一種馬腺疫鏈球菌的pcr檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可用于檢測馬腺疫鏈球菌(又稱馬鏈球菌馬亞種)的PCR檢測試劑盒，包括引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其中的上游物是5’-CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是5'-AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3’；PCR檢測方法：提供待測樣品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、10×buffer、引物、DNA聚合酶、待測樣品和ddH2O，混勻；令簿壁管中的混合物在PCR儀上擴(kuò)增；在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物；分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。該P(yáng)CR試劑盒配制方法簡便，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，PCR檢測方法檢測馬腺疫鏈球菌的靈敏度高、檢測周期短、速度快、可操作性強(qiáng)、其檢測精度達(dá)80個(gè)菌的模板DNA，而檢測成本卻相對較低，在該病的臨床診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】—種馬腺疫鏈球菌的PCR檢測試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體內(nèi)容是關(guān)于一種可用于檢測馬腺疫鏈球菌(又稱馬鏈球菌馬亞種)的PCR檢測試劑盒，包括引物、dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其中的上游引物是 5’ -CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是 5’ -AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3，；PCR檢測方法:提供待測樣品模板；在PCR簿壁管中加入dNTP、10 Xbuffer、引物、DNA聚合酶、待測樣品和ddH20，混勻；令簿壁管中的混合物在PCR儀上擴(kuò)增；在電泳設(shè)備中電泳擴(kuò)增產(chǎn)物；分析并進(jìn)行結(jié)果判斷。 技術(shù)背景
[0002]馬腺疫鏈球菌(Streptococcus,equi subsp equi)能夠引起馬腺疫(Stangles),該病在一些發(fā)達(dá)國家流行并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是一種高度接觸性疫病，主要是在馬頸部和頭部出現(xiàn)化膿性淋巴管炎。因此，迫切需要對馬腺疫鏈球菌進(jìn)行究。美、英等國家一直十分重視馬腺疫鏈菌的免疫和診斷研究。隨著我國養(yǎng)馬業(yè)的快速發(fā)展馬腺疫的防制也越來越受重視。
[0003]準(zhǔn)確而快速的診斷是控制疾病的關(guān)鍵，在疾病暴發(fā)時(shí)顯得尤其重要。因?yàn)樵\斷的準(zhǔn)確性決定疾控靶標(biāo)的準(zhǔn)確性，診斷的速度決定疾控響應(yīng)的速度，而疾控響應(yīng)的速度又決定疾病傳播的范圍、疾病控制的成敗和經(jīng)濟(jì)損失的程度。
[0004]馬鏈球菌傳統(tǒng)的診斷方法主要依靠膿汁中病原微生物學(xué)分離、培養(yǎng)和生化試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定。這種方法存在諸多局限性，如馬鏈球菌在生化試驗(yàn)時(shí)往往出現(xiàn)不一致現(xiàn)象，可靠性差。另外檢測周期長，一般至少需要5~7d才能做出結(jié)果，不利于對患馬進(jìn)行及時(shí)治療。
[0005]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多新的分子生物學(xué)技術(shù)正在被用來進(jìn)行鏈球菌的分離鑒定。尤其是PCR技術(shù)近年來在檢測致病菌方面得到了廣泛的應(yīng)用，其具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速、簡便、能高通量檢測、重復(fù)性好等突出優(yōu)點(diǎn)?？傊甈CR技術(shù)的應(yīng)用很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方法的弊端。
[0006]目前國內(nèi)對馬腺疫的診斷方面的研究極少，目前對該菌的檢測仍普遍采用分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清分型的傳統(tǒng)方法，耗時(shí)耗力，不適用生產(chǎn)中對檢測的需求。也有研究采用了 16SrDNA技術(shù)做輔助診斷，該診斷技術(shù)仍需要測序和序列分析進(jìn)行驗(yàn)證，并且特異性不強(qiáng)，使檢測周期延長(陳新華，康立超，黃新等，馬腺疫鏈球菌的分離與鑒定，中國獸醫(yī)雜志，2013 1(49):38-39)，不能滿足目前臨床及生產(chǎn)實(shí)踐中對該病快速簡便準(zhǔn)確的診斷方法的需求。
[0007]發(fā)明目的
[0008]針對目前在馬腺疫的診斷和研究中對于快速簡便診斷方法的需求，本發(fā)明提供了一種馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒。根據(jù)已發(fā)表的馬鏈球菌基因序列，設(shè)計(jì)合成引物，擴(kuò)增得到了 567bp的基因產(chǎn)物。該P(yáng)CR診斷方法與傳統(tǒng)的形態(tài)染色、培養(yǎng)特性和生化鑒定方法相比較，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，并且具有特異性好，靈敏度高的特點(diǎn)，在該病的臨床診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明建立的馬鏈球菌馬亞種PCR診斷方法具有以下特征:
[0010](I)自行設(shè)計(jì)的引物，利用PCR方法擴(kuò)增基因片段，擴(kuò)增上游引物為5-CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是 5’ -AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3’ ；經(jīng)該引物的擴(kuò)增應(yīng)得到567bp的條帶。
[0011](2)對被檢細(xì)菌的基因組的PCR擴(kuò)增。
[0012]將提取馬腺疫鏈球菌基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，得到567bp的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符。
[0013](3)對建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的敏感性檢測。
[0014]取馬腺疫鏈球菌過夜培養(yǎng)物，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將菌液按106，IO5, IO4, IO3等，以10倍系列稀釋，取DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0015](4)建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性的檢測。
[0016]選取金黃色葡萄球菌分離株GW2-1，沙門氏菌，大腸桿菌，以及獸疫鏈球菌等檢測馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性。
[0017]發(fā)明效果
[0018](1)與傳統(tǒng)和現(xiàn)有的馬腺疫檢測方法相比該P(yáng)CR檢測試劑盒的檢測法具有操作簡便的特點(diǎn)。
[0019](2)與傳統(tǒng)和現(xiàn)有的方法相比該P(yáng)CR檢測試劑盒的檢測法具有檢測速度快的優(yōu)點(diǎn)。
[0020](3)該P(yáng)CR檢測試劑盒的檢測法具有靈敏度高的特點(diǎn)。
[0021](4)該P(yáng)CR檢測試劑盒的檢測法具有特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，非常適用于馬腺疫鏈球菌的準(zhǔn)確的檢測與診斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1是馬腺疫鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳結(jié)果圖。
M.DL2000DNAMarker ；1.陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株2.陰性對照3.空白對照
[0023]圖2是馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的敏感性檢測結(jié)果圖。
M.DL2000DNA Marker ；1.1XlO2倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；2.1XlO3倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；3.1 X IO4倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；4.1 X IO5倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；5.1 X IO6倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；6.1 X IO7倍稀釋馬鏈球菌馬亞種基因組；
[0024]圖3是建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性的檢測結(jié)果圖。
M.DL2000DNAMarker ；1.馬鏈球菌馬亞種2.馬鏈球菌獸疫亞種；3.乳酸菌；4.沙門氏
菌；
5.金黃色葡萄球菌25213 ;6.大腸桿菌35218 ;7.大腸桿菌DH5 α ；8.空白對照具體實(shí)施方案[0025]為了更好地理解本發(fā)明，通過以下實(shí)施實(shí)例予以進(jìn)一步說明，但并非對本發(fā)明的限定。
[0026]實(shí)施例1:被檢細(xì)菌基因組的提取及目的基因的PCR擴(kuò)增。
[0027]基因組的提取
[0028]將純化好的菌株接種于3mL的TH液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。具體方法如下:
[0029](I)取過夜培養(yǎng)的1.5mL菌液，離心，棄去培養(yǎng)基，再用滅菌去離子水，400uL旋沉淀，充分混勻后，再次離心，12000rpm, 5min。重復(fù)上述操作一次。
[0030](2)棄去上清后，加入400uL的TE緩沖液，充分混勻后加入IOOuL (20mg/mL)溶菌酶和5uL的RNA酶，再次充分混勻后，37°C水浴lh30min。
[0031](3)加入80uL10% SDS溶液，充分混勻后，37°C水浴lh30min。
[0032](4)加入 100uL5mol/L Nacl 溶液和 80uL CTAB/Nacl 溶液，充分混勻，37°C水浴30min, -20°C放置 20min。
[0033](5)加入500uL酚:氯仿抽提液(酚:氯仿:異戊醇=25: 24: 1，充分混勻，12000rpm，離心lOmin。輕輕的吸取上清，轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中。
[0034](6)重復(fù)(5) —次。
[0035](7)加入0.1倍體積的醋酸鈉(pH = 5.2)和0.6倍體積的異戊醇，輕輕的顛倒混勻，-20°C放置 20min。
[0036](8)離心 12000rpm, IOmin,棄上清，沉淀用 70 % 乙醇 400ul 清洗沉淀，12000rpm,Smin離心，用移液器輕輕的吸出上清，敞開管口，置于室溫，待乙醇揮發(fā)完全。加入20uL的TE緩沖液，充分溶解沉淀，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0037]將提取后的基因組進(jìn)行凝膠電泳鑒定。
[0038]目的基因的PCR擴(kuò)增
[0039]PCR反應(yīng)體系(20uL):滅菌雙蒸水IluL, Taq酶IuL, IOXbuffer 2uL，上游引物0.5uL，下游引物 0.5uL，模板 IuL, dNTP 4uL。
[0040]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min，94°C變性30S，53°C退火30S，72°C延伸90S，循環(huán)30次，72°C延伸10min，4°C保溫。
[0041]如圖1所示PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，可擴(kuò)增得到片段長度約為567bp的陽性產(chǎn)物。
[0042]實(shí)施例2:馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的敏感性檢測。
[0043]如圖2所示取馬腺疫鏈球菌過夜培養(yǎng)物，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將菌液按106，105，IO4, IO3,10倍稀釋，提取DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。對檢測結(jié)果的分析顯示所建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒最小檢測限為80cfu。
[0044]實(shí)施例3:建立的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性的檢測。
[0045]選取金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，大腸桿菌，以及獸疫鏈球菌等檢測馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒的特異性。從圖3中可見，僅馬腺疫鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌的DNA中出現(xiàn)了與目的片段大小一致的條帶，該檢測方法可以用于在馬群中特異性檢測馬腺疫鏈球菌。
【權(quán)利要求】
1.一種用于馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒包括引物，dNTP、緩沖液和DNA聚合酶，其特征在于，其中的上游引物是5’ -CTATTAAAGTCTCCATTG-3’，下游引物是5’-AATGTTGTTCAAGCAAATTC-3?。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的的特異性引物對被檢測的細(xì)菌基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增應(yīng)得到567bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒，該診斷方法應(yīng)當(dāng)具有的敏感性為80個(gè)菌的模板DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒，其特征是該試劑盒對金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，大腸桿菌，以及獸疫鏈球菌等的擴(kuò)增呈陰性結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬腺疫鏈球菌PCR檢測試劑盒包括其在馬腺疫臨床診斷和研究中的應(yīng)用。`
【文檔編號】C12Q1/68GK103555819SQ201310298835
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月17日
【發(fā)明者】蘇艷, 劉云濤, 王彩蝶, 張寶江 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)