一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護(hù)劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護(hù) 劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬瘟（CSF)是國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE)和中國(guó)的A類(lèi)法定傳染病，是我國(guó)強(qiáng)制性免 疫的重大動(dòng)物疫病之一，是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的"第一殺手"。豬瘟是由豬瘟病毒引起的，無(wú)法 用藥物進(jìn)行控制，疫苗免疫是最有效的辦法。
[0003] 目前國(guó)內(nèi)外市售的豬瘟疫苗主要有豬瘟脾淋苗、豬瘟細(xì)胞苗以及豬瘟亞單位疫 苗，但市場(chǎng)上豬瘟疫苗的主流產(chǎn)品仍然是豬瘟脾淋苗和豬瘟細(xì)胞苗。作為疫苗中的經(jīng) 典-精制豬瘟脾淋源活疫苗仍具有不可替代的作用。
[0004] 豬瘟脾淋源活疫苗選用中國(guó)豬瘟兔化弱毒株（C株)，該疫苗株能激發(fā)機(jī)體快速產(chǎn) 生免疫力、遺傳穩(wěn)定、毒力不返強(qiáng)，是國(guó)際上公認(rèn)的目前世界上最為安全有效的弱毒疫苗 株。采用該毒株接種優(yōu)良家兔，收獲感染家兔的脾臟制成乳劑，與凍干保護(hù)劑混勻后經(jīng)過(guò)冷 凍真空干燥制成豬瘟脾淋源活疫苗。
[0005] 目前市場(chǎng)認(rèn)為豬瘟脾淋源活疫苗免疫效果不理想，對(duì)豬瘟脾淋活疫苗的認(rèn)識(shí)仍存 在誤區(qū)，這主要和目前國(guó)內(nèi)豬瘟脾淋源活疫苗使用方法不當(dāng)、混合感染豬只免疫后應(yīng)激過(guò) 大，以及質(zhì)量參差不齊等情況有關(guān)。
[0006] 近年來(lái)，人們針對(duì)活疫苗凍干保護(hù)劑進(jìn)行了大量研宄，多為耐熱保護(hù)劑，解決了疫 苗在運(yùn)輸使用過(guò)程中的耐熱問(wèn)題，但對(duì)于提高活疫苗效果方面幾乎沒(méi)有提升。
[0007] 多糖是中藥活性成分之一，大量研宄表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作 為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的 各種活動(dòng)。多糖類(lèi)物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶 活性和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力，同時(shí)多糖也具有很好的耐熱效果，多種實(shí)驗(yàn)表明中藥多糖 可作為耐熱保護(hù)劑添加于活疫苗凍干保護(hù)劑中。
[0008] 黃酮類(lèi)化合物是自然界中存在的多元酚類(lèi)物質(zhì)，也是自然界藥用植物中的主要活 性成分之一。它是指具有15個(gè)碳原子并以C6-C3-C6的方式構(gòu)成的三環(huán)天然有機(jī)物，是植 物在長(zhǎng)期自然選擇中產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物，現(xiàn)在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于 果蔬、中草藥中，無(wú)毒副作用，它具有顯著的清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變、調(diào)血脂降 血壓等藥理保健功能，是一類(lèi)極具開(kāi)發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑，這些抗氧化活性物質(zhì)可 以減少和清除機(jī)體內(nèi)自由基，具有預(yù)防疾病的作用。
[0009] 法氏囊素（bursin，BS)是從禽類(lèi)特有的體液免疫中樞淋巴器官法氏囊（Bursa of fabricius)中分離出來(lái)的一種活性三肽物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)-LyS-His-Gly-NH2。研宄表明，BS 能促進(jìn)禽類(lèi)和哺乳動(dòng)物B淋巴細(xì)胞前體的分化、增殖，能提高B細(xì)胞系Daudi細(xì)胞內(nèi)第二信 使cAMP和cGMP水平，加快B細(xì)胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的速度，促進(jìn)B細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成， 從而使B細(xì)胞產(chǎn)生和分泌抗體能力加強(qiáng)。
[0010] 基于上述【背景技術(shù)】，本發(fā)明提出一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護(hù)劑。該保護(hù)劑 主要由中藥多糖、中藥黃酮、法氏囊素等組成。本發(fā)明所制備的凍干保護(hù)劑一方面可以提供 給活疫苗耐熱保護(hù)，另一方面在疫苗使用過(guò)程中大大提高了疫苗的使用效果，同時(shí)還兼具 了提高機(jī)體免疫力的功效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種豬瘟脾淋源活疫苗用 凍干保護(hù)劑的技術(shù)方案，該凍干保護(hù)劑能夠大幅度提高了機(jī)體的免疫力，提高體液免疫能 力，刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的中和抗體，提高了機(jī)體預(yù)防疾病的能力。
[0012] 所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于該凍干保護(hù)劑每1000 ml 磷酸緩沖液中含有中藥多糖30~100g、中藥黃酮20~60g、法氏囊素2~16mg，所述的中 藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到：垂盆草、金果欖、雞矢藤、水牛角、螻蛄、 香薷、防己、半邊蓮和路路通。
[0013] 所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于該凍干保護(hù)劑每1000 ml 磷酸緩沖液中含有中藥多糖50~80g、中藥黃酮30~50g、法氏囊素4~12mg。
[0014] 所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的中藥多糖和中藥 黃酮通過(guò)以下步驟制得： a、 按垂盆草10~30份、金果欖20~40份、雞矢藤10~20份、水牛角10~30份、 螻蛄10~30份、香薷10~20份、防己10~30份、半邊蓮10~30份和路路通10~20 份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過(guò)夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至 90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過(guò)程中每10分鐘攪拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； c、 將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮； d、 用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶 解，溶解后，按通過(guò)活性炭柱進(jìn)行內(nèi)毒素吸附，收集濾出液； e、 將d中上濾出液通過(guò)sevag法除去蛋白； f、 將e中中藥多糖進(jìn)行真空冷凍干燥制得中藥多糖； g、 將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn) 行減壓真空濃縮，如此三次后經(jīng)冷凍真空干燥制成中藥黃酮。
[0015] 所述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護(hù)劑，其特征在于所述的法氏囊素通過(guò)以 下步驟制得：取健康法氏囊組織，將法氏囊組織剔除筋膜和脂肪組織，PH7. 2滅菌冷PBS洗 凈；按1 :1比例加入pH 7. 2滅菌冷PBS，在組織勻漿機(jī)中進(jìn)行高速勻漿；勻漿液中加入2. 5% 的胰蛋白酶，反復(fù)凍融3次，12000rpm離心20min，棄沉淀；上清用1000 da截留分子量的超 濾膜進(jìn)行超濾，膜下液經(jīng)〇. 22um濾膜過(guò)濾除菌，濾過(guò)液即為法氏囊素粗提液；粗提液經(jīng)冷 凍真空干燥制得法氏囊素。
[0016] 上述的一種豬瘟脾淋源活疫苗用凍干保護(hù)劑，設(shè)計(jì)合理，與傳統(tǒng)的凍干保護(hù)劑相 比其具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1.本發(fā)明所制備的凍干保護(hù)劑，具有耐熱效果，可提高疫苗運(yùn)輸、儲(chǔ)藏等便利性。
[0017] 2.采用本發(fā)明凍干保護(hù)劑所制備的疫苗在免疫注射時(shí)可以減少豬只疼痛感，降低 豬只的應(yīng)激反應(yīng)。
[0018] 3.采用本發(fā)明凍干保護(hù)劑制備疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的產(chǎn) 生中和抗體，減少免疫空檔期，降低豬只發(fā)病幾率，提高機(jī)體抵御疾病的能力。
[0019] 4.采用本發(fā)明凍干保護(hù)劑制備的疫苗免疫機(jī)體后，能促進(jìn)機(jī)體B淋巴細(xì)胞前體的 分化、增殖，加快B細(xì)胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的速度，促進(jìn)B細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的生成，從而使B 細(xì)胞產(chǎn)生和分泌抗體能力加強(qiáng)，從而可提高機(jī)體免疫力。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解， 這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限止本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí) 驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0021] 實(shí)施例1 :中藥多糖和中藥黃酮的制備 a、 按垂盆草30份、金果欖20份、雞矢藤20份、水牛角30份、螻蛄30份、香薷10份、防 己10份、半邊蓮10份和路路通10份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過(guò)夜，再加 入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過(guò)程中每10分 鐘攪拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上 清； c、 將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮； d、 用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶 解，溶解后，按〇. 5%比例加入活性炭4°C吸附過(guò)夜，吸附后經(jīng)1000 Orpm離心10分鐘，棄去沉 淀，收集上清； e、 將d中上清經(jīng)0. 22um濾膜過(guò)濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到中藥多糖； g、 將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn) 行