采用msap技術(shù)檢測林木木質(zhì)部dna甲基化的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種采用MSAP技術(shù)檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化的方法及試劑盒。其中，該方法包括以下步驟：S1，提取林木木質(zhì)部DNA；S2，分別用EcoRI/HpaII、EcoRI/MspI兩組酶對林木木質(zhì)部DNA進(jìn)行酶切；S3，分別對酶切得到的產(chǎn)物連接上限制性內(nèi)切酶的接頭；S4，以接頭為模板設(shè)計(jì)的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，得PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；S5，將PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后，加入帶有選擇性堿基的篩選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；S6，電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，統(tǒng)計(jì)并分析DNA條帶。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，能夠?yàn)楸碛^遺傳變異研究提供有力的技術(shù)支持，為目標(biāo)的林木分子標(biāo)記輔助育種提供新的候選標(biāo)記位點(diǎn)。
【專利說明】采用MSAP技術(shù)檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化的方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，涉及一種采用MSAP技術(shù)檢測林木木 質(zhì)部DNA甲基化的方法及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 表觀遺傳調(diào)控是不依賴于基因組序列變化，而是通過染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、堿基結(jié)構(gòu)變異 及重塑等作用改變表型的分子遺傳學(xué)機(jī)制，其在基因組防御與基因表達(dá)以及細(xì)胞核遺傳中 發(fā)揮重要作用?；蚪MDNA甲基化是目前為止研究的最為深入的表觀遺傳機(jī)制之一（Dahl and Guldberg，Biogerontology, 2003,4 :233 - 450)，其檢測方法多樣，且發(fā)展迅速，其結(jié)合 的基本方式主要為：甲基化敏感內(nèi)切酶酶切、重硫酸鹽處理甲基化胞嘧啶、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)和生物芯片等。
[0003] 甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（Methylation-sensitive amplification polymorphism, MSAP)技術(shù)是一種比較成熟的、穩(wěn)定可靠的、建立在隨機(jī)片段擴(kuò)增長度多態(tài)性(AFLP)基礎(chǔ) 上的檢測基因組甲基化的分子標(biāo)記手段（Cervera et al.，Mol Genet Genomics，2002,268: 543 - 552)，主要依賴于甲基化敏感內(nèi)切酶酶切和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，無需知曉全基因組序列即 可在全基因組范圍內(nèi)檢測甲基化位點(diǎn)，且成本比重硫酸鹽處理測序、生物芯片技術(shù)低。
[0004] 甲基化敏感內(nèi)切酶酶切原理是利用能識別和切割5' -CCGG位點(diǎn)的同裂酶HpaII 和MspI對基因組進(jìn)行酶切，但二者對甲基化位點(diǎn)敏感程度不一致。HpaII能識別并切 割非甲基化位點(diǎn)和單鏈外側(cè)甲基化位點(diǎn)，不能切割雙鏈甲基化序列；MspI能識別并切割 未甲基化和雙鏈內(nèi)側(cè)胞嘧啶甲基化序列，不能切割單鏈外側(cè)外甲基化序列。若用HpaII 切割電泳后顯示有帶，用MspI切割電泳后沒有帶，則為半甲基化（hemi-methyaltion， CNG);若用HpaII切割電泳后顯示無帶，而用MspI切割電泳后有帶，則認(rèn)為發(fā)生全甲基化 (full-methylation，CG);若用HpaII和MspI切割電泳后均顯示有帶，則認(rèn)為該位點(diǎn)未發(fā)生 甲基化；若用HpaII和MspI切割電泳后均顯示無帶，則認(rèn)為該位點(diǎn)甲基化類型不確定或該 位點(diǎn)為非5' -CCGG序列。CNG和CG之和可以作為總甲基化數(shù)目，各種類型甲基化數(shù)目分 別與總位點(diǎn)數(shù)之比為該種類型甲基化相對水平。因此，MSAP法可以分析全基因組甲基化相 對水平及特異甲基化類型檢測。同時，對這些檢測到的特異甲基化位點(diǎn)可以開展克隆、測序 與序列比對分析等后續(xù)工作。
[0005] 目前，植物DNA甲基化的研究多集中于擬南芥、玉米、水稻物種中，結(jié)果顯示DNA 甲基化在基因表達(dá)調(diào)控、個別基因表達(dá)模式的遺傳等途徑中起著重要的作用（Santos et al·，Brazilian J Medical Biol Res，2005,38:1531 - 1541)?，F(xiàn)在，對林木基因組甲基化 的研究則較少涉及，即使有為數(shù)不多的研究，其材料多使用葉片，但基因組DNA甲基化具有 組織特異性，葉片基因組甲基化狀態(tài)并不能反映整個植株基因組甲基化狀態(tài)，也不能直接 反映出其對林木重要材性性狀的調(diào)控作用，因此，對其DM甲基化位點(diǎn)、相對水平及遺傳 變異進(jìn)行研究尤為迫切和必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種采用MSAP技術(shù)檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化的方法及試劑盒， 以解決現(xiàn)有技術(shù)中沒有穩(wěn)定、高效地檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化方法的技術(shù)問題。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種采用MSAP技術(shù)檢測林木 木質(zhì)部DNA甲基化的方法。該方法是采用MSAP技術(shù)檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化，包括以下 步驟：S1，提取林木木質(zhì)部DNA ;S2,分別用EcoRI/Hpall、EcoRI/MspI兩組酶對林木木質(zhì)部 DNA進(jìn)行酶切；S3,分別對酶切得到的產(chǎn)物連接上限制性內(nèi)切酶的接頭；S4,以接頭為模板 設(shè)計(jì)的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，得PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；S5,將PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后，加入 帶有選擇性堿基的篩選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；S6,電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，統(tǒng)計(jì)并分析DNA條 帶，其中，接頭包括EcoRI接頭和Hpall/MspI接頭，EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2，HpaII/MspI接頭的序列為SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4;預(yù)擴(kuò)增引物包括EcoRI 預(yù)擴(kuò)增引物和Hpall/MspI預(yù)擴(kuò)增引物，EcoRI預(yù)擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO :5, HpaII/ MspI預(yù)擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO :6 ;篩選引物包括EcoRI篩選引物和Hpall/MspI篩選 弓丨物，EcoRI篩選引物序列為SEQ ID NO :7?22, Hpall/MspI篩選引物序列為SEQ ID NO : 23 ?34。
[0008] 進(jìn)一步地，步驟Sl中，提取林木木質(zhì)部DNA選用的是活體林木，活體林木的取樣方 法包括以下步驟：采用利刃將活體林木胸徑處（3?5) cmX (3?5) cm面積樹皮剝離，取 出3?5g木質(zhì)部后將樹皮貼回原處，然后用保鮮膜將傷處包裹，7?10天后去除保鮮膜。
[0009] 進(jìn)一步地，步驟S6中，采用毛細(xì)管熒光電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在Hpall/MspI篩 選引物5'端用熒光基團(tuán)修飾，熒光基團(tuán)包括Tamra、Rox、Fam或Hex。
[0010] 進(jìn)一步地，Hpall/MspI 篩選引物 SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、 SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33 的 5'端用熒光基團(tuán) Fam 修飾；Hpall/MspI 篩 選引物 SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34的5'端用熒光基團(tuán)Hex修飾。
[0011] 進(jìn)一步地，篩選引物的組合分別為：SEQ ID NO :14+SEQ ID NO :26、SEQ ID NO : 15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：19+SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：21+SEQ ID NO ：29, SEQ ID NO :22+SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :7+SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :7+SEQ ID NO :23、SEQ ID N0：8+SEQ ID N0：23,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：10+SEQ ID NO ：24, SEQ ID N0：11+SEQ ID NO ：25,SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：25,SEQ ID NO ：13+SEQ ID NO ：27,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：27, SEQ ID NO ：20+SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：17+SEQ ID NO ：28, SEQ ID N0：18+SEQ ID NO ：28,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：3USEQ ID N0：10+SEQ ID NO ：3USEQ ID N0：11+SEQ ID NO ：32,SEQ ID N0：13+SEQ ID NO ：32,SEQ ID NO ： 15+SEQ ID NO ：33,SEQ ID N0：17+SEQ ID NO ：33, SEQ ID NO ：19+SEQ ID NO ：34,SEQ ID NO ：8+SEQ ID NO ：34,SEQ ID N0：12+SEQ ID NO ：32,SEQ ID NO ：8+SEQ ID NO ：30,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：28,SEQ ID NO ：18+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：20+SEQ ID NO ：24〇
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種采用MSAP技術(shù)檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化的 試劑盒。該試劑盒包括MSAP技術(shù)所用的接頭、預(yù)擴(kuò)增引物和篩選引物序列，其中，其中，接 頭包括EcoRI接頭和Hpall/MspI接頭，EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO :1和SEQ ID NO : 2，HpaII/MspI接頭的序列為SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4 ;預(yù)擴(kuò)增引物包括EcoRI預(yù)擴(kuò)增 引物和Hpall/MspI預(yù)擴(kuò)增引物，EcoRI預(yù)擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO :5, Hpall/MspI預(yù) 擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO :6 ;篩選引物包括EcoRI篩選引物和Hpall/MspI篩選引物， EcoRI篩選引物序列為SEQ ID NO :7?22, Hpall/MspI篩選引物序列為SEQ ID NO :23? 34。進(jìn)一步地，該試劑盒包括林木木質(zhì)部DNA提取試劑。
[0013] 進(jìn)一步地，在Hpall/MspI篩選引物5'端用熒光基團(tuán)修飾，熒光基團(tuán)包括Tamra、 Rox、Fam 或 Hex。
[0014] 進(jìn)一步地，Hpall/MspI 篩選引物 SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、 SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33 的 5'端用熒光基團(tuán) Fam 修飾；Hpall/MspI 篩 選引物 SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34的5'端用熒光基團(tuán)Hex修飾。
[0015] 進(jìn)一步地，篩選引物的組合分別為：SEQ ID NO :14+SEQ ID NO :26、SEQ ID NO : 15+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：19+SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：21+SEQ ID NO ：29, SEQ ID N0：22+SEQ ID NO ：29, SEQ ID NO ：7+SEQ ID NO ：33, SEQ ID NO ：7+SEQ ID NO ：23, SEQ ID NO :8+SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :10+SEQ ID NO :24、SEQ ID N0：11+SEQ ID NO ：25,SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：25,SEQ ID N0：13+SEQ ID NO ：27,SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：27, SEQ ID NO ：20+SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：17+SEQ ID NO ：28, SEQ ID N0：18+SEQ ID NO ：28,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：3USEQ ID NO ：10+SEQ ID NO ：3USEQ ID N0：11+SEQ ID NO ：32,SEQ ID NO ：13+SEQ ID NO ：32,SEQ ID NO ： 15+SEQ ID NO ：33,SEQ ID N0：17+SEQ ID NO ：33,SEQ ID N0：19+SEQ ID NO ：34,SEQ ID NO ：8+SEQ ID NO ：34,SEQ ID N0：12+SEQ ID NO ：32,SEQ ID NO ：8+SEQ ID NO ：30,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：28,SEQ ID NO ：18+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：20+SEQ ID NO ：24〇
[0016] 應(yīng)用MSAP技術(shù)檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化，采用本發(fā)明提供的接頭、預(yù)擴(kuò)增引物 和篩選引物，能夠穩(wěn)定、高效地在全基因組水平上檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化位點(diǎn)，可以有 效地、特異地檢測到不同基因型植株基因組DNA甲基化遺傳變異位點(diǎn)。采用本發(fā)明的技術(shù) 方案得到的林木木質(zhì)部DNA甲基化檢測結(jié)果，可用于甲基化相對水平、特異位點(diǎn)的估算與 分析等，可以分析自然群體表觀遺傳多樣性、表觀遺傳結(jié)構(gòu)等表觀遺傳學(xué)內(nèi)容，為表觀遺傳 變異研究提供有力的技術(shù)支持，為篩選木材品質(zhì)為目標(biāo)的林木分子標(biāo)記輔助育種提供新的 候選標(biāo)記位點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示 意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0018] 圖1示出了實(shí)施例1的毛細(xì)管電泳后產(chǎn)生的數(shù)據(jù)經(jīng)由軟件GeneMarker VI. 7. 1讀 取的條帶圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0020] 林木材性性狀是木材應(yīng)用、產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的重要衡量指標(biāo)，對其進(jìn)行遺傳改良具有 重要價值?；蚪MDNA甲基化參與調(diào)控木材形成過程中基因的表達(dá)，因此，對木質(zhì)部DNA甲 基化位點(diǎn)進(jìn)行檢測對于林木甲基化相對水平、特異位點(diǎn)分析及表觀遺傳學(xué)研究等均具有重 要意義。但目前，現(xiàn)有技術(shù)中還沒有安全、可靠、穩(wěn)定、高效地檢測林木DNA甲基化方法。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供一種采用MSAP技術(shù)檢測林木木質(zhì)部DNA甲 基化的方法，包括以下步驟：S1，提取林木木質(zhì)部DNA ;S2,分別用Ec〇RI、EC〇RI/MspI兩組酶 對林木木質(zhì)部DNA進(jìn)行酶切；S3,分別對酶切得到的產(chǎn)物連接上限制性內(nèi)切酶的接頭；S4， 以接頭為模板設(shè)計(jì)的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，得PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物；S5,將PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn) 物稀釋后，加入帶有選擇性堿基的篩選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；S6,電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，統(tǒng)計(jì) 并分析DNA條帶，其中，接頭包括EcoRI接頭和Hpall/MspI接頭，EcoRI接頭的序列為SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2, Hpall/MspI 接頭的序列為 SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;預(yù)擴(kuò) 增引物包括EcoRI預(yù)擴(kuò)增引物和Hpall/MspI預(yù)擴(kuò)增引物，EcoRI預(yù)擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO :5，HpaII/MspI預(yù)擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO :6 ;篩選引物包括EcoRI篩選引物和 Hpall/MspI篩選引物，EcoRI篩選引物序列為SEQ ID NO :7?22，HpaII/MspI篩選引物序 列為SEQ ID NO :23?34。，如表1所示。
[0022] 表 1
[0023]

【權(quán)利要求】
1. 一種采用MSAP技術(shù)檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化的方法，其特征在于，包括以下步 驟： 51, 提取林木木質(zhì)部DNA ; 52, 分別用EcoRI/Hpall、EcoRI/MspI兩組酶對所述林木木質(zhì)部DNA進(jìn)行酶切； 53, 分別對酶切得到的產(chǎn)物連接上限制性內(nèi)切酶的接頭； 54, 以所述接頭為模板設(shè)計(jì)的預(yù)擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增，得PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物； 55, 將所述PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后，加入帶有選擇性堿基的篩選引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 56, 電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，統(tǒng)計(jì)并分析DNA條帶， 其中，所述接頭包括EcoRI接頭和Hpall/MspI接頭，所述EcoRI接頭的序列為SEQID NO :1 和 SEQ ID NO :2,所述 Hpall/MspI 接頭的序列為 SEQ ID NO :3 和 SEQ ID NO :4 ;所述 預(yù)擴(kuò)增引物包括EcoRI預(yù)擴(kuò)增引物和Hpall/MspI預(yù)擴(kuò)增引物，所述EcoRI預(yù)擴(kuò)增引物的序 列為SEQ ID N0:5,所述Hpall/MspI預(yù)擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID N0:6;所述篩選引物包括 EcoRI篩選引物和Hpall/MspI篩選引物，所述EcoRI篩選引物序列為SEQID NO :7?22,所 述Hpall/MspI篩選引物序列為SEQ ID NO :23?34。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S1中，提取林木木質(zhì)部DNA選用 的是活體林木，所述活體林木的取樣方法包括以下步驟： 采用利刃將所述活體林木胸徑處（3?5)cmX (3?5)cm面積樹皮剝離，取出3?5g 木質(zhì)部后將樹皮貼回原處，然后用保鮮膜將傷處包裹，7?10天后去除所述保鮮膜。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟S6中，采用毛細(xì)管熒光電泳檢 測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在Hpall/MspI篩選引物5'端用熒光基團(tuán)修飾，所述熒光基團(tuán)包括Tamra、 Rox、Fam 或 Hex。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，Hpall/MspI篩選引物SEQ ID N0:23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33 的 5'端用熒光基 團(tuán) Fam 修飾；Hpall/MspI 篩選引物 SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34 的 5' 端用熒光基團(tuán) Hex 修飾。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述篩選引物的組合分別為：SEQ ID NO: 14+SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :15+SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :19+SEQ ID NO :28、SEQ ID N0：21+SEQ ID NO ：29,SEQ ID NO ：22+SEQ ID NO ：29,SEQ ID NO ：7+SEQ ID NO ：33,SEQ ID NO :7+SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :8+SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :24、SEQ ID N0：10+SEQ ID NO ：24,SEQ ID N0：11+SEQ ID NO ：25,SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：25,SEQ ID N0：13+SEQ ID NO ：27,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：27,SEQ ID NO ：20+SEQ ID NO ：28,SEQ ID N0：17+SEQ ID NO ：28,SEQ ID NO ：18+SEQ ID NO ：28,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：3USEQ ID NO ：10+SEQ ID NO ：3U SEQ ID NO ：11+SEQ ID NO ：32, SEQ ID NO ：13+SEQ ID NO ：32, SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ：33,SEQ ID N0：17+SEQ ID NO ：33,SEQ ID NO ：19+SEQ ID NO ：34,SEQ ID N0：8+SEQ ID NO：34,SEQ ID N0：12+SEQ ID NO：32,SEQ ID NO ：8+SEQ ID NO：30,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：28, SEQ ID N0：18+SEQ ID N0：26,SEQ ID NO ：20+SEQ ID NO ：24〇
6. -種采用MSAP技術(shù)檢測林木木質(zhì)部DNA甲基化的試劑盒，其特征在于，包括MSAP 技術(shù)所用的接頭、預(yù)擴(kuò)增引物和篩選引物序列，其中，其中，所述接頭包括EcoRI接頭和 Hpall/MspI 接頭，所述EcoRI 接頭的序列為 SEQ ID N0:1 和 SEQ ID N0:2,所述Hpall/MspI 接頭的序列為SEQIDN0:3和SEQIDN0:4;所述預(yù)擴(kuò)增引物包括E CORI預(yù)擴(kuò)增引物和 Hpall/MspI預(yù)擴(kuò)增引物，所述EcoRI預(yù)擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO :5,所述Hpall/MspI預(yù) 擴(kuò)增引物的序列為SEQ ID NO :6 ;所述篩選引物包括EcoRI篩選引物和Hpall/MspI篩選引 物，所述EcoRI篩選引物序列為SEQ ID NO :7?22,所述Hpall/MspI篩選引物序列為SEQ ID NO :23 ?34。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，進(jìn)一步包括林木木質(zhì)部DNA提取試劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，在所述Hpall/MspI篩選引物5'端用熒 光基團(tuán)修飾，所述熒光基團(tuán)包括Tamra、Rox、Fam或Hex。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述Hpall/MspI篩選引物SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33 的 5,端 用熒光基團(tuán) Fam修飾；Hpall/MspI 篩選引物 SEQ ID N0:24、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:28、 SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34 的 5' 端用熒光基團(tuán) Hex 修飾。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述篩選引物的組合分別為：SEQ ID N0：14+SEQ ID NO ：26,SEQ ID N0：15+SEQ ID NO ：26,SEQ ID NO ：19+SEQ ID NO ：28,SEQ ID N0：21+SEQ ID NO ：29,SEQ ID NO ：22+SEQ ID NO ：29,SEQ ID NO ：7+SEQ ID NO ：33,SEQ ID NO :7+SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :8+SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :24、SEQ ID N0：10+SEQ ID NO ：24,SEQ ID N0：11+SEQ ID NO ：25,SEQ ID NO ：12+SEQ ID NO ：25,SEQ ID N0：13+SEQ ID NO ：27,SEQ ID N0：16+SEQ ID NO ：27,SEQ ID NO ：20+SEQ ID NO ：28,SEQ ID N0：17+SEQ ID NO ：28,SEQ ID NO ：18+SEQ ID NO ：28,SEQ ID NO ：9+SEQ ID NO ：3USEQ ID N0：10+SEQ ID N0：3USEQ ID N0：11+SEQ ID NO ：32,SEQ ID NO ：13+SEQ ID NO ：32,SEQ ID NO ：15+SEQ ID NO ：33, SEQ ID NO ：17+SEQ ID NO ：33, SEQ ID NO ：19+SEQ ID NO ：34, SEQ ID NO :8+SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :12+SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :8+SEQ ID NO :30、SEQ ID NO ：16+SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：18+SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：20+SEQ ID NO ：24〇
【文檔編號】C12Q1/68GK104293893SQ201310298785
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】張德強(qiáng), 馬開峰, 宋躍朋 申請人:北京林業(yè)大學(xué)