專利名稱：轉(zhuǎn)基因大豆分子標(biāo)準(zhǔn)樣品、其建立方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的標(biāo)準(zhǔn)樣品制備、其建立方法及其在檢測轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因大豆40-3-2 (Roun dup ready)是Monsanto的產(chǎn)品。在7個轉(zhuǎn)基因大豆品系中GTS40-3-2(Roundup Ready)是目前最多用于食品和飼料的。該品系所改變的性狀為耐除草劑(草甘膦)。在不同國家被批準(zhǔn)食用的時間分別為美國1994年；加拿大、阿根廷、日本、荷蘭、瑞士 1996年；烏拉圭1997年；巴西、墨西哥1998年；俄羅斯1999年；韓國、羅馬尼亞2000年；南非2001年。可供人類食用或動物飼用。近年來，轉(zhuǎn)基因作物培育技術(shù)取得突破進(jìn)展，陸續(xù)推出了ー批新品種，在改善農(nóng)作物品質(zhì)、提高產(chǎn)量等方面發(fā)揮了巨大作用。然而，人們對轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題存在著很多的爭論。轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)風(fēng)險、可能帶來的環(huán)境問題、作為食品對人體健康影響的問題、產(chǎn)品加貼標(biāo)簽問題、運輸問題、國際貿(mào)易問題、知識產(chǎn)權(quán)問題等已引起世界廣泛性的關(guān)注。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問題已由學(xué)術(shù)觀點分岐，發(fā)展到知識產(chǎn)權(quán)、環(huán)境問題、經(jīng)濟問題甚至政治問題。歐盟和ー些國家相繼出臺了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理法規(guī)，我國于2002年3月開始實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》及其三個配套管理辦法。2001年，歐盟要求對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識管理，并提出對非轉(zhuǎn)基因食品只要不是有意污染，允許含有1%的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品(閾值)，而不用標(biāo)識。日本、韓國、澳大利亞等不同國家的限量閾值不同，從1°/Γ5%不等。轉(zhuǎn)基因食品的檢測是這些g在保護(hù)生物和生態(tài)安全、維護(hù)消費者權(quán)益、促進(jìn)貿(mào)易和經(jīng)濟健康發(fā)展的法規(guī)和政策的基本依據(jù)，其標(biāo)準(zhǔn)化將為制訂、實施和改進(jìn)這些法規(guī)和政策提供有力保證。國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因食品的檢測研究剛剛起步，許多問題都有待解決，標(biāo)準(zhǔn)樣品則是該領(lǐng)域尚未解決的重要問題。開展轉(zhuǎn)基因成分檢驗標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制在保證測試結(jié)果的可比性和溯源性、保障食品安全、解決貿(mào)易爭端，促進(jìn)經(jīng)濟發(fā)展等方面均具有重要的意義。更為嚴(yán)峻的問題是目前國外僅有轉(zhuǎn)基因大豆粉、轉(zhuǎn)基因玉米粉M0N810等少數(shù)幾個品種的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，價格非常昂貴，手續(xù)繁多，周轉(zhuǎn)時間長，不能適時地滿足檢驗檢疫工作的需要；日本正在加緊研制轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測的分子參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量檢測；2005年，國內(nèi)研制成功了轉(zhuǎn)基因大豆粉國家ニ級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，填補了我國在轉(zhuǎn)基因成分檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品方面的空白，但轉(zhuǎn)基因油菜籽、轉(zhuǎn)基因玉米、轉(zhuǎn)基因棉花籽等標(biāo)準(zhǔn)樣品以及分子標(biāo)準(zhǔn)樣品仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于國內(nèi)轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)樣品緊缺的狀況，我們研制了轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系分子標(biāo)準(zhǔn)樣品，以及轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR檢測試劑盒，包括轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2檢測基因和陽性標(biāo)準(zhǔn)對照品，本項標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備及檢測試劑盒的制備完成，對全面深入的研究解決轉(zhuǎn)基因成分檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)和穩(wěn)定性保證技術(shù)，對我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，添補該測量領(lǐng)域的空白，具有很重要的現(xiàn)實意義。采用PicoGreen DNA熒光定量法進(jìn)行了合作定值。分別對轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了 6次的重復(fù)測試。經(jīng)Grubbs檢驗和Cochran檢驗，所有數(shù)據(jù)均可作為定值依據(jù)；經(jīng)正態(tài)性檢驗，這些數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系簡介轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2所含的外源基因有耐除草劑基因CP4EPSPS，由CaMV35S啟動子和NOS終止子調(diào)控。質(zhì)粒圖譜為lPECaMV35^|CTP2l^|nativeCP4-EPSPS|^|NOS!l
本發(fā)明通過以下技術(shù)路線實現(xiàn)本發(fā)明的一方面在于轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2標(biāo)準(zhǔn)樣品，其按照如下方法制備①以轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的基因組為模板，分別以SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5為引物，PCR擴增，得到兩個目的片段;PCR 擴增條件94°C 預(yù)變性 3. Omin ;94°C 變性 O. 4min，55°C 退火 lmin，72°C 延伸Imin, 35 個循環(huán)；72°C 5min ；②將步驟①擴增的兩個目的片段通過人工合成連接在一起之后，再連入質(zhì)粒載體PMD19-T中；并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌株；③將步驟②獲得的重組菌株提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序鑒定，鑒定結(jié)果以堿基序列中包含序列SEQ ID NO 7的質(zhì)粒所對應(yīng)的重組菌株為陽性菌株；④大量提取步驟③所述陽性菌株的質(zhì)粒，用Hind-III限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化后分裝，獲得轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2標(biāo)準(zhǔn)樣品。本發(fā)明中所述的人工合成的方法是指送到能夠合成基因片段的公司，委托合成目的片段。本發(fā)明中所述的測序也是委托專業(yè)的測序公司完成的，另外，本發(fā)明中所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的方法，提取重組菌株的質(zhì)粒的方法，以及用Hind-III限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化的方法均為常規(guī)技術(shù)，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的共知常識。本發(fā)明的另一方面在于ー種轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR檢測試劑盒，包括轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2檢測基因和陽性標(biāo)準(zhǔn)對照品I .轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2檢測基因，包括GTS 40-3-2品系特異性的引物和探針序列正向引物5’-TAG CAT CTA CAT ATA GCT TC-3，(即 SEQ ID NO 1)反向引物5’-GAC CAG GCC ATT CGC CTC A-3，(即 SEQ ID NO 2)探針5’-FAM-ACA AAA CTA TTT GGG ATC GGA GAA GA-TAMRA-3，(即 SEQ IDNO 3)大 內(nèi)源Lectin基因的引物和探針序列正向引物5’-CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3，(即 SEQ ID NO 4)反向引物5’-GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3，(即 SEQ ID NO 5)探針5’-FAM-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC-TAMRA-3’(即 SEQ ID NO 6)其中FAM 為 6-carboxyfluorescein, TAMRA 為D-carboxytetramethyIrhodamme ；II .所述的陽性標(biāo)準(zhǔn)對照品是上文所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2標(biāo)準(zhǔn)樣品。
本發(fā)明中，上述檢測試劑盒中，采用了開放式的描述形式，其含義是均未限定檢測試劑盒中的其他緩沖液等成分，因其可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)確定，并通過配置或商業(yè)途徑購買獲得，檢測試劑盒的使用方法和檢測條件，技術(shù)人員可以依據(jù)實施例中所列條件做參考依據(jù)進(jìn)行調(diào)整。這些關(guān)于制劑方式和方法的選擇，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從現(xiàn)有技術(shù)中得到充分的啟示，本發(fā)明不再贅述。試劑盒的使用方法是以待測樣品的基因組為模板，利用轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2檢測基因，經(jīng)過Real-Time PCR反應(yīng)，結(jié)束后確認(rèn)Real-Time PCR的擴增曲線，先制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后可以利用公式計算待測樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量?；蛘咄ㄟ^PCR特異性的引物和探針序列，擴增待測樣品與陽性標(biāo)準(zhǔn)對照品，并將擴增的結(jié)果進(jìn)行比對，確認(rèn)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品種，具體制作 和檢測方法參照實施例。上文所描述的使用方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的方式，以此為例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的公知常識進(jìn)行更多拓展。本發(fā)明的創(chuàng)新特征是我們研制了轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系分子標(biāo)準(zhǔn)樣品，以及轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的Real-Time PCR檢測試劑盒，包括轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40_3_2檢測基因和陽性標(biāo)準(zhǔn)對照品，本項標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備及檢測試劑盒的制備完成，對全面深入的研究解決轉(zhuǎn)基因成分檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)和穩(wěn)定性保證技術(shù)，對我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，添補該測量領(lǐng)域的空白，具有很重要的現(xiàn)實意義及應(yīng)用價值。


圖I :轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系分子標(biāo)準(zhǔn)樣品制備エ藝流程圖；圖2 :目標(biāo)DNA電泳結(jié)果，其中I. Hind-III線性化后的質(zhì)粒DNA ；2.未線性化的質(zhì)粒 DNA;M. AHind-III DNA Marker。圖3 :實時熒光定量PCR分析測定圖，定性分析結(jié)果表明所制備獲得的DNA為轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系的DNA。圖4 :DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為梯度稀釋的λ DNA濃度(ng/ μ L),縱坐標(biāo)為485nm激發(fā)光和535nm發(fā)射光的熒光強度。
具體實施例方式下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系種子來自于美國Monsanto公司。DNA提取試劑和PCR反應(yīng)試劑均購于寶生物工程(大連)有限公司；DNA提取試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司(貨號D9093)；TaqMan Universal Master Mix :購于 ABI 公司；引物和探針寶生物工程(大連)有限公司合成；實時熒光定量PCR儀ABI 7500型；核酸蛋白分析儀日本日立公司。實施例I轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備步驟
I.選擇目標(biāo)DNA片段按照國家標(biāo)準(zhǔn)《轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測核酸定量PCR檢測方法》GB/T 19495. 5— 2004中，轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系定量檢測的品系特異性目標(biāo)基因，確定目標(biāo)DNA片段是轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系特異性基因(大豆基因組DNA與GTS 40-3-2品系特異基因之間的邊界序列)和大豆內(nèi)源Lectin基因。該兩個目標(biāo)DNA片段構(gòu)建在同一個載體質(zhì)粒上。2.轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系目標(biāo)DNA片段克隆質(zhì)粒的構(gòu)建a.基因組DNA的提取采用TaKaRa公司的DNA提取試劑盒 (貨號D9093)，并按其操作說明提取轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系基因組DNA。b.基因組DNA的質(zhì)量檢查①直接法用提取的DNA直接電泳檢查，檢查結(jié)果表明電泳條帶清晰明亮，條帶單一，無雜帶，說明提取的DNA質(zhì)量很好。②紫外分光光度計法用紫外分光光度計來檢測提取DNA的0D23(l、0D26(l、OD28tl光吸收值，結(jié)果0D23(i/0D26(i值小于O. 7，OD26tZOD28tl值在I. 8與2. O之間，結(jié)果表明樣品DNA質(zhì)量很好。c.目標(biāo)基因的擴增①PCR 擴增反應(yīng)體系10 X PCR Buffer 2 μ L, dNTPs (各 2. 5mmol/L) 2 μ L, Ex Taq(5U/yL)0. 2yL，引物(10pmol/yL)各I μ L，步驟a獲得的轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系基因組DNA作為模板DNA (O. 3 6 μ g/ μ L) 2 μ L，用無菌水補充至25 μし②PCR 擴增反應(yīng)條件94°C 預(yù)變性 3. Omin ;94°C 變性 O. 4min，55°C 退火 lmin，72°C延伸Imin, 35個循環(huán)；72°C 5min ;4°C保存。其相應(yīng)的檢測引物和探針信息見表I。表I Taqman探針實時PCR檢測GTS 40_3_2品系目標(biāo)DNA片段的引物和探針序列
信息
權(quán)利要求
1.ー種轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2標(biāo)準(zhǔn)樣品，其特征在于，其按照如下方法制備 ①以轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的基因組為模板，分別以SEQ ID NO U SEQ ID NO :2和SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5為引物，PCR擴增，得到兩個目的片段; PCR 擴增條件94°C 預(yù)變性 3. Omin ;94°C 變性 O. 4min，55°C 退火 lmin，72°C 延伸 Imin，35 個循環(huán)；72°C 5min ； ②將步驟①擴增的兩個目的片段通過人工合成連接在一起之后，再連入質(zhì)粒載體PMD19-T中；并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌株； ③將步驟②獲得的重組菌株提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序鑒定，鑒定結(jié)果以堿基序列中包含序列SEQ ID NO 7的質(zhì)粒所對應(yīng)的重組菌株為陽性菌株； ④大量提取步驟③所述陽性菌株的質(zhì)粒，用Hind-III限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化后分裝，獲得轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2標(biāo)準(zhǔn)樣品。
2.—種轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的Real-Time PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2檢測基因和陽性標(biāo)準(zhǔn)對照品， I.轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2檢測基因，包括 GTS 40-3-2品系特異性的引物和探針序列 正向引物SEQ ID NO 1 反向引物SEQ ID NO 2 探針SEQ ID NO 3 大 內(nèi)源Lectin基因的引物和探針序列 正向引物SEQ ID NO 4 反向引物SEQ ID NO 5 探針SEQ ID NO 6II.所述的陽性標(biāo)準(zhǔn)對照品是權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2標(biāo)準(zhǔn)樣品。
全文摘要
本發(fā)明公開一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的標(biāo)準(zhǔn)樣品制備、其建立方法及其在檢測轉(zhuǎn)基因大豆中的應(yīng)用，以轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2為原料，確定其品系特異性目標(biāo)基因，即轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2品系特異性基因和大豆內(nèi)源Lectin基因，將兩個目標(biāo)DNA片段構(gòu)建在載體pMD19-T上，并將陽性質(zhì)粒用Hind-III酶進(jìn)行線性化處理，最后按310pg/mL定量分裝；通過上述方法獲得轉(zhuǎn)基因大豆GTS 40-3-2的標(biāo)準(zhǔn)樣品，也可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆Real-Time PCR檢測試劑盒。這對深入研究轉(zhuǎn)基因成分檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備技術(shù)和穩(wěn)定性保證技術(shù)，開展轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制具有現(xiàn)實意義。
文檔編號C12Q1/68GK102690835SQ20121017335
公開日2012年9月26日 申請日期2012年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月30日
發(fā)明者徐君怡, 曹冬梅, 曹際娟, 鄭秋月 申請人:徐君怡, 曹冬梅, 曹際娟, 鄭秋月