專利名稱：一種莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及動物疫苗制備技術領域，具體涉及一種莢膜缺失型菌株馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗及其制備方法。
背景技術：
馬鏈球菌獸疫亞種是與動物粘膜和皮膚共生的一種細菌，尤其在馬身上較常見，對許多其他種動物可能引起敗血癥、心內膜炎和關節(jié)炎，如牛、豬、羊、狗。在中國，馬鏈球菌獸疫亞種是引起豬鏈球菌疾病的一個重要的病原體，1975年，在四川爆發(fā)豬鏈球菌流行性疾病，致300000頭豬死亡，導致巨大的經濟損失。到目前為止，我國養(yǎng)豬行業(yè)仍然受到這種疾病困擾。馬鏈球菌獸疫亞種對整個世界養(yǎng)豬行業(yè)構成嚴重威脅，但目前還沒有有效的防治方法，因此研制有效疫苗預防馬鏈球菌獸疫亞種感染是非常必要的。然而，關于這種病原的毒性因子研究太少，從而阻礙弱毒疫苗的研發(fā)，現有技術中研究較多的只有類M蛋白質(SzP)。最近，有研究者經過敲除編碼SzP的基因成功構建了一個馬鏈球菌弱毒疫苗株AATCC35246,并發(fā)現可以使得小鼠免受致死性攻擊。這一研究成果給鏈球菌疫苗研究方向提供重要線索，為探索鏈球菌其他潛在的毒性因子作為弱毒疫苗靶標提供研究方向。馬鏈球菌可以合成由操縱子編碼的透明質酸莢膜，通過對鏈球菌C55138菌株的Aasi 基因經過等位基因置換而使該基因失活，這直接便于研究透明質酸莢膜在該菌的發(fā)病機制中扮演的角色，同時研發(fā)相關的弱毒疫苗。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現有技術中的上述不足，提供一種莢膜缺失型菌株馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗。本發(fā)明的另一目的是提供上述莢膜缺失型菌株馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗及其制備方法的制備方法。本發(fā)明通過以下技術方案實現上述目的
一種莢膜缺失型菌株馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株，名稱為馬鏈球菌獸疫亞種Cbbl^AhasBiStreptococcus equi subsp. zooepi demi cus C55138」Aasi ),本發(fā)明中簡稱為突變菌055138」&^凡于2012年5月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: M 2012164，保藏地址中國.武漢.武漢大學。該突變菌C55138」Aa^由于hasB基因功能缺失而不能正常合成莢膜，馬鏈球菌可以合成由操縱子編碼的透明質酸莢膜，而研究發(fā)現透明質酸莢膜在豬鏈球菌疾病的發(fā)病機制中扮演重要角色，因此這種莢膜缺失型突變菌會大大降低菌株本身的毒性。上述莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株的制備方法，將hasB基因上下游各取部分基因連接到質粒pG+host5上，得到載體認AImsB,轉化馬鏈球菌獸疫亞種C55138，利用同源重組原理將馬鏈球菌獸疫亞種C55138基因組中的hasB基因缺失，構建成莢膜缺失型突變菌C55138」Aa^。作為一種優(yōu)選方案，上述莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株的制備方法具體步驟如下
(1)以馬鏈球菌獸疫亞種C55138的基因組DNA為模板，SEQID NO: Γ2所示核苷酸序列為引物，PCR擴增hasBL基因片段；
(2)以馬鏈球菌獸疫亞種C55138的基因組DNA為模板，SEQID N0:3 4所示核苷酸序列為引物，PCR擴增hasBR基因片段；
(3)將所得的hasBL基因片段和hasBR基因片段連接入質粒pG+hoSt5中，轉化馬鏈球菌獸疫亞種C55138，構建成莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株。
上述莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株在制備疫苗中的應用。一種馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗的制備方法，具體步驟如下
Cl)馬鏈球菌獸疫亞種C55138」Aa^復蘇于TSB中，37°C搖床培養(yǎng)過夜；
(2)取培養(yǎng)過夜的菌種于新的TSB中，37°C搖床擴大培養(yǎng)6 8h；
(3)經擴大培養(yǎng)的菌液在8000rpm條件下離心3min,去上清；
(4)沉淀中的細菌與滅菌的20wt.%脫脂乳混合，冷凍干燥，制備成凍干活疫苗。該凍干活疫苗可以在_20°C低溫冰箱中保存。上述TSB為大豆酪蛋白消化液培養(yǎng)基，可購買已有產品(0X0ID，CM0129)，配方為胰蛋白胨I. 5% (g/100mL)，大豆蛋白胨O. 5% (g/100mL)，氯化鈉O. 5% (g/100mL)，加蒸餾水配制而成，調節(jié)PH值為7.2±0.2，經121°〇壓力蒸汽滅菌后使用。與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果
該馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗具有以下優(yōu)點一、制作工藝簡單，疫苗菌株可大量培養(yǎng)，成本低，周期短，能在全世界推廣使用；二、既表現細胞免疫又有體液免疫；三、用量小，安全性高，毒力小，使用方便。本發(fā)明采用基因工程技術構建莢膜缺失鏈球菌菌株C55138』AasA此菌株毒力減弱。實驗已證明該突變株對小鼠是無毒性的，用其免疫小鼠，小鼠100%得到保護。


圖I.基因在馬鏈球菌獸疫亞種C55138菌株的位點和基因片段，箭頭表示合成基因片段的長度和轉錄方向。圖2.構建缺失型基因載體的方法和原理不意圖。圖3.用PCR和RT-PCR的方法鑒定突變菌C55138Mai的構建結果電泳圖，WT為野生型，AhasB為突變菌。圖4.透射電子顯微鏡觀察野生菌株和突變菌株的結果圖，WT為野生型菌株，莢膜厚而致密，AhasB為缺突變菌株C55138Mai，莢膜缺失。圖5. BALB/c小鼠經過腹腔注射野生菌和突變菌C55138Mai之后的生存曲線。圖6.使用C55138Mai突變菌、滅活的野生菌疫苗(陽性對照)、佐劑(陰性對照)、PBS (空白對照)分別免疫小鼠，然后使用野生菌對四組小鼠分別進行攻毒，攻毒的小鼠持續(xù)觀察12天，每組小鼠存活率。
圖7.使用突變菌C55138Mai免疫小鼠后通過定量PCR的方法檢測到的免疫小鼠脾臟細胞IFN- Y和IL-4的mRNA水平。
具體實施例方式實施例I突變菌株C55138Mai的構建
I.材料馬鏈球菌獸疫亞種C55138，購自中國獸藥監(jiān)察所。質粒pG+hoSt5購自Appligene 公司(Illkirch, France)。2.引物的設計合成
馬鏈球菌獸疫亞種C55138 (簡稱菌株C55138)的基因組結構見附圖I所示，以菌株C55138基因組DNA為模板，使用Primer Premier5. O設計擴增目的片段Aai基因的引物，其中hasBL引物對含有限制性內切酶fe7I和feMlI的酶切位點，hasBR引物對含有和&0RI的酶切位點。引物由上海生工合成。 hasBLl :5’ -ATTTCTGTCGACGGCTCAGGATA-3’ (SEQ ID NO:I)；hasBL2 :5’ -AATGGATCCTGACGCATTTAGGT-3’ (SEQ ID N0:2)；hasBRl :5’ -AACCATTACAATAACGGATCCTTTG-3’ (SEQ ID N0:3)；hasBR2 :5’ -ACAACCCTGTAGCGAATTCCCTC-3’ (SEQ ID N0:4)；
3. PCR擴增目的基因 hasBL基因片段擴增體系(30 μ L) ddH2017. 8μ L
IOXbuffer3. O μ L
Mg2+l.OyL
dNTP3· O μ L
hasBLlI. 5 μ L
hasBL2I. 5 μ L
DNA 模板2· O μ L
rTaq 酶O. 2 μ L
PCR 擴增反應條件95°C 5min，一次；94°C lmin,55°C 45s, 72°C 45s，共 30 個循環(huán)；72°C 5min，一次。得到hasBL基因片段擴增產物。hasBR基因片段的擴增體系(30 μ L) ddH2017. 8μ L IOXbuffer 3. O μ L
Mg2+l.OyL
dNTP3· O μ L
hasBRlI. 5 μ L
hasBR2I. 5 μ L
DNA 模板2· O μ L
rTaq 酶O. 2 μ L
條件95°C 5min，一次；94°C lmin,55°C 45s, 72°C 45s，共 30 個循環(huán)；72°C 5min，一次。得到hasBR基因片段擴增產物。
4.莢膜缺失菌的構建
使用菌株C55138基因組作為模板，步驟3方法擴增得到的hasBL基因片段擴增產物以及質粒pG+host5用限制性內切酶fe7I和消化，消化產物用T4連接酶連接，得到中間重組質粒，該質粒與hasBR基因片段擴增產物再使用限制性內切酶和&0RI消化，消化產物用T4連接酶連接，得到的終產物即為重組質粒pGMai (見附圖2)。沐MasB經過電轉化進入馬鏈球菌獸疫亞種C55138，28°C紅霉素平板上篩選陽性克隆(抗紅霉素的克隆，因為pG+host5有紅霉素抗性)。陽性克隆轉接TSB培養(yǎng)基后生長到對數期時用不含有紅霉素的TSB培養(yǎng)基稀釋后在28°C生長到對數初期。把培養(yǎng)瓶轉移至37°C孵育4h。隨后，把細菌均勻涂布在TSA平板上37°C生長，挑選紅霉素敏感克隆用PCR鑒定。鑒定正確的重組克隆標記為突變菌Mai，于TSB中37°C搖床培養(yǎng)，得到一定濃度菌液后，_80°C冰箱保存。5.莢膜缺失型突變菌的鑒定
分別以野生型馬鏈球菌獸疫亞種C55138 (用WT表示)和步驟4構建的突變菌ShasB(用 AAai 表示)為模板，AhasBl、AhasB2 為引物(AhasBl :ATACGATAACCTTTACCCAAGTCG，SEQID NO: 5 ；AhasB2: AGGTATTCGCAAATAGCTTGACC, SEQ ID NO: 6)，常規(guī) RT-PCR 的方法獲得目的片段，電泳結果(見附圖3)。WT泳道擴增出200bp左右的目的片段，而突變菌Mai和陰性對照的泳道未擴增出目的片段。然后，分別以野生菌C55138與突變菌tshasB的基因組DNA為模板，hasBLl、hasBR2為引物進行PCR擴增，擴增產物的電泳結果見(見附圖3)。WT泳道擴增出1200bp左右的目的片段，突變菌MiasB的泳道擴增出800bp左右的目的片段。綜合RT-PCR與PCR的實驗結果，可以表明突變菌株Mai的Aai基因缺失了400bp左右的基因片段，突變菌株Mai構建成功，命名為C55138Mai，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。6.透射電子顯微鏡觀察菌株胞外莢膜
菌株C55138及突變菌株ShasB樣品經過負染，通過透射電鏡，放大15500 X，加速電壓為80kV觀察細菌莢膜。觀察結果(見附圖4):與野生菌相比，突變菌C55138」Aa^的莢膜缺失。實施例2小鼠毒力實驗
20只4 6周齡BALB/c小鼠，隨機分為2組，一組注射野生菌C55138，另一組注射突變菌C55138Ma·^,用于對比兩種菌株的毒力大小。細菌使用PBS重懸后，菌液適當稀釋到I X IO5 CFU/mL,小鼠腹腔注射500 μ L，觀察小鼠存活狀態(tài)，記錄小鼠的死亡時間，并對結果進行分析，小鼠持續(xù)觀察12天。實驗結果見圖5 :野生菌一組的小鼠9天內死亡率達80%，并表現嚴重的臨床癥狀，突變菌C55138」fei —組小鼠12天內100%存活，且沒有任何臨床癥狀。實驗結果表明突變菌的毒力顯著下降。實施例3突變菌ZlAasS主動免疫保護實驗
把40只4飛周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為4組，每組10只。第I組小鼠，第一次腹腔注射500 μ L突變菌C55138」fei進行免疫，菌液濃度為2X 106CFU/mL，14天后以同樣的劑量再次免疫；第2組小鼠作為陽性對照以同樣的方法注射甲醛滅活的疫苗進行免疫，該滅活苗是滅活野生菌與弗氏佐劑乳化的滅活疫苗，第一次腹腔注射500 μ L，后續(xù)免疫為每2周I次。第3組小鼠使用相同的弗氏佐劑乳化的PBS以同樣的方法注射小鼠作為陰性對照，第4組小鼠使用PBS以同樣的方法注射小鼠作為空白對照。四組小鼠全部免疫完成后，每組小鼠腹腔注射致死劑量的野生菌C55138，觀察每組小鼠的存活率，并記錄結果。
實驗結果見圖6 :由于沒有疫苗的免疫保護，第3組與第4組小鼠在接入致死劑量的野生菌后，5天內全部死亡。第2組小鼠在野生菌滅活疫苗的免疫保護下，存活率達80%。第I組小鼠得到突變菌株C55138」Aa^的免疫保護，直到研究結束小鼠存活率為100%。除此之外，所有陰性對照和空白對照的小鼠都表現出明顯的臨床癥狀，例如被毛粗糙零亂，刺激反應遲緩等現象，然而使用突變菌C55138」Aa^免疫的小鼠沒有表現任何臨床癥狀。實驗結果表明突變菌C55138」Aa^的免疫效果比野生菌滅活疫苗的免疫效果好，經過突變菌055138/1如^免疫過的小鼠抵抗力強，再次受到野毒感染后保護率達到
100% ο實施例4誘導免疫反應類型
T細胞群由兩個亞群組成，分別是Thl亞群和Th2亞群。Thl亞群表達IFN-Y，能夠激活K細胞的細胞毒作用，引起遲發(fā)型超敏反應，介導細胞免疫反應。Th2亞群表達IL-4，促進抗體的產生，引起體液免疫。小鼠經突變菌C55138」Aa^免疫后，可以通過檢測小鼠脾臟細胞內IFN-Y和IL-4的mRNA水平間接評價這兩個細胞亞群的活性。6只BALB/c小鼠隨機分為兩組，一組腹腔注射I X IO6 CFU/mL突變菌ChhUSAhasB,另一組注射PBS，劑量都為O. 5mL。注射96h后，對每只小鼠的脾臟細胞分別提取RNA。使用定量PCR的方法鑒定IFN-Y和IL-4的轉錄水平。實驗結果定量PCR分析結果顯示免疫后96小時的小鼠脾臟細胞中的IL-4和IFN-y mRNA水平顯著增加。除此之外，IFN-Y的mRNA水平顯著高于IL-4的mRNA水平(見附圖7)。實驗結果表明突變菌株Zlfei可以激活小鼠體內Thl和Th2兩個細胞群的免疫反應，同時表現細胞免疫和體液免疫，并且細胞免疫水平顯著高于體液免疫水平。
權利要求
1.一種莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株，名稱為馬鏈球菌獸疫亞種C55138」Aasi {.Streptococcus equi subsp. zooepidemicus C55138」Aasi ), 2012 年 5 月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: M 2012164。
2.權利要求I所述莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株的制備方法，其特征在于^hasB基因上下游各取部分基因連接到質粒pG+hoSt5上，得到載體揭asB，轉化馬鏈球菌獸疫亞種C55138，利用同源重組原理將馬鏈球菌獸疫亞種C55138基因組中的hasB基因缺失，構建成莢膜缺失型突變菌C55138zlAa^。
3.根據權利要求2所述莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株的制備方法，其特征在于步驟如下 Cl)以馬鏈球菌獸疫亞種C55138的基因組DNA為模板，SEQ ID ΝΟ:1 2所示核苷酸序列為引物，PCR擴增hasBL基因片段； (2)以馬鏈球菌獸疫亞種C55138的基因組DNA為模板，SEQID NO:3 4所示核苷酸序列為引物，PCR擴增hasBR基因片段； (3)將所得的hasBL基因片段和hasBR基因片段連接入質粒pG+hoSt5中，轉化馬鏈球菌獸疫亞種C55138，構建成莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株。
4.權利要求I所述莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株在制備疫苗中的應用。
5.一種馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗的制備方法，其特征在于步驟如下 Cl)馬鏈球菌獸疫亞種C55138」Aa^復蘇于TSB中，37°C搖床培養(yǎng)過夜； (2)取培養(yǎng)過夜的菌種于新的TSB中，37°C搖床擴大培養(yǎng)6 8h； (3)經擴大培養(yǎng)的菌液在8000rpm條件下離心3min,去上清； (4)沉淀中的細菌與滅菌的20wt.%脫脂乳混合，冷凍干燥，制備成凍干活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株及其制備方法，屬于動物疫苗制備技術領域。本發(fā)明的莢膜缺失型馬鏈球菌獸疫亞種弱毒疫苗株命名為馬鏈球菌獸疫亞種C55138 hasB(Streptococcusequisubsp.zooepidemicusC55138 hasB)，于2012年5月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2012164。該菌株是通過等位基因置換導致hasB基因失活構建而成，毒力減弱，可用于制備馬鏈球菌疾病的疫苗。疫苗制作工藝簡單，疫苗菌株可大量培養(yǎng)，成本低，周期短；既表現細胞免疫又有體液免疫；用量小，安全性高，毒力小，使用方便，能在全世界推廣使用。
文檔編號C12N1/21GK102719389SQ20121017308
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權日2012年5月30日
發(fā)明者付強, 劉小紅, 莫德林, 陳瑤生, 魏子貢 申請人:中山大學