勻I個(gè)樣品(編號(hào)為2)，取樣時(shí)間為渥堆發(fā)酵20天(為二翻過后4天)，堆芯溫度63 °C，含水量為23. 24%。(I)樣品的洗漆每個(gè)樣品稱取Ig普海茶樣品，剪碎至0. 5-lcm間大小,轉(zhuǎn)入50mL離心管中，向樣品加入20mL洗滌緩沖液，靜置20min，超聲波清洗儀中震蕩15min，渦旋震蕩45s后，取上清液；將上清液置于70°C水浴處理3min，200Xg離心lmin，收集上清液，上清液8000 X g離心6min，棄上清，在菌體沉淀中加入5mL洗滌緩沖液，混勻后轉(zhuǎn)入IOmL離心管 中，潤旋震蕩混勻，再在70°C水浴處理3min,8000g離心6min收集菌體,按照此方法反復(fù)洗滌菌體3次，洗滌至所得菌體顏色接近白色，離心沉淀后上清液無顏色；
(2)DNA的粗提向步驟(I)中所收集到的菌體中加入液氮，使沉淀在液氮的作用下結(jié)成塊狀，置于研缽中，加入液氮充分研磨后，在普洱茶中以I. OmL/g的量加入DNA提取液，繼續(xù)研磨充分后，提取液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入蛋白酶K (添加量為0. lmg/mL)，在55°C下水浴處理30分鐘，70°C水浴45分鐘；然后加入等體積的的氯仿-異戊醇混合液(體積比24 :1)，搖勻后以IOOOOg離心lOmin，回收水相于新的離心管中，重復(fù)提取一次；在回收的水相中加入水相等體積異丙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后-20°C放置30分鐘，13000 X g下離心20分鐘，沉淀用體積百分比濃度為75%的乙醇洗滌2次，室溫干燥后，加入50 u LddH20,即得粗提的DNA溶液；
(3)DNA的純化在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶(添加量為0. 5mg/ mL), 37°C水浴120min,用雙蒸水稀釋至500 ii L后加入等體積Tris飽和酹,充分混勻，室溫下IOOOOg離心lOmin，回收水相于新離心管中，加入等體積氯仿-異戊醇混合液(體積比24 :1)，充分混勻，室溫下IOOOOg離心lOmin，回收水相于新離心管中，在回收的水相中加入2倍水相體積的無水乙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后_20°C放置20分鐘，最后在13000 X g下離心20分鐘，取沉淀室溫干燥后，加入50 u LddH2O,即得純化后的的DNA溶液。應(yīng)用于本實(shí)施例中的洗滌緩沖液為含有SOmM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，20mM乙二胺四乙酸二鈉，2% (W/V)聚乙烯吡咯烷酮，0. 1% (V/V)吐溫20 ,IM NaCl，pH為7. 5的溶液；
DNA提取液為含有80mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，50mM乙二胺四乙酸二鈉，IM NaCl,1% (W/V)十六烷基三甲基溴化銨，I. 5% (V/V) ￠-巰基乙醇的混合溶液；
分別對未純化的粗提DNA和純化后的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測方法同實(shí)施例1，電泳結(jié)果分別為圖I泳道2，圖2泳道2
分別使用細(xì)菌16S rDNA、真菌的18 rDNA序列中保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用方法同實(shí)施例1，電泳結(jié)果分別為圖3泳道2，圖3泳道2。經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA結(jié)果(見圖I泳道2，圖2泳道2)表明，所提取的DNA完整性好；經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)菌通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果(圖3泳道2)與真菌通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果(圖4泳道2)，表明分別在1500bp和300bp左右有明顯的擴(kuò)增條帶，符合細(xì)菌和真菌的特征條帶，表明該方法提取的微生物總DNA能同時(shí)提取出普洱茶渥堆發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌的總DNA，同時(shí)驗(yàn)證該種方法所提取的DNA即使沒有后面的純化步驟和稀釋步驟依然能達(dá)到PCR反應(yīng)的要求；此外，純化后的DNA經(jīng)過紫外分光光度儀上測定0D260/0D280=1. 85，0D260/0D230=1. 64表明純化后所提取的DNA純度高，雜質(zhì)含量少，提取的DNA可以滿足分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)需求。
實(shí)施例3 :本提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，具體操作如下
普洱茶渥堆發(fā)酵的樣品采至正在生產(chǎn)過程中的普洱茶生產(chǎn)車間，采樣點(diǎn)為普洱茶堆表面以下3cm處，多點(diǎn)采樣混勻?yàn)镮個(gè)樣品(編號(hào)為3)，取樣時(shí)間為渥堆發(fā)酵30天(為三翻過后5天)，堆芯溫度62 °C，含水量為23. 11%。(I)樣品的洗漆每個(gè)樣品稱取2g普海茶樣品,剪碎至0. 5-lcm間大小,轉(zhuǎn)入50mL離心管中，向樣品加入25mL洗滌緩沖液，靜置20min，超聲波清洗儀中震蕩12min，渦旋震蕩 50s后，取上清液；將上清液置于65°C水浴處理6min，150 Xg離心I. 5min，收集上清液，上清液7000g離心7min，棄上清，在菌體沉淀中加入7mL洗滌緩沖液，混勻后轉(zhuǎn)入IOmL離心管中，渦旋震蕩混勻，再在60°C水浴處理9min，7000g離心7min收集菌體，按照此方法反復(fù)洗滌菌體2次，洗滌至所得菌體顏色接近白色，離心沉淀后上清液無顏色；
(2)DNA的粗提向步驟(I)中所收集到的菌體中加入液氮，使沉淀在液氮的作用下結(jié)成塊狀，置于研缽中，加入液氮充分研磨后，在普洱茶中以I. OmL/g的量加入DNA提取液，繼續(xù)研磨充分后，提取液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入蛋白酶K (添加量為0. 06mg/mL),在55°C下水浴處理30分鐘，65°C水浴50分鐘；然后加入等體積的的氯仿-異戊醇混合液(體積比24 :1)，搖勻后以IOOOOg離心lOmin，回收水相于新的離心管中，重復(fù)提取一次；在回收的水相中加入等體積異丙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后-20°C放置35分鐘，14000 X g下離心17分鐘，沉淀用體積百分比濃度為75%的乙醇洗滌2次，室溫干燥后，加入100 u LddH20,即得粗提的DNA溶液；
(3)DNA的純化在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶(加入量為0. 3mg/ mL)，37°C水浴75min,用雙蒸水稀釋至500 u L后加入等體積Tris飽和酹,充分混勻，室溫下IOOOOg離心lOmin，回收水相于新離心管中，加入等體積氯仿-異戊醇混合液(體積比24 :1)，充分混勻，室溫下IOOOOg離心lOmin，回收水相于新離心管中，在回收的水相中加入2倍水相體積無水乙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后_20°C放置25分鐘，最后在14000 Xg下離心17分鐘，取沉淀室溫干燥后，加入100 u LddH2O,即得純化后的的DNA。應(yīng)用于本實(shí)施例中的洗滌緩沖液為含有90mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，30mM乙二胺四乙酸二鈉，I. 5% (W/V)聚乙烯吡咯烷酮，0. 06% (W/V)吐溫20，I. 2M NaCl,pH為7. 8的溶液；
DNA提取液為含有90mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，30mM乙二胺四乙酸二鈉，I. 2MNaCl，I. 5% (W/V)十六烷基三甲基溴化銨，1% (V/V) ^ -巰基乙醇的混合溶液；
分別對未純化的粗提DNA和純化后的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測方法同實(shí)施例1，電泳結(jié)果分別為圖I泳道3，圖2泳道3
分別使用細(xì)菌16S rDNA、真菌的18 rDNA序列中保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測，所用方法同實(shí)施例1，電泳結(jié)果分別為圖3泳道3，圖3泳道3
經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA結(jié)果(見圖I泳道3，圖2泳道3)表明，所提取的DNA完整性好；經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)菌通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果(圖3泳道3)與真菌通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果(圖4泳道3)，表明分別在1500bp和300bp左右有明顯的擴(kuò)增條帶，符合細(xì)菌和真菌的特征條帶，表明該方法提取的微生物總DNA能同時(shí)提取出普洱茶渥堆發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌的總DNA，同時(shí)驗(yàn)證該種方法所提取的DNA即使沒有后面的純化步驟和稀釋步驟依然能達(dá)到PCR反應(yīng)的要求；此外，純化后的DNA經(jīng)過紫外分光光度儀上測定0D260/0D280=1. 89，0D260/0D230=1. 66表明純化后所提取的DNA純度高，雜質(zhì)含量 少，提取的DNA可以滿足分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)需求。
權(quán)利要求
1.一種提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，其特征在于包括以下步驟 (1)樣品的預(yù)處理取l_3g普洱茶渥堆發(fā)酵過程中的茶葉，剪碎至0.5-lcm，在茶葉中加入20-30mL洗滌緩沖液，靜置20min后，超聲波清洗儀中震蕩處理10_15min，再渦旋震蕩.45-60s,取上清液；將上清液置于60-70°C水浴處理3_9min，低速離心后，取上清液高速離心收集菌體，在菌體中加入5-10mL洗滌緩沖液，混勻，再在60-70°C水浴處理3_9min，高速離心收集菌體；重復(fù)上述洗滌過程2-3次，直到菌體顏色接近白色，離心沉淀后上清液無顏色； (2)DNA的粗提向步驟(I)中所收集到的菌體中加入液氮，充分研磨后，在普洱茶中以I. OmL/g的量加入DNA提取液，繼續(xù)研磨充分后，加入蛋白酶K，55°C水浴處理30min，.60-70°C水浴處理45飛Omin ;然后加入等體積的的氯仿-異戊醇混合液，搖勻后IOOOOg離心lOmin，回收水相，重復(fù)提取一次；在回收的水相中加入水相等體積的異丙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后_20°C放置30-45分鐘，1300(Tl5000g離心15 20分鐘，沉淀用體積百分比濃度為75%的乙醇洗滌2次，室溫干燥后，加入5(Tl50 u LddH2O,即得粗提的DNA溶液； (3)DNA的純化在粗提的DNA溶液中加入RNase A酶，37°C水浴l_2h，用雙蒸水稀釋至500 u L后，加入等體積Tris飽和酹,充分混勻，室溫下IOOOOg離心IOmin,回收水相并在其中加入等體積的氯仿-異戍醇混合液，充分混勻，室溫下IOOOOg離心IOmin,回收水相，在回收的水相中加入2倍水相體積的無水乙醇和1/10水相體積的3M醋酸鈉，混勻后-20°C放置20-30分鐘，最后在1300(Tl5000g下離心15 20分鐘，取沉淀室溫干燥后，力口A 50-150 u LddH2O,即得純化后的 DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，其特征在于洗滌緩沖液是含有8(Tl00mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，2(T50mM乙二胺四乙酸二鈉，I 2%聚乙烯吡咯烷酮，0. 05 0. 1%吐溫20和I I. 5M NaCl，pH為7. 5 8. 0的溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，其特征在于低速離心是指100 200g離心I 2min,高速離心是指6000 8000g離心6 8min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，其特征在于DNA提取液是含有8(Tl00mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，20 50禮乙二胺四乙酸二鈉，ri. 5M NaCl，1 十六烷基三甲基溴化銨和體積百分比2%0 -巰基乙醇的混合溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，其特征在于蛋白酶K的添加量為0. 05、. lmg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，其特征在于氯仿-異戊醇混合液是氯仿和異戊醇按體積比24 1混合的溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，其特征在于RNaseA酶在粗提DNA溶液中的添加量為0. 25 0. 5mg/ mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高質(zhì)量提取普洱茶渥堆發(fā)酵過程中微生物總DNA的方法，本方法包括使用超聲波及渦旋震蕩使普洱茶表面分離微生物；使用洗滌緩沖液對微生物進(jìn)行洗滌；使用DNA提取液對微生物總DNA的粗提，對粗提DNA進(jìn)行純化的步驟。本發(fā)明方法成本低廉，DNA提取率高，提取的DNA完整性好、純度高、不經(jīng)過純化和稀釋即能達(dá)到PCR的要求，純化后DNA能滿足分子生物學(xué)研究的要求，同時(shí)所提取的DNA覆蓋細(xì)菌和真菌，能滿足后續(xù)微生物多樣性和功能基因、宏基因組學(xué)等研究的要求。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102703430SQ20121018025
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月4日
發(fā)明者劉迪秋, 呂昌勇, 熊向峰, 葛鋒, 陳朝銀, 韓本勇 申請人:昆明理工大學(xué)