專利名稱：一種用脂質體技術篩選乳桿菌凍干用保護劑的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種脂質體制備和微生物領域
背景技術：
冷凍干燥是將欲保藏的微生物細胞在真空條件和凍結狀態(tài)使冰升華，最后達到干燥。其步驟分3步進行，首先是預凍過程，預凍的速度與溫度根據(jù)微生物的種類而定。其次是升華過程，將預凍好的微生物置于高真空度的環(huán)境中，冰晶吸熱而直接變成水蒸氣從微生物體內溢出。升華過程是由內向外逐漸推移的，冰晶升華后在微生物體內留下許多微孔隙。再次是解析過程，這ー過程使殘留在微生物體內的結合態(tài)水解析出來，進ー步降低微生物體內水分的含量。乳酸菌是一群能從可發(fā)酵性碳水化合物中產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性細菌的通稱。大量研究表明乳酸菌是ー類對人體健康有利的益生菌。乳酸菌產(chǎn)品逐漸受到人們的重視，于二十世紀七十年代初期開始研制真空冷凍干燥發(fā)酵劑。冷凍干燥過程會造成乳酸菌的細胞膜通透性改變、蛋白質變性失活、PH值的動態(tài)平衡被破壞、DNA損傷和膜脂肪酸組成發(fā)生改變等。會使部分細胞損傷，甚至死亡。β -半乳糖苷酶是乳酸菌發(fā)揮其益生菌功能的重要酶類，它能消化乳糖，使患有乳糖不耐癥的人群能夠充分吸收它。有關研究乳酸菌的冷凍損傷發(fā)現(xiàn)正常菌體上清液、菌體懸浮液中相對β -半乳糖苷酶活力分別為O、32. 9 %，凍藏菌體為O. 28 %、48. 9 %，而凍干菌體則為O. 95%、60. 8%，這表明細胞膜的通透性増加，使β -半乳糖苷酶從細胞內泄漏出來。此為凍干帶來的細胞膜損傷。通常細胞膜中磷脂的極性端在一定程度上是以水合形式存在的，而且每個磷脂的極性端與其它磷脂分子的極性端被水分子隔開。當磷脂干燥脫水時，極性端的密度増加，糖鏈間的范德華引力增強，平時處于液晶態(tài)的脂膜變成凝膠態(tài)，相的變化使復水時細胞膜的通透性増加，胞內ー些可溶性物質發(fā)生滲漏，從而導致細胞死亡。微生物細胞的干燥損傷很大程度是由于膜脂性質、結構的變化使膜的流動性或完整性改變，從而導致膜的功能失調，影響微生物的生命活動。脂質體具有類似生物膜的雙分子層結構囊泡。天然磷脂化合物依靠疏水相互作用構成生物膜的基質。當前常用的模擬膜體系有Langmuir膜，平面雙層脂膜和脂質體。脂質體可以分為單層小泡囊(SUV).單層大泡囊(LU. V)和多層大泡囊(MUV)，都是包結著水室的封閉雙層結構，是最接近于細胞的模型。脂質體適合用于膜滲透的測量。脂質體可長時間吸附于靶細胞周圍，使藥物充分被靶細胞、靶組織吸收。將藥物做成脂質體后，具有靶向性、緩釋性、組織相容性與細胞親和性、降低藥物毒性、提高藥物穩(wěn)定性等特點。脂質體作為新型的藥物劑型可以達到提高藥品安全性、有效性、穩(wěn)定性和患者順應性，降低藥品不良反應的目的，所以日益受到國內外醫(yī)藥界的廣泛重視。本發(fā)明結合脂質體技術篩選乳酸菌凍干保護劑。目前為止發(fā)現(xiàn)的乳酸菌的凍干保護劑有數(shù)十種。如甘油、こニ醇、蔗糖、海藻糖、透明質酸等。篩選保護劑的方法主要是采用傳統(tǒng)的菌體培養(yǎng)法，比較凍干前后活菌數(shù)、酶活力等指標的變化，耗時長，操作要求高。本發(fā)明以脂質體模擬瑞士乳桿菌9的細胞膜，并在脂質體中包封β -半乳糖苷酶，觀察冷凍干燥對脂質體包封酶量及瑞士乳桿菌9胞內酶變化之間的關系，證實脂質體技術可以用于快速篩選凍干保護劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種簡單快速篩選乳桿菌冷凍干燥保護劑的方法。利用脂質體技術篩選保護劑的主要實驗步驟(1) β -半乳糖苷酶脂質體的制備①稱取大豆卵磷脂和十八胺按摩爾比10 : 1，共144μπι01，溶于15mlこ醚中。②吸取5ml β -半乳糖苷酶酶液,其蛋白質濃度為I. 286mg/ml,酶的比活力為1970U/mg蛋白質。加入①中混勻。水浴超聲3min，每處理30s，間歇30s，使之成為油包水型，即W/0型乳液。③旋轉蒸發(fā)，除去有機溶劑④加入外水相。加入磷酸鈉緩沖液(20mM，pH7.0)30ml，繼續(xù)旋轉直至白色懸液形成⑤超聲破碎儀勻化粒徑。超聲功率為80%，超聲時間為5minX2，至形成透亮的溶液。所制備的脂質體平均粒徑脂質體平均粒徑IlOnm 150nm，分散性指數(shù)(PdI)O. 265 O. 390, Zeta 電位-37. I -42. OmV。(2)脂質體與游離β -半乳糖苷酶的分離以及測定脂質體包封率采用葡聚糖凝膠柱色譜法分離混懸液中的脂質體和乳糖酶。取原酶液1ml，空白脂質體1ml，在柱長為Im的G-200凝膠柱上樣，以磷酸鈉緩沖液為洗脫液，調節(jié)洗脫液流速為O. 4ml/min，流出液每2ml為I份。在紫外-可見分光光度計420nm處測量溶液的吸收度。然后，考馬斯亮藍法測定脂質體懸液中酶蛋白含量。(3)添加不同冷凍干燥保護劑后對脂質體進行冷凍干燥制備的脂質體懸液，液面高度O. 5-lcm,在-25で以下預凍12小時；在溫度-50-40°C，真空度40-80Pa下真空冷凍干燥12小時 (4)凍干脂質體復水與游離β -半乳糖苷酶分離以及測定脂質體包封率(5)擬凍干目標乳桿菌菌株培養(yǎng)及測定胞內乳糖酶酶活力保存率(6)添加利用脂質體技術篩選出的冷凍干燥保護劑后對目標乳桿菌菌株進行冷凍干燥(7)凍干乳桿菌菌株菌粉復水及測定胞內乳糖酶酶活力保存率
具體實施例方式實施例I(I)參照步驟I制備β -半乳糖苷酶脂質體。(2)加入不同保護劑將60ml酶脂質體分成五份，分裝至試管中，每管10ml，標號為①②③④⑤。①號試管，放于冰箱冷藏；②號試管，加入海藻糖。配制lOOmg/lOOml。即O. lOOOg，溶于IOOml水中。然后取2. 5ml至IOml脂質體溶液中。(最后得到海藻糖濃度約為20mg/100ml)③號試管，加入透明質酸。可以先配制2mg/100ml透明質酸溶液(稱O. 0020g透明質酸溶于IOOml水中),然后取2. 5ml至IOml脂質體溶液中。(最后得到透明質酸濃度為 O. 4mg/100ml)④號試管，加入海藻糖和透明質酸互配保護劑，10mg/100ml和O. 2mg/100ml。取lOOmg/lOOml海藻糖溶液I. 286ml,取2mg/100ml透明質酸溶液I. 429ml。⑤號試管，不加保護劑。 (3)②③④⑤樣品冷凍干燥從②③④⑤號試管中各取1.3ml至于西林瓶中，三個平行。于真空冷凍干燥機中凍干。⑷復溶取I. 3ml磷酸鈉緩沖液于西林瓶中，溶解凍干脂質體。(5)脂質體純化，未包封的蛋白質濃度測定脂質體懸浮液Iml過Sephadex_G200凝膠柱,收集未包封的酶液。(6)測量懸液中蛋白質濃度采用考馬斯亮藍法，取Iml樣品于比色管中，加入5mlG-250染色液，充分混勻，靜置::min。然后在595nm處測定其吸光度。包封率的計算
權利要求
1.ー種β-半乳糖苷酶脂質體。其特征是含有β-半乳糖苷酶為活性成分和脂質體的制備材料大豆卵磷脂、十八胺。
2.按權利要求I所述的酶脂質體的基本特征為脂質體平均粒徑110nm 150nm，分散性指數(shù)(PdI) 0. 265 O. 390，Zeta 電位-37. I -42. OmV。
3.按權利要求I所述的酶脂質體，其制備方法及步驟為 ①稱取大豆卵磷脂和十八胺按摩爾比10 1，共144μπι01，溶于15mlこ醚中 ②吸取5πι1β-半乳糖苷酶酶液，其蛋白質濃度為I.286mg/ml，酶的比活力為1970U/mg蛋白質，加入①中混勻。水浴超聲3min，每處理30s，間歇30s，使之成為油包水型，即W/Ο型乳液 ③旋轉蒸發(fā)，除去有機溶劑 ④加入外水相。加入磷酸鈉緩沖液(20mM，pH7.0)30ml，繼續(xù)旋轉直至白色懸液形成 ⑤超聲破碎儀勻化粒徑。超聲功率為80%，超聲時間為5minX2，至形成透亮的溶液。
4.按權利要求I所述的酶脂質體，其冷凍干燥方法為 制備的脂質體懸液，液面高度O. 5-lcm，在-25°C以下預凍12小時；在溫度_50_40で，真空度40-80Pa下真空冷凍干燥12小吋。
5.按權利要求I所述酶脂質體，利用其篩選乳桿菌冷凍干燥保護劑的方法及步驟為 (1)β -半乳糖苷酶脂質體的制備 (2)脂質體與游離β_半乳糖苷酶的分離以及測定脂質體包封率 (3)添加不同冷凍干燥保護劑后對脂質體進行冷凍干燥 (4)凍干脂質體復水與游離β_半乳糖苷酶分離以及測定脂質體包封率 (5)乳酸菌培養(yǎng)及測定胞內乳糖酶酶活力保存率 (6)添加利用脂質體技術篩選出的冷凍干燥保護劑后對乳酸菌進行冷凍干燥 (7)凍干乳桿菌菌粉復水及測定胞內乳糖酶酶活力保存率。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種簡單快速篩選乳桿菌冷凍干燥保護劑的方法。首先制備β-半乳糖苷酶脂質體，以大豆卵磷脂、十八胺為制備材料，摩爾比為10∶1，共144μmol，溶于15ml乙醚中，包封5mlβ-半乳糖苷酶酶液，其蛋白質濃度為1.286mg/ml，酶的比活力為1970U/mg蛋白質。酶脂質體特征為脂質體平均粒徑110nm～150nm，分散性指數(shù)(PdI)0.265～0.390，Zeta電位-37.1～-42.0mV。然后添加不同冷凍干燥保護劑，對制備的脂質體懸液進行冷凍干燥，液面高度0.5-1cm，在-25℃以下預凍12小時；在溫度-50～-40℃，真空度40-80Pa下真空冷凍干燥12小時。最后將凍干脂質體復水，測定其酶蛋白包封率的變化。使包封率降低最小的保護劑效果最佳。采用本發(fā)明的方法篩選出的保護劑，能有效提高乳桿菌在凍干過程中的存活率。
文檔編號C12Q1/34GK102618623SQ20121008947
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權日2012年3月30日
發(fā)明者劉友群, 展海寧, 張柏林, 賈春鳳 申請人:北京林業(yè)大學