專利名稱：節(jié)能釀造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備基于大麥的飲料(例如基于麥芽的飲料，如啤酒)的節(jié)能方法。本發(fā)明還涉及用于所公開(kāi)的方法中的大麥植物。特別地，本發(fā)明描述了在一植株中具有無(wú)效脂肪氧化酶-1 (無(wú)效L0X-1)、無(wú)效脂肪氧化酶-2 (無(wú)效L0X-2)和無(wú)效S-腺苷甲硫氨酸:甲硫氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(也稱作無(wú)效S-甲硫氨酸(Met)-S-甲基轉(zhuǎn)移酶或無(wú)效MMT)的組合特征的大麥植株，即無(wú)效L0X-1-無(wú)效L0X-2-無(wú)效MMT (本文中也可互換地稱為雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT)大麥植株，其特別用于本文所述的制備基于大麥的飲料的節(jié)能方法。
背景技術(shù)：
制麥廠和釀酒廠大麥(Hordeum vulgare, L.)是廣泛種植于不同氣候下用于生產(chǎn)食品和飲料的二倍體谷類。使用高能耗方法，例如麥芽廠和釀酒廠分別用于烘干和麥芽汁煮沸的操作，大量產(chǎn)生基于所述植物的飲料。制麥(malting) —般包括浸泡大麥粒以促進(jìn)萌芽，隨后在高溫下進(jìn)行烘干，這使得該過(guò)程特別耗能。烘干的主要目的包括:(i)終止萌芽；(ii)干燥萌芽的大麥粒；(iii)使酶變性，特別是野生型大麥中的脂肪酶和LOX酶；和(iv)將主要由S-甲基-Met (SMM)組成的二甲基硫化物(DMS)前體(DMSP)轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性的DMS[正常淺色麥芽烘干后，干重中的 DMSP 含量平均為 4ppm(參見(jiàn) Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLBBerlin,第158-162頁(yè))]。在烘干過(guò)程中保留了某些酶的活性(例如淀粉酶、蛋白酶等)。在釀酒廠中，一般大約一半的能量消耗在釀造過(guò)程中，對(duì)應(yīng)于范圍為
48,000-83, 000kJ/hL 的能量負(fù)荷(Modern brewhouse technology, BrauweltInternational2004,第410-412頁(yè))。絕大多數(shù)能量消耗在麥芽汁煮沸過(guò)程中，其目的一般是實(shí)現(xiàn):⑴蛋白質(zhì)凝聚；(ii)酶失活；(iii)麥芽汁滅菌；(iv)酒花化合物的提??；(V)α-酸的異構(gòu)化；和(vi)無(wú)用的揮發(fā)性化合物的蒸發(fā)，例如分別具有硫和陳化異味的DMS和反式-2-壬烯醛(Τ2Ν)的蒸發(fā)。通常將麥芽汁煮沸至少50-60分鐘，以實(shí)現(xiàn)至少10-15%的總蒸發(fā)量(見(jiàn)Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin,第 11 章)，但目前常常通過(guò)技術(shù)手段改善至6-8%。另外，已經(jīng)嘗試?yán)缤ㄟ^(guò)將蒸發(fā)量降低至3-4%之少并結(jié)合將無(wú)用的揮發(fā)性化合物蒸餾至注入的蒸汽中的提餾工序(例如見(jiàn)Bonacchelli等人，2007)來(lái)進(jìn)一步降低能量消耗。一般認(rèn)為，麥芽汁中無(wú)用的揮發(fā)性化合物的水平使得難以進(jìn)一步減少蒸發(fā)量或者甚至去除蒸發(fā)。T2N1970年將T2N(沸點(diǎn) 為88° C的揮發(fā)性C9烯醛)認(rèn)定為賦予啤酒紙板樣異味的分子(Jamieson和Gheluwe, 1970)。因?yàn)槿藢?duì)T2N的味覺(jué)閾值水平極其低，之前測(cè)定約為0.7nM或0.1ppb (Meilgaard, 1975)，所以即使具有微量水平醛的產(chǎn)品也會(huì)具有陳化感。然而，T2N的水平在新鮮啤酒中一般非常低(Lermusieau等人，1999)，這表明陳化過(guò)程促進(jìn)了游離T2N從相應(yīng)加合物中的釋放(Nyborg等人，1999)。隨后的觀察揭示了產(chǎn)品儲(chǔ)存后麥芽汁的T2N潛能與所形成的游離T2N之間的關(guān)聯(lián)(KuiOda等人，2005)。烘干和麥芽汁煮沸代表了可作為為降低基于大麥的飲料中的T2N水平而進(jìn)行的操作的靶標(biāo)的獨(dú)立加工工序。盡管高溫下的烘干使參與T2N形成的酶如脂肪酶和LOX失活(參見(jiàn)例如 Technology Brewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin,第 162 頁(yè))，但也可通過(guò)麥芽汁煮沸將游離T2N去除。大麥粒含有三種LOX酶，已知為L(zhǎng)0X-1、L0X-2和L0X-3 (van Mechelen等人，1999)。L0X-1的主要活性催化由亞油酸形成9-過(guò)氧氫十八碳二烯酸(9-HP0DE;參見(jiàn)圖1A對(duì)LOX途徑的部分綜述)，所述9-過(guò)氧氫十八碳二烯酸是T2N和三羥基十八碳烯酸(THA)的前體。L0X-2主要催化亞油酸轉(zhuǎn)化成13-HP0DE，其進(jìn)一步代謝成己醛，即具有 0.4-ppm高味覺(jué)閾值的C6醛(Meilgaard,上文)。由于L0X-2非常低的9-HP0DE形成活性，幾則報(bào)道已經(jīng)注意到T2N通過(guò)以下生物化學(xué)途徑產(chǎn)生，所述生物化學(xué)途徑包括最初通過(guò)L0X-1催化亞油酸轉(zhuǎn)化成9-HP0DE，隨后通過(guò)9-氫過(guò)氧化物裂解酶作用裂解9-HP0DE (參見(jiàn)例如 Kuroda 等人,2003, 2005; Noodermeer 等人,2001)。對(duì)于L0X-1的上述性質(zhì)，實(shí)際上通過(guò)以下兩份觀察結(jié)果證實(shí)了所述酶為盡量降低基于大麥的產(chǎn)品中的T2N水平的有用的失活目標(biāo):(i)Kuroda等人(2005)提出L0X-1活性與麥芽汁T2N潛能之間具有關(guān)聯(lián)，原因主要是由于已經(jīng)認(rèn)為L(zhǎng)0X-2在所述麥芽汁中形成T2N潛能方面的能力較低。然而，麥芽中總LOX活性與麥芽汁T2N潛能之間似乎并沒(méi)有關(guān)聯(lián)；(ii)已經(jīng)描述了能降低大麥中L0X-1活性的方法。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種不同的大麥植株，其共同性質(zhì)是L0X-1活性部分降低或完全降低。例如，具有低L0X-1活性的大麥粒和大麥植株公開(kāi)于Douma，A.C.等人的PCT申請(qǐng)W002/053721中，而B(niǎo)reddam, K.等人的W02005/087934則集中于L0X-1活性有缺失的兩種不同的大麥突變體:剪接位點(diǎn)突變體和具有提前終止密碼子的突變體。此外，Hirota，N.等人的EP1609866描述了通過(guò)篩選收集的大麥地方品種而鑒定到的沒(méi)有L0X-1活性的大麥植株。DMS在基于大麥的飲料中，同時(shí)也在許多蔬菜和食品，包括茶、可可、奶、酒、酒精飲料(如甜酒)、甜玉米和許多烹飪后的蔬菜中，DMS為產(chǎn)品添加了顯著的氣味和風(fēng)味特征。根據(jù)啤酒的類型，DMS水平通?？蛇_(dá)到150ppb(150yg/L)，其中所述化合物經(jīng)常促成不期望的“烹飪后的蔬菜”或“卷心菜樣”的風(fēng)味。因此，不僅感覺(jué)閾值約為30-45 μ g/L(Meilgaard, 1982)是重要的，而且以〈lOppb的水平使DMS衍生的風(fēng)味保持不被察覺(jué)也是重要的。啤酒生產(chǎn)中的上述烘干和麥芽汁煮沸加工步驟影響了基于大麥的飲料中的DMS水平，主要是因?yàn)閮蓚€(gè)所述過(guò)程均可以誘導(dǎo)SMM化學(xué)轉(zhuǎn)化成DMS (參見(jiàn)例如TechnologyBrewing and Malting, Kunze, 2004, VLB Berlin,第 160 頁(yè))。由于化合物 DMS 的沸點(diǎn)僅為37-38° C，因此其大部分將直接蒸發(fā)到大氣中。然而，當(dāng)麥芽汁煮沸的持續(xù)時(shí)間或活力不足以轉(zhuǎn)化殘留的SMM時(shí)，隨著麥芽汁冷卻，DMS可以持續(xù)形成，并且很可能轉(zhuǎn)移到啤酒中。
SMM代表了大麥粒萌芽中幾乎所有(可能所有)的由SMM循環(huán)的功能性組分的作用而合成的DMSP庫(kù)(圖1B)。在此，MMT催化甲基基團(tuán)從S-腺苷-Met (AdoMet)轉(zhuǎn)移到Met上，形成SMM?；衔颯MM可反過(guò)來(lái)作為由高半胱氨酸(Hcy)合成Met的甲基供體，該反應(yīng)由Hcy-S-甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)催化。在科學(xué)文獻(xiàn)中，已經(jīng)認(rèn)為通過(guò)使用例如反義技術(shù)(McElroy和Jacobsen, 1995)可調(diào)節(jié)SMM合成。然而，沒(méi)有提供反義相關(guān)靶基因的指導(dǎo)。盡管如此，曾經(jīng)預(yù)期陽(yáng)性結(jié)果的可能性是可疑的，原因是SMM水平的大量降低可能對(duì)大麥生長(zhǎng)和發(fā)育有害。McElroy和Jacobsen (上文)并沒(méi)有討論用于獲得較低水平的SMM的備選解決方案。同樣，如下文詳細(xì)討論的，反義技術(shù)未曾成功應(yīng)用到大麥中來(lái)完全消除基因表達(dá)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于降低啤酒中DMS水平的技術(shù)方法。因此，AU38578/93描述了降低麥芽中DMS水平的方法,該方法包括蒸汽處理所述麥芽。在Bisgaard-Frantzen, H.等人的專利申請(qǐng)US2006/0057684中描述了包括在> 70° C熱處理醪液(mash)的釀造方法。并且，在Reuther，H的美國(guó)專利號(hào)5，242，694中提到了用于制備低碳水化合物啤酒的方法，其中所述方法包括廣泛煮沸麥芽汁，然后用二氧化碳(CO2)沖洗所述麥芽汁。然而，已知上述所有處理均消耗高水平的能量，可能改變麥芽或麥芽汁的特性。突變的大麥植株(植物)遺憾的是，還沒(méi)有用于制備完全缺乏給定蛋白質(zhì)的表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大麥植物的方法。通常，對(duì)于大麥，應(yīng)用反義技術(shù)產(chǎn)生仍然表達(dá)一些正在討論的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植株(參見(jiàn)，例如Robbins等人，1998; Stahl等人,2004; Hansen等人,2007)。此外，還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出使用嵌合RNA/DNA或定點(diǎn)突變法制備特定突變體的有效方法用于大麥植物。因此，盡管做了大量努力，本申請(qǐng)的發(fā)明人并未找到在大麥中成功實(shí)現(xiàn)寡核苷酸引導(dǎo)的基因靶向的任何已發(fā)表的實(shí)例。盡管沒(méi)有在大麥中進(jìn)行，Iida和Terada(2005)指出已經(jīng)在玉米、煙草和水稻中測(cè)試了由寡核苷酸引導(dǎo)的基因靶向，但所有這些情況均使用抗除草劑基因乙酰乳酸合成酶(ALS)作為靶標(biāo)。 根據(jù)Iida和Terada (上文)的結(jié)論，上述策略經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)是否可用于直接選擇性基因(例如ALS基因)以外的其它基因中還有待確定。盡管還未證實(shí)，但利用鋅指核酶的靶向誘變法代表了可能實(shí)現(xiàn)基礎(chǔ)植物生物學(xué)的未來(lái)研究或農(nóng)作物的修飾的另一工具(Durai等人，2005; Tzfira和White, 2005; Kumar等人，2006)。然而在這種情況下，誘變也沒(méi)有在大麥中實(shí)施或者成功地應(yīng)用于大麥。盡管如此，可以通過(guò)利用輻射或化學(xué)處理，例如利用疊氮化鈉(NaN3)溶液溫育麥粒12小時(shí)至過(guò)夜的隨機(jī)誘變法制備大麥突變體。一個(gè)實(shí)例是為了篩選低肌醇六磷酸(phytate)突變體而用NaN3誘變大麥粒并隨后篩選高水平游離磷酸(Rasmussen和Hatzack, 1998);從2，000個(gè)篩選的麥粒中總共鑒定出10個(gè)突變體。盡管還不是總有可能，但在NaN3處理后找出特定突變體依靠持久不懈的努力和有效的篩選方法。可持續(xù)性在尋求解決其能量、環(huán)境和食物挑戰(zhàn)的世界中，社會(huì)的一個(gè)焦點(diǎn)是限制或減少大氣CO2濃度，尤其集中于工業(yè)系統(tǒng)的CO2排放。主要的原因在于，溫室氣體濃度的增加引起地球能量平衡的改變，而其中CO2是最大的一個(gè)促成因素。作為對(duì)氣候變化普遍關(guān)注的結(jié)果，并也基于經(jīng)濟(jì)理論和約束，啤酒廠可通過(guò)盡可能有效地使用能量，并通過(guò)更有效地減少操作中的溫室氣體排放而起到積極作用。截至目前，焦點(diǎn)已集中在解決上述可持續(xù)性問(wèn)題的技術(shù)手段上。發(fā)明概述現(xiàn)已經(jīng)描述了熱處理方法用于降低LOX活性和DMS的DMS水平。所述熱處理通常在制麥和/或麥芽汁制備的過(guò)程中進(jìn)行，這表示可以使具有LOX活性的產(chǎn)物聚集在大麥中直至進(jìn)行熱處理。大麥的分析表明，大麥中存在顯著量的具有LOX活性的產(chǎn)物，甚至在制麥前便是如此(Wackerbauer和Meyna, 2002)。顯然,熱處理方法是高度耗能的。本發(fā)明提供了用于制備基于谷類的飲料的方法，所述飲料具有低水平的一種或多種異味物及其前體(非常低水平的DMS和T2N及其前體)，其中所述方法包括低能量輸入，所述方法包括以下步驟:(i)提供谷類 植株或其部分，其中所述谷類植株物包含:(a)導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變；和(b)導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變；和(c)導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變；(ii)任選地對(duì)所述谷類的至少一部分進(jìn)行制麥，由此獲得發(fā)芽的谷類；(iii)糖化所述谷類和/或發(fā)芽的谷類和任選的額外輔料，由此獲得麥芽汁；(iv)任選地在存在額外成分時(shí)加熱所述麥芽汁，其中使最多4%的麥芽汁體積被蒸發(fā)掉，由此獲得加熱的麥芽汁；(V)將所述加熱的麥芽汁加工成飲料；由此制得具有低水平的一種或多種異味物及其前體的來(lái)源于谷類的飲料。特別地，本發(fā)明提供了用于制備具有低水平的一種或多種異味物及其前體(非常低水平的DMS和T2N及其前體)的基于大麥的飲料的方法，其中所述方法包括減少能量輸入，所述方法包括以下步驟:(i)提供大麥植株或其部分，其中所述大麥植株包含:(a)導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變；和(b)導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變；和(c)導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變；(ii)任選地對(duì)至少部分所述大麥進(jìn)行制麥，由此獲得發(fā)芽的大麥；(iii)糖化所述大麥和/或發(fā)芽的大麥和任選的額外輔料，由此獲得麥芽汁；(iv)任選地在存在額外成分時(shí)加熱所述麥芽汁，其中使最多4%的麥芽汁體積被蒸發(fā)掉，由此獲得加熱的麥芽汁；(V)將所述加熱的麥芽汁加工成飲料；由此制得具有低水平的一種或多種異味物及其前體的來(lái)源于大麥的飲料。本發(fā)明的目的還有提供適合用于所公開(kāi)的方法的大麥植物(植株)。因此，本發(fā)明的目的是提供農(nóng)藝學(xué)上有用的大麥植株，其同時(shí)包含所述三種不同的特征，即無(wú)效L0X-1-無(wú)效L0X-2-無(wú)效MMT (本文也稱為“雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT ”)大麥植株。利用下文詳細(xì)描述的生物化學(xué)試驗(yàn)，有用大麥植株的選擇不僅涉及植株活力，還涉及L0X-1、L0X-2和MMT酶活性的組合缺失。本發(fā)明的大麥植株可被引入至任何合適的育種程序，如自交、回交、群體雜交等。加快植物育種過(guò)程的方法包括通過(guò)應(yīng)用組織培養(yǎng)和再生技術(shù)對(duì)所產(chǎn)生的突變體進(jìn)行初始擴(kuò)繁。如實(shí)施例3中描述的和圖3中圖示的，使用常規(guī)大麥育種方案由雙無(wú)效LOX大麥植株和無(wú)效MMT植株產(chǎn)生具有雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT特征的大麥植株。因此，本發(fā)明另一個(gè)方面提供了生長(zhǎng)和分化后產(chǎn)生具有雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT特征的大麥植株的細(xì)胞。例如，育種可以包括傳統(tǒng)雜交、使用如花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng)的組織培養(yǎng)制備源自可育花藥的雙單倍體植株。本發(fā)明公開(kāi)了通過(guò)使用無(wú)效LOX谷?？蓪?shí)現(xiàn)烘干用能量輸入的減少，這是由于不需要失活內(nèi)源的LOX酶?？衫帽景l(fā)明描述的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT產(chǎn)生缺少相應(yīng)酶活性的原材料，使目的突變體在制麥廠的烘干過(guò)程中實(shí)現(xiàn)較低的能量消耗，但由于減少在麥芽汁煮沸過(guò)程中的熱量輸入，因此也可用于釀酒廠。從啤酒或飲料質(zhì)量觀點(diǎn)上看，為了從功能上消除或顯著降低產(chǎn)品中的T2N和DMS水平，也需要雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT原材料。 除了雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥芽的上述潛在性質(zhì)外，相應(yīng)的大麥也可以用于產(chǎn)生低異味的大麥啤酒，低異味的大麥啤酒在本文中定義為通過(guò)省略制麥步驟但提供了由許多外加酶(例如Ondea Pro，其為Novozymes生產(chǎn)的酶混合物)組成的醪液生產(chǎn)的啤酒。如下文實(shí)施例7中所解決的，本發(fā)明人驚喜地發(fā)現(xiàn)通過(guò)糖化未發(fā)芽的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥原材料產(chǎn)生的麥芽汁含有非常低水平的T2N和DMS異味物，而盡管大麥粒未經(jīng)過(guò)萌芽，來(lái)自野生型大麥的麥芽汁的DMS水平卻令人驚奇地高。因此，在干燥成熟的大麥粒中一定存在一些DMS前體(DMSP)，這是一種新的尚未描述的性質(zhì)，且在本申請(qǐng)的啤酒產(chǎn)品中得到了探究。因此，為了使新鮮和陳化啤酒產(chǎn)品中的T2N和DMS水平降至最低，可使用雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT谷粒生產(chǎn)大麥釀造的麥芽汁和啤酒。


圖1顯示了導(dǎo)致T2N㈧和SMM⑶形成的大麥生物化學(xué)途徑的簡(jiǎn)化圖。用黑色框突顯三無(wú)效大麥中缺失的酶。酶縮寫如本申請(qǐng)中的定義。圖1B顯示了 SMM循環(huán)的所選組分，在該循環(huán)中Met-S-甲基轉(zhuǎn)移酶(MMT)催化甲基從S-腺苷甲硫氨酸(SAM)轉(zhuǎn)移到甲硫氨酸(Met)上從而合成SMM。SMM可反過(guò)來(lái)作為甲基供體，在Hcy-S-甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)催化的反應(yīng)中由高半胱氨酸(Hcy)合成Met。圖解顯示了本質(zhì)上可逆的反應(yīng)是如何連接的。由于將ATP轉(zhuǎn)化成腺苷酸PPi和Pi (未顯示)的同時(shí)消耗并隨后再生了兩個(gè)Met，因此每輪循環(huán)都是無(wú)效的。圖2顯示了證明突變體8063和突變體14018的無(wú)效MMT表型的HPLC實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。(A)來(lái)自cv.Prestige苗的提取物的基于HPLC分離的實(shí)例,顯示了天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)和SMM的洗脫。在340nm激發(fā)大麥苗衍生自O(shè)PA的提取物的熒光并在450nm測(cè)定發(fā)射。(B)來(lái)自所示突變體和野生型cv.Sebastian的提取物的基于HPLC的分離。突變體提取物中組分的分離產(chǎn)生了無(wú)SMM特異峰的色譜圖。圖3顯示了無(wú)效L0X-1-無(wú)效L0X-2 (雙無(wú)效L0X)和無(wú)效MMT大麥植株雜交產(chǎn)生三無(wú)效大麥的流程圖。圖4突顯了來(lái)自所示植株的樣品的LOX活性。成熟大麥粒中總LOX活性測(cè)定結(jié)果用灰色柱顯示，萌芽胚的L0X-2活性則用黑色柱表示。在無(wú)效L0X-1-無(wú)效L0X-2和三無(wú)效植株中均觀察到了非常低的LOX活性。
圖5顯示了萌芽的三無(wú)效植株不能合成SMM(上圖，其中在UPLC色譜圖中缺失相應(yīng)的峰)，而在萌芽的野生型大麥cv.Quench的提取物中可容易地以相應(yīng)的色譜峰而檢測(cè)到所述化合物(下圖)。所選氨基酸的洗脫位置如圖所示。圖6詳細(xì)圖示了微制麥和微糖化(A)的流程圖，以及來(lái)自野生型大麥(B)和三無(wú)效突變體(C)的麥粒的中試制麥、中試糖化和中試釀造的流程。利用箭頭圖示了各樣品(灰色框標(biāo)記)的流程圖。在列表的上部用粗體字標(biāo)識(shí)了初始、中間和最終產(chǎn)物；過(guò)程是斜體字型。在(A)中，流程圖下的斜體數(shù)字表示用于測(cè)定游離T2N及其前體(2和4)和DMSP和DMS(1、2、3)的水平的取樣點(diǎn),其中測(cè)定點(diǎn)4代表了冷卻后的熱麥芽汁。對(duì)于大麥面粉的微糖化，在取樣點(diǎn)2、3和4上測(cè)定樣品。在⑶和(C)中，在所有取樣點(diǎn)上測(cè)定DMSP、DMS、T2N前體和游離T2N的水平。圖7顯示了無(wú)論是加壓或正常的麥芽汁煮沸，三無(wú)效麥芽制備的啤酒產(chǎn)生的啤酒泡沫均為由野生型cv.Quench的麥芽釀造的啤酒的大約四倍。圖8提供了可以如何繁殖NaN3誘變的大麥粒的一個(gè)實(shí)例。MO代的麥粒長(zhǎng)成發(fā)育Ml代麥粒的植株?？梢圆シN這些麥粒用于發(fā)育成Ml植株，該Ml植株產(chǎn)生M2代的新麥粒。然后，M2植株生長(zhǎng)并產(chǎn)生M3代的麥粒?？稍试SM3代的麥粒萌芽，例如用于分析萌芽的M3植株的胚芽鞘。此外，來(lái)自M3植株的麥粒的花可用于與大麥系或栽培品種雜交，以獲得M4代的植株。類似的圖在Breddam, K.等人的PCT專利申請(qǐng)W02005/087934中以圖1A顯示。圖9顯示了優(yōu)選的啤酒生產(chǎn)工藝的簡(jiǎn)化圖示概要，其包括浸泡大麥谷粒(I)、制麥(2)、烘干(3)、研磨干燥的麥芽(4)、糖化(5)、過(guò)濾￠)、在添加酒花的情況下煮沸麥芽汁(7)、在存在酵母的情況下發(fā)酵(8)、啤酒熟化(9)、啤酒過(guò)濾(10)、包裝如包裝到瓶和罐等中(11)和貼標(biāo)簽(12)。這些獨(dú)立的步驟可以分組成包括生產(chǎn)麥芽(1-3)、生產(chǎn)麥芽汁(4-7)、發(fā)酵(8-9)和制備成品啤酒(10-12)的部分。雖然圖示的是優(yōu)選的方法，但也可以預(yù)期省略一些所述步驟(例如可以省略過(guò)濾或者可以不加入酒花，或者可以加入額外步驟例如添加輔料、糖、糖漿或碳酸鹽)的其它方法。
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圖10顯示了如何在使用無(wú)效L0X-1原材料產(chǎn)生的啤酒(包含50%無(wú)效L0X-1的混合物)和麥芽汁樣品(三無(wú)效)中鑒定到衍生自無(wú)效L0X-1的DNA片段，而在使用普通麥芽和野生型大麥(Tuborg)的混合物的面粉生產(chǎn)的啤酒中則沒(méi)有鑒定到。最終PCR擴(kuò)增的模板體積如圖所示。發(fā)明詳述定義在隨后的說(shuō)明書(shū)、附圖和表格中使用了許多術(shù)語(yǔ)。為了提供包括給出這些術(shù)語(yǔ)的范圍的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，提供了下列定義:本文使用的“a”可以指一個(gè)或多個(gè)，這取決于其使用的上下文。術(shù)語(yǔ)“農(nóng)學(xué)特征”描述了有助于形成所述植物(植株)的性能或經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物表型或遺傳學(xué)特征。這種特征包括抗病性、抗蟲(chóng)性、抗病毒性、抗線蟲(chóng)性、耐旱性、高鹽度耐受性、產(chǎn)量、株高、成熟天數(shù)、麥粒分級(jí)(即麥粒的大小分級(jí))和麥粒的含氮量等。與基于大麥的飲料，如啤酒的制造工藝相關(guān)，特別是用于描述制麥過(guò)程時(shí)，術(shù)語(yǔ)“大麥”是指大麥粒。在其它所有情況下，除非另有說(shuō)明，否則“大麥”是指包括任何培育品系或栽培品種或變種(variety)在內(nèi)的大麥植物(Hordeum vulgare, L.),而大麥植物的部分可以是大麥植物的任何部分，例如任何組織或細(xì)胞。在“大麥釀造”的過(guò)程中，麥芽汁可以通過(guò)將未發(fā)芽大麥的提取物與水解大麥成份的酶混合物一起溫育而制備。通過(guò)大麥釀造生產(chǎn)的麥芽汁可稱為“大麥麥芽汁”或“大麥釀造的”麥芽汁。“抗病性”指植物避免出現(xiàn)作為植物-病原體相互作用的結(jié)果的疾病癥狀。這樣阻止了病原體引起植物疾病和相關(guān)的疾病癥狀?；蛘?，由病原體引起的疾病癥狀被減到最小，或降低，甚至得到預(yù)防。本文使用的“DMSP”是DMS前體或DMS潛能的縮寫，即可在飲料生產(chǎn)過(guò)程中轉(zhuǎn)化成DMS的分子。SMM即使不代表所有也代表了大部分的DMSP。本文將DMSP的水平定義為DMS的量，所述DMS可通過(guò)在堿性條件下煮沸I小時(shí)在特定植物材料或其產(chǎn)物中由DMSP產(chǎn)生。如本文所定義，IppbDMSP可轉(zhuǎn)化成Ippb DMS。本文使用的術(shù)語(yǔ)“雙無(wú)效LOX”是指導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變和導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變。因此，“雙無(wú)效LOX大麥植株”是包含導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變和導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變的大麥植株。類似地，“雙無(wú)效LOX麥?！笔蔷哂袑?dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變和導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變的麥粒。術(shù)語(yǔ)“雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT”指導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變和導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變以及導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變。因此，“雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株”是包含導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變和導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變以及導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變的大麥植株。類似地，“雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥?！笔蔷哂袑?dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變和導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變以及導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變的麥粒。有用的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT的實(shí)例稱為“三無(wú)效”并描述于下文實(shí)施例中。在本文中定義的“谷類”植物是禾本科(Graminae)植物家族的成員，其中種植禾本科植物主要是為了獲取其含淀粉的種子或麥粒。谷類植物包括，但不限于大麥(Hordeum)、小麥(Triticum)、稻(Oryza)、玉米(Zea)、黑麥(Secale)、燕麥(Avena)、高粱(Sorghum)和黑小麥(Triticale,黑麥-小麥雜交種)。在有關(guān)特定核酸的上下文中，“編碼”或“編碼的”表示包含用于翻譯成特定蛋白質(zhì)的信息。編碼蛋白質(zhì)的核酸或多核苷酸可以包含位于核酸翻譯區(qū)中的非翻譯序列(例如內(nèi)含子)，或者可以缺乏這種插入的非翻譯序列(例如在cDNA中)。利用密碼子對(duì)編碼蛋白質(zhì)的信息進(jìn)行說(shuō)明。本文在有關(guān)核酸的上下文中使用的“表達(dá)”應(yīng)理解為來(lái)源于核酸片段的正義mRNA或者反義RNA的轉(zhuǎn)錄和累積。在有關(guān)蛋白質(zhì)的上下文中使用的“表達(dá)”指將mRNA翻譯成多肽。
術(shù)語(yǔ)“基因”指參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA片段；其包括在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域(啟動(dòng)子和終止子)。此外，植物基因通常由被內(nèi)含子中斷的外顯子組成。在轉(zhuǎn)錄成RNA之后，通過(guò)剪接除去內(nèi)含子以產(chǎn)生成熟的信使RNA(mRNA)。通常通過(guò)充當(dāng)剪接過(guò)程的剪接信號(hào)的共有序列確定外顯子和內(nèi)含子之間的“剪接位點(diǎn)”，剪接過(guò)程由從初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄本刪除內(nèi)含子和在切去內(nèi)含子的任一側(cè)連接或融合剩余RNA的末端而組成。在一些情況下，交互的或不同的剪接模式可以從同一單個(gè)DNA延伸段產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。天然基因被可以稱為“內(nèi)源基因”。本文使用的“異源”在指核酸時(shí)表示來(lái)源于外來(lái)物種的核酸，或者如果源于相同物種，則是通過(guò)目的性人為干預(yù)在組成和/或基因座方面對(duì)其天然形式進(jìn)行實(shí)質(zhì)上的修飾的核酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)“萌芽(germination) ”表示大麥粒在各種組合物中，例如在見(jiàn)于自然界的普通土壤中開(kāi)始或恢復(fù)生長(zhǎng)。因此，萌芽胚是正在萌芽的胚。萌芽也可以在置于培養(yǎng)室等的盆內(nèi)土壤中進(jìn)行，或者，例如可以在置于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室皮氏培養(yǎng)皿的濕濾紙上進(jìn)行，或者在制麥的過(guò)程中進(jìn)行(例如制麥廠的浸泡罐或萌芽盒內(nèi)進(jìn)行)。按照一般理解，萌芽包括麥粒的水合作用、麥粒的膨脹和誘導(dǎo)胚生長(zhǎng)。影響萌芽的環(huán)境因素包括濕度、溫度和氧水平。觀察根和芽的發(fā)育。術(shù)語(yǔ)“麥粒”被定義為包括谷類穎果，也稱為內(nèi)部種子(internal seed)、外稃和內(nèi)稃。在大多數(shù)大麥品種中，外稃和內(nèi)稃附著于穎果上，而且是脫粒后的麥粒的一部分。但是，還存在裸麥(naked barley)品種。在這些品種中，穎果沒(méi)有外稃和內(nèi)稃，因此像小麥一樣脫粒。術(shù)語(yǔ)“麥?！焙汀肮攘！痹诒疚闹锌梢曰ビ?。“谷粒發(fā)育”是指開(kāi)始于花粉細(xì)胞對(duì)卵細(xì)胞受精的過(guò)程。在受精過(guò)程中，借助或不借助液泡尋IE (vacuole targeting)而將代謝儲(chǔ)物(例如糖、寡糖、淀粉、酹類、氨基酸和蛋白質(zhì))儲(chǔ)藏至麥粒(谷粒)的各種組織，例如胚乳、外種皮、糊粉和角質(zhì)鱗片，由此導(dǎo)致麥粒(谷粒)膨脹，麥粒(谷粒)灌漿，并且結(jié)束于麥粒(谷粒)脫水。術(shù)語(yǔ)“功能完全喪失”是指缺乏給定酶活性。因此，“功能性L0X-1和L0X-2完全喪失”的大麥植株是 沒(méi)有可檢測(cè)到的L0X-1和L0X-2活性的大麥植株。雖然L0X-1和L0X-2酶可具有其它活性，但在本發(fā)明中，L0X-1和L0X-2活性是通過(guò)測(cè)定由亞油酸形成9-HP0DE和13-HP0DE的試驗(yàn)過(guò)程確定的。優(yōu)選地，按照國(guó)際專利PCT/DK2009/050355實(shí)施例4的描述測(cè)定由亞油酸形成9-HP0DE和13-HP0DE。應(yīng)該利用萌芽胚的蛋白提取物測(cè)定所述活性。在本發(fā)明中，當(dāng)利用亞油酸作為底物，產(chǎn)生出的色譜峰對(duì)應(yīng)于小于5%、優(yōu)選小于3%的國(guó)際專利PCT/DK2009/050355圖5A所示的標(biāo)準(zhǔn)品9-HP0DE峰，和/或產(chǎn)生出的色譜峰對(duì)應(yīng)于小于5%，優(yōu)選小于3%的國(guó)際專利PCT/DK2009/050355圖5A所示的標(biāo)準(zhǔn)品13-HP0DE峰時(shí)，則認(rèn)為在使用國(guó)際專利PCT/DK2009/050355實(shí)施例4所述的試驗(yàn)時(shí)，沒(méi)有可檢測(cè)到的L0X-1和L0X-2活性。實(shí)現(xiàn)功能性LOX完全喪失的分子方法包括產(chǎn)生引起所述酶的轉(zhuǎn)錄本完全缺失或相應(yīng)的編碼酶完全缺失的突變，或者產(chǎn)生使所編碼的酶完全失活的突變。類似地，“功能性MMT完全喪失”的大麥植株指當(dāng)使用下文實(shí)施例2中描述的試驗(yàn)時(shí)缺乏MMT酶活性，即沒(méi)有可檢測(cè)到的MMT活性的大麥植物?；蛘?，通過(guò)分離所述大麥的MMT cDNA并測(cè)定所述cDNA編碼的蛋白質(zhì)是否能夠催化SAM向Met轉(zhuǎn)移甲基基團(tuán)并形成SMM來(lái)測(cè)定大麥植物的MMT活性。術(shù)語(yǔ)“L0X-1活性”是指大麥L0X-1酶的酶活性。特別地，在本發(fā)明中，“L0X-1活性”是由亞油酸至9-HP0DE且較小程度地至13-HP0DE的酶促雙加氧作用。盡管L0X-1能夠催化其它反應(yīng)，但為了確定本發(fā)明的L0X-1的活性，僅應(yīng)考慮形成9-HP0DE和13-HP0DE的活性。圖1A概述了亞油酸被轉(zhuǎn)化為9-HP0DE的生化途徑。術(shù)語(yǔ)“L0X-2活性”是指大麥L0X-2酶的酶活性。特別地，在本發(fā)明中，“L0X-2活性”是由亞油酸至13-HP0DE且較小程度至9-HP0DE的酶促雙加氧作用。盡管L0X-2能夠催化其它反應(yīng)，但為了測(cè)定本發(fā)明的L0X-2的活性，僅應(yīng)考慮形成13-HP0DE和9-HP0DE的活性。圖1A概述了亞油酸被轉(zhuǎn)化為13-HP0DE的生化途徑。術(shù)語(yǔ)“麥芽飲料”和術(shù)語(yǔ)“基于麥芽的飲料”是指利用麥芽制備的飲料，優(yōu)選通過(guò)包括用熱水溫育麥芽的步驟的方法制備的飲料。所述術(shù)語(yǔ)在本文中可互換使用。麥芽飲料可以是例如啤酒或無(wú)酒精麥芽飲料(maltinas)。也可以使用“大麥釀造”(參考上述定義)來(lái)生產(chǎn)本申請(qǐng)的啤酒。術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵的麥芽飲料”是指已經(jīng)發(fā)酵的，即與酵母溫育的麥芽飲料?！爸汽湣笔窃诎ǖ幌抻谥汽湉S的浸泡池和萌芽箱內(nèi)的受控環(huán)境條件下進(jìn)行的大麥粒的特殊萌芽形式。根據(jù)本發(fā)明的方法，制麥在浸泡大麥粒期間和/或已經(jīng)浸泡大麥粒之后開(kāi)始發(fā)生?？梢酝ㄟ^(guò)干燥大麥粒，例如在烘干過(guò)程中終止制麥過(guò)程。通常烘干在高溫下進(jìn)行，但是本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是烘干可以在較低的溫度下進(jìn)行。在還沒(méi)有烘干的情況下，麥芽被稱為“綠麥芽”。應(yīng)理解，由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥制備的麥芽組合物包含雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥芽，例如純的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥芽或者包含雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥芽的任何麥芽混合物。優(yōu)選地，所述組合物僅由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥制備。可以對(duì)麥芽進(jìn)行加工，例如通過(guò)碾磨而加工，并由此被稱為“經(jīng)碾磨的麥芽”或“面粉”。“糖化”是經(jīng)碾磨的麥芽在水中的溫育。優(yōu)選在特定溫度和特定體積的水中進(jìn)行糖化。水的溫度和體積是重要的，因?yàn)槠溆绊憗?lái)源于麥芽的酶活性的下降速率，并由此特別影響能夠發(fā)生的淀粉水解的量；蛋白 酶作用也可具有重要性。糖化可以在輔料存在下發(fā)生，應(yīng)該理解輔料包含除麥芽以外的任何碳水化合物源，例如但不限于作為完整麥粒或者經(jīng)加工的產(chǎn)品(例如粗面粉、糖漿或淀粉)的大麥(包括例如，雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥)、大麥糖漿或玉米或稻。上文提及的所有輔料都主要用作提取物的其它來(lái)源(在麥芽汁加熱的過(guò)程中常添加糖漿)。釀酒廠內(nèi)輔料的加工要求取決于使用的輔料的狀態(tài)和類型，并且特別是淀粉膠化或液化的溫度。如果膠化溫度超過(guò)正常的麥芽糖化溫度，則淀粉在添加至醪液中之前就被膠化和液化。術(shù)語(yǔ)“MMT活性”指大麥甲硫氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶活性。在本發(fā)明中，“MMT活性”是由MMT催化在Met的硫原子上的甲基化作用以產(chǎn)生SMM。即使MMT酶能夠催化其它反應(yīng)，但為了確定本發(fā)明的MMT的活性，僅應(yīng)考慮SMM形成活性。圖1B描述了通過(guò)甲基化將Met轉(zhuǎn)化成SMM的生物化學(xué)反應(yīng)?！巴蛔儭卑ɑ虻木幋a和非編碼區(qū)的缺失、插入、取代、易位和點(diǎn)突變。缺失可以是整個(gè)基因或者僅基因的一部分的缺失，其中，非編碼區(qū)優(yōu)選為啟動(dòng)子區(qū)或者終止區(qū)或者內(nèi)含子。點(diǎn)突變可涉及一個(gè)堿基或者一個(gè)堿基對(duì)的變化，并且可產(chǎn)生終止密碼子、移框突變或氨基酸取代。參考本文的圖8，其顯示了在育種程序中如何繁殖突變大麥谷粒的概述，M3代的谷粒和其直接繁殖的谷粒或者包括其植物在內(nèi)的任意子代可以稱為“原始突變體(rawmutant)”。此外，仍然參照本文圖8，術(shù)語(yǔ)“育種系”是指M4代的谷粒和包括其植物在內(nèi)的任意子代，其可能是與栽培品種植株的雜交結(jié)果，或者是與具有單獨(dú)的特定特征的另一育種系雜交的結(jié)果。術(shù)語(yǔ)“無(wú)效LOX (或LOX無(wú)效)”是指LOX編碼基因中存在引起所編碼的LOX酶(L0X-1或L0X-2或L0X-1和L0X-2)的功能完全喪失的突變。在LOX編碼基因中產(chǎn)生提前終止(無(wú)義)密碼子的突變僅代表能夠?qū)崿F(xiàn)功能性LOX的完全喪失的一種機(jī)制。實(shí)現(xiàn)功能性LOX的完全喪失的分子方法包括產(chǎn)生引起所述酶的轉(zhuǎn)錄本完全缺失的突變，或者產(chǎn)生引起所編碼的酶完全失活的突變。與植物(植株)有關(guān)的“無(wú)效LOX (或LOX無(wú)效)”是指具有導(dǎo)致功能性LOX酶完全喪失的突變的植物(植株)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“無(wú)效MMT (或MMT無(wú)效)”指功能性S-腺苷甲硫氨酸:甲硫氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(也稱為甲硫氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶)的完全喪失。因此，“無(wú)效MMT大麥植株”是在編碼麗T的基因中包含導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的突變的大麥植株。類似地，“無(wú)效MMT麥粒”是在編碼MMT的基因中包含導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的突變的麥粒。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是用于指兩個(gè)或更多個(gè)核酸片段連接在單個(gè)多核苷酸上，從而使一個(gè)片段的功能受另一個(gè)的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)，即編碼序列處于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下時(shí)，啟動(dòng)子與編碼序列可操作地連接?？梢砸哉x或反義方向?qū)⒕幋a序列與調(diào)控序列可操作地連接。“PCR”或“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)(Mul I is, K.B.等人的美國(guó)專利第4，683，195和4，800，159號(hào))?！爸参铩被颉爸参锊牧稀卑梢栽偕龃篼溨仓甑闹参锛?xì)胞、植物原生質(zhì)體和植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物，包括植物愈傷組織和在植物中的完整植物細(xì)胞，或植物部分，例如胚、花粉、胚珠、花、麥粒、葉、根、根尖、花藥，或植物的任何部分或產(chǎn)品。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物材料可以是無(wú)法再生出大麥植株的植物細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“植物(植株)產(chǎn)品”表示通過(guò)加工植物或植物材料生產(chǎn)的產(chǎn)品。因此，所述植物產(chǎn)品例如可以是，例如麥芽、麥芽汁、發(fā)酵的或未發(fā)酵的飲料、食品，或飼料產(chǎn)品。本文使用“重組體”涉及蛋白質(zhì)時(shí)表示源于外來(lái)物種的蛋白質(zhì)，或者如果來(lái)源于相同物種，則表示通過(guò)目的性人為干預(yù)在組成上對(duì)其天然形式進(jìn)行實(shí)質(zhì)上的修飾的蛋白質(zhì)。

本申請(qǐng)含義內(nèi)的“啤酒品嘗專家小組”是在品嘗和表述啤酒風(fēng)味(主要集中于醛、紙樣味道、陳化(old)味道、酯、高級(jí)醇、脂肪酸和硫組分)方面受過(guò)全面訓(xùn)練的專家小組。雖然存在許多用于評(píng)價(jià)風(fēng)味成分的分析工具，但難以通過(guò)分析來(lái)評(píng)價(jià)風(fēng)味活性組分的相對(duì)顯著性。但是，此類復(fù)雜的性質(zhì)可以由品嘗專家進(jìn)行評(píng)價(jià)。品嘗專家的持續(xù)訓(xùn)練包括品嘗并評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)啤酒樣品。術(shù)語(yǔ)“剪接位點(diǎn)”表示基因的外顯子和內(nèi)含子之間的界限。因此，剪接位點(diǎn)可以是從外顯子至內(nèi)含子的邊界(被稱為“供體位點(diǎn)”)，或者是從外顯子分隔內(nèi)含子的邊界(被稱為“受體位點(diǎn)”)。植物的剪接位點(diǎn)通常包括共有序列。內(nèi)含子的5’末端通常由保守性GT 二核苷酸(mRNA中為⑶)組成，內(nèi)含子的3’末端通常由保守性二核苷酸AG組成。因此，內(nèi)含子的5’剪接位點(diǎn)包含內(nèi)含子的5’末端，而3’剪接位點(diǎn)包含內(nèi)含子的3’末端。優(yōu)選地，在本發(fā)明中，內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)是由內(nèi)含子的最5’端的二核苷酸(通常為GT)組成的5’剪接位點(diǎn)，或者由內(nèi)含子的最3’端的二核苷酸(通常為AG)組成的3’剪接位點(diǎn)。除非另有指明，否則“T2N”表示游離形式的反式-2-壬烯醛(T2N)。T2N有時(shí)還指2-E-壬烯醛。術(shù)語(yǔ)“T2N潛能(T2N potential) ”描述的是能夠在一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)中釋放T2N，或者被轉(zhuǎn)化成T2N的化學(xué)物質(zhì)。在本發(fā)明中，T2N潛能被定義為在100°C、pH4.0溫育2小時(shí)的過(guò)程中釋放至溶液，例如麥芽汁或者啤酒中的T2N的濃度。實(shí)際上，測(cè)定起始T2N濃度，之后使溶液在100°C、pH4溫育2小時(shí)，然后測(cè)定T2N濃度。起始T2N濃度和最終T2N濃度之間的差異被稱為T2N潛能。酸性下的熱處理引起T2N潛能例如“T2N加合物”釋放T2N，其中T2N加合物用以描述與一種或多種物質(zhì)，包括但不限于蛋白質(zhì)、亞硫酸鹽、細(xì)胞碎片或細(xì)胞壁等結(jié)合的T2N。T2N加合物本身通常不會(huì)被人感覺(jué)為異味。但是，從所述T2N加合物釋放的T2N可以產(chǎn)生異味?！敖M織培養(yǎng)物”表示包含相同或不同類型的分離細(xì)胞的組合物，或組織成為植物的部分(包括例如原生質(zhì)體、愈傷組織、胚、花粉和花藥等)中的那些細(xì)胞的集合。本文使用的“轉(zhuǎn)基因”包括是指已經(jīng)通過(guò)引入異源核酸而被修飾的細(xì)胞，或由如此修飾的細(xì)胞衍生而來(lái)的細(xì)胞。因此，例如，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)未以相同形式見(jiàn)于天然形式的細(xì)胞中的基因，或者表達(dá)由于目的性人為干預(yù)而異常表達(dá)、低表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。本文使用的與植物，特別是大麥植物有關(guān)的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”不包括通過(guò)傳統(tǒng)植物育種方法，例如基于NaN3的誘變法，以及不是通過(guò)目的性人工干預(yù)的天然發(fā)生事件產(chǎn)生的細(xì)胞改變。“野生大麥”,即Hordeum vulgare ssp.spontaneum被認(rèn)為是大麥當(dāng)今栽培形式的祖先。認(rèn)為大麥從野生至栽培狀態(tài)的轉(zhuǎn)變與該植物向“大麥當(dāng)?shù)仄贩N”的馴化同時(shí)發(fā)生。這些大麥當(dāng)?shù)仄贩N在遺傳上比野生大麥更接近于現(xiàn)代栽培品種。術(shù)語(yǔ)“野生型”大麥?zhǔn)侵赴凑諅鹘y(tǒng)方式產(chǎn)生的大麥植株。優(yōu)選地，該術(shù)語(yǔ)是指已經(jīng)衍生出本發(fā)明大麥植株的大麥植株，即親本植株。野生型大麥粒通?？勺鳛椤霸耘嗥贩N”或“變種/品種”(即那些由國(guó)家植物育種組織列出的在遺傳上相似的麥粒)而獲自例如種子公司。盡管可以獲得幾個(gè)無(wú)效L0X-1大麥栽培品種(例如cv.Chamonix和cv.Charmay),但為了更好地理解本發(fā)明，所有的無(wú)效L0X-1、無(wú)效L0X-2、雙無(wú)效LOX和雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT植株在本文中都被認(rèn)為是突變植株而非野生型植株。術(shù)語(yǔ)“栽培品種”和“變種”在本文中可互換使用。 術(shù)語(yǔ)“麥芽汁”表示麥芽，例如碾磨過(guò)的麥芽或綠麥芽或者碾磨過(guò)的綠麥芽的液體提取物。在大麥釀造中，麥芽汁還可以通過(guò)將未發(fā)芽大麥的提取物與水解大麥成分的酶混合物一起溫育而制備。除所述麥芽或源自大麥的提取物外，還可以由麥芽和額外的成分，例如部分轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的額外含淀粉物質(zhì)制備所述液體提取物。麥芽汁通常通過(guò)糖化，隨后任選的“噴射提取(sparging)”(即在用熱水糖化后從用過(guò)的谷粒提取殘留糖和其它化合物的過(guò)程)而獲得。噴射提取通常在濾桶、麥芽漿過(guò)濾器或可以從用過(guò)的谷粒分離提取水的另一種設(shè)備內(nèi)進(jìn)行。糖化后獲得的麥芽汁通常被稱為“第一麥芽汁”，而噴射提取后獲得的麥芽汁通常被稱為“第二麥芽汁”。如非特別指明，術(shù)語(yǔ)麥芽汁可以是第一麥芽汁、第二麥芽汁或者二者的組合。在傳統(tǒng)的啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，麥芽汁與酒花一起煮沸，然而本發(fā)明提供了用于減少麥芽汁煮沸或避免麥芽汁煮沸的方法。沒(méi)有酒花的麥芽汁還可以稱為“甜麥芽汁”，而與酒花一起煮沸/加熱的麥芽汁可被稱為“煮沸的麥芽汁”。制備基于大麥的飲料的方法本發(fā)明涉及用于制備具有低水平異味物及其前體的基于大麥的飲料的方法，其中所述方法涉及減少能量輸入。所述異味物為下文所述，但該異味物優(yōu)選為T2N和DMS。所述方法包括使用大麥植物，其優(yōu)選為雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植物。此類大麥植株將在下文作更詳細(xì)地描述。盡管在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用未發(fā)芽的大麥制備基于大麥的飲料，但根據(jù)本發(fā)明，所述方法一般包括使所述雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株發(fā)芽的步驟。發(fā)芽將在下文“制麥”部分作更詳細(xì)地描述。所述方法還包括在任選存在額外的輔料的情況下，通過(guò)糖化雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥或雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥芽或其混合物制備麥芽汁的步驟。糖化將在下文“糖化”部分作更詳細(xì)地描述。所述方法還包括在任選地存在額外成分的情況下加熱所述麥芽汁的步驟，其中最多4%，例如最多2%的麥芽汁體積被蒸發(fā)掉，由此獲得加熱后的麥芽汁。該步驟將在“加熱麥芽汁”部分作更詳細(xì)地描述。最后，所述方法包括將加熱后的麥芽汁加工成飲料。該部分將在下文“飲料制備”部分作更詳細(xì)地描述。制麥(malting)術(shù)語(yǔ)“制麥”應(yīng)理解為浸泡后的大麥粒在受控環(huán)境條件下發(fā)生的萌芽過(guò)程，例如在圖9中步驟2和步驟3所示的過(guò)程，以及其后的干燥步驟。所述干燥步驟可優(yōu)選為萌芽麥粒在高溫下的烘干。干燥前，浸泡并萌芽的大麥谷粒被稱為“綠麥芽”，其也可以代表本發(fā)明的植物產(chǎn)品。該制麥?zhǔn)录纳鲜鲰樞驅(qū)τ谝鸸攘８淖兊亩喾N酶的合成都很重要，而谷粒改變主要是解聚死亡胚乳細(xì)胞的細(xì)胞壁以動(dòng)員谷粒養(yǎng)分并激活其它解聚酶的過(guò)程。在隨后的干燥過(guò)程中，由于化學(xué)褐變反應(yīng)而產(chǎn)生風(fēng)味和顏色。制麥?zhǔn)歉叨群哪艿倪^(guò)程。由于需要高溫，烘干也尤其是一個(gè)耗能過(guò)程。烘干有幾個(gè)目的，具體包括:(i)干燥萌芽后的大麥粒；(ii)終止萌芽；(iii)變性脂肪氧化酶以降低T2N和T2N潛能的水平；和(iv)從前體產(chǎn)生DMS并去除DMS以降低DMS潛能和DMS的水 平。 根據(jù)本發(fā)明，烘干可以在低溫下進(jìn)行，并且仍然能實(shí)現(xiàn)上述目的。通過(guò)使用功能性L0X-1和L0X-2喪失的大麥植株，不需要使脂肪氧化酶變性。通過(guò)使用功能性MMT喪失的大麥植株，不需要降低DMS和DMS潛能的水平，這是由于所述水平在該大麥植株中極低。因此，可干燥大麥谷粒并且甚至可在低溫下終止萌芽。因此，本發(fā)明的制麥優(yōu)選包括步驟:(a)浸泡雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥；(b)使所述大麥萌芽；和(c)干燥，優(yōu)選烘干所述大麥?？赏ㄟ^(guò)技術(shù)人員已知的任何常規(guī)方法進(jìn)行浸泡。一個(gè)非限制性實(shí)例包括在交替的干燥和潤(rùn)濕條件下于10到25° C溫度范圍內(nèi)浸泡。在浸泡過(guò)程中，例如，大麥可潤(rùn)濕溫育30分鐘到3小時(shí)，隨后干燥溫育30分鐘到3小時(shí)，并任選重復(fù)所述溫育方案2到5次。浸泡后的最終水含量可以為，例如在40%到50%范圍內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何常規(guī)方法進(jìn)行萌芽。一個(gè)非限制性實(shí)例包括在10° C到25° C的溫度下萌芽，任選以變化的溫度萌芽I到4小時(shí)。在下文實(shí)施例9中概述了合適的浸泡和萌芽方案的非限制性實(shí)例?？稍诔Ｒ?guī)溫度，如至少75° C，例如80° C到90° C范圍內(nèi)，如80° C到85° C范圍內(nèi)進(jìn)行烘干。因此，可以通過(guò)例如Briggs等人(1981)和Hough等人(1982)描述的任何方法產(chǎn)生麥芽。然而，本發(fā)明還可以使用產(chǎn)生麥芽的任何其它合適的方法，例如用于產(chǎn)生特色麥芽的方法，包括但不限于焙燒(roasting)麥芽的方法。在實(shí)施例6、8和9中描述了非限制性實(shí)例。然而，優(yōu)選地，所述烘干的進(jìn)行在低溫，更優(yōu)選在低于80° C的溫度下，還更優(yōu)選在低于75° C的溫度下，如在低于70° C的溫度下，例如在低于65° C的溫度下，如在低于60° C的溫度下，例如在低于55° C的溫度下，如在低于50° C的溫度下，例如在低于45° C的溫度下，如在低于41° C的溫度下。因此，優(yōu)選所述溫度在烘干過(guò)程中任何時(shí)間里均不升高超過(guò)80° C，優(yōu)選不升高超過(guò)75° C。為了充分干燥萌芽的大麥粒，如果在低溫下進(jìn)行烘干，則可增加所述干燥時(shí)間。優(yōu)選地，烘干進(jìn)行的時(shí)間足以將萌芽麥粒的水含量減少至低于10%，優(yōu)選低于8%，更優(yōu)選低于6%。因此，在85° C的常規(guī)烘干溫度下，烘干時(shí)間可以在I到3小時(shí)范圍內(nèi)，而70° C到80° C范圍內(nèi)的溫度下烘干可能需要I到10小時(shí)的烘干時(shí)間；50° C到70° C范圍內(nèi)溫度下烘干可能需要3到50小時(shí)的烘干時(shí)間，而低于50° C溫度上，例如40° C到50° C范圍內(nèi)的烘干可能需要超過(guò)40小時(shí)的烘干時(shí)間，如40到60小時(shí)，例如45到52小時(shí)，如48小時(shí)的烘干時(shí)間。一方面，本發(fā)明還涉及通過(guò)制麥，優(yōu)選通過(guò)上文明確描述的制麥由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥粒制備的麥芽組合物。即使在上文描述的低烘干溫度下制備時(shí)，所述麥芽組合物也包含低水平的T2N和T2N潛能。特別地，所述麥芽組合物包含低水平的T2N潛能(和T2N前體)。已經(jīng)有描述稱，通過(guò)浸泡工序(其中可以對(duì)大麥進(jìn)行高溫和/或乳酸處理)可降低大麥粒中的LOX活性。然而，此類浸泡工序也是耗能的。此外，這種處理可具有其它的不利作用，例如降低所需的酶活性，例如植酸酶活性。此外，這種處理僅從進(jìn)行熱處理的時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始降低LOX活性，因此不影響來(lái)自LOX活性的產(chǎn)物在此前的積累。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用不在至少70°C的溫度浸泡大麥粒的方法制備植物產(chǎn)品。還優(yōu)選使用不在至少57°C的溫度下在乳酸存在的情況下浸泡大麥粒的方法制備本發(fā)明的植物產(chǎn)品。與以相同方式由野生型大麥(優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina)制備的麥芽組合物相比，優(yōu)選所述麥芽組合物包含少于60%，優(yōu)選少于50%，更優(yōu)選少于40%，甚至更優(yōu)選少于30%，例如少于20%的T2N。與以相同方式由野生型大麥(優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina)制備的麥芽組合物相比，進(jìn)一步優(yōu)選所述麥芽組合物甚至當(dāng)在70° C到80° C范圍內(nèi)的溫度下烘干時(shí)還包含少于60%，優(yōu)選少于50%，更優(yōu)選少于40%，甚至更優(yōu)選少于30%，更優(yōu)選少于20% 的 T2N。

與以相同方式由野生型大麥(優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina)制備的麥芽組合物相比，進(jìn)一步優(yōu)選所述麥芽組合物甚至當(dāng)在50° C到70° C范圍內(nèi)的溫度下烘干時(shí)還包含少于60%，優(yōu)選少于50%，更優(yōu)選少于40%，甚至更優(yōu)選少于30%，更優(yōu)選少于20% 的 T2N。與以相同方式由野生型大麥(優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina)制備的麥芽組合物相比，進(jìn)一步優(yōu)選所述麥芽組合物甚至當(dāng)在40° C到50° C范圍內(nèi)的溫度下烘干時(shí)還包含少于60%，優(yōu)選少于50%，更優(yōu)選少于40%，甚至更優(yōu)選少于30%，更優(yōu)選少于20% 的 T2N。除了低水平的T2N和T2N潛能，本發(fā)明的麥芽甚至當(dāng)在上述的低烘干溫度下制備時(shí)也包含低水平的DMS和DMS前體。有趣的是，DMS是沸點(diǎn)為37° C_38° C的易揮發(fā)性化合物(Imashuku，上文)，并且在麥芽制備過(guò)程，例如在烘干過(guò)程中，組合物一般進(jìn)行熱處理，以便蒸發(fā)掉大量的DMS。然而，在普通麥芽組合物的冷卻過(guò)程中，可從DMS前體(DMSP)產(chǎn)生更多的DMS。本發(fā)明的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是在麥芽組合物中沒(méi)有產(chǎn)生或僅產(chǎn)生很少的DMSP(特別是SMM)。降低麥芽中DMS濃度的方法已有描述。這些方法中的許多都依賴于高度耗能的麥芽加熱處理。所述加熱處理可簡(jiǎn)單地是例如在烘干過(guò)程中加熱麥芽，或其可包括通過(guò)使用蒸汽揮發(fā)和/或去除游離的DMS。因此，麥芽的蒸汽處理可降低麥芽中游離DMS的水平，但也是高能耗過(guò)程。此外，這些方法主要降低了麥芽中游離DMS的水平，對(duì)SMM的水平僅有很小的影響。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的麥芽組合物僅已經(jīng)進(jìn)行了包括通過(guò)蒸汽揮發(fā)并去除游離DMS的有限處理，或者還未進(jìn)行在烘干過(guò)程中使用蒸汽揮發(fā)并去除游離DMS的處理。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選不曾利用溴酸鹽，如溴酸鉀或溴酸鈣處理本發(fā)明的麥芽。本發(fā)明的麥芽組合物優(yōu)選包含最多3，優(yōu)選最多2，更優(yōu)選最多1，甚至更優(yōu)選最多0.5，如最多0.2 μ g/g的游離DMS。此外，優(yōu)選本發(fā)明的麥芽組合物包含最多2，優(yōu)選最多1，更優(yōu)選最多0.5 μ g/g,甚至更優(yōu)選最多0.2 μ g/g的DMSP。此處和本文其它地方的DMSP (優(yōu)選為SMM)的濃度表示為可從所述DMSP中釋放的DMS的濃度。進(jìn)一步優(yōu)選即使在70° C到80° C范圍內(nèi)的溫度下烘干時(shí)，所述麥芽組合物還包含最多2,優(yōu)選最多I,更優(yōu)選最多0.5 μ g/g,甚至更優(yōu)選最多0.2 μ g/g的DMSP (優(yōu)選為SMM)。進(jìn)一步優(yōu)選即使在50° C到70° C范圍內(nèi)的溫度下烘干時(shí)，所述麥芽組合物還包含最多2,優(yōu)選最多I,更優(yōu)選最多0.5 μ g/g,甚至更優(yōu)選最多0.2 μ g/g的DMSP (優(yōu)選為SMM)。進(jìn)一步優(yōu)選即使在40° C到50° C范圍內(nèi)的溫度下烘干時(shí)，所述麥芽組合物還包含最多2,優(yōu)選最多I,更優(yōu)選最多0.5 μ g/g,甚至更優(yōu)選最多0.2 μ g/g的DMSP (優(yōu)選為SMM)。本發(fā)明的另一方面涉及綠麥芽組合物，其包含最多5000，更優(yōu)選最多2500，還更優(yōu)選最多1000，甚至更優(yōu)選最多500，還更優(yōu)選最多250，例如最多150ppb DMSP。還優(yōu)選所述綠麥芽組合物包含最多200，優(yōu)選最多150，更優(yōu)選最多100，甚至更優(yōu)選最多50，如最多25ppb的游離DMS。
雖然麥芽的主要用途用于飲料生產(chǎn)，但是也可將其用在其它工業(yè)工藝中，例如以麥芽或麥芽粉的形式或間接作為麥芽糖漿等用在烘烤業(yè)中作為酶源，或者用在食品工業(yè)中作為調(diào)味劑和著色劑。因此，本發(fā)明的植物產(chǎn)品可以是任何上述產(chǎn)品。另一方面，本發(fā)明的植物產(chǎn)品包含或甚至由糖漿(例如大麥糖漿或大麥麥芽糖漿)組成。所述植物產(chǎn)品還可以是大麥或麥芽的提取物。
可以通過(guò)，例如碾磨，對(duì)麥芽進(jìn)行進(jìn)一步加工。因此，本發(fā)明的植物產(chǎn)品可以是任何種類的麥芽，例如未加工的麥芽，或者經(jīng)碾磨的麥芽，如面粉。經(jīng)碾磨的麥芽及其面粉包含麥芽的化學(xué)成分和缺乏再萌芽能力的死細(xì)胞。優(yōu)選在干燥狀態(tài)下進(jìn)行碾磨，即干燥的同時(shí)碾磨麥芽。因此，所述麥芽?jī)?yōu)選不在水中碾磨。糖化本發(fā)明的方法包括通過(guò)糖化雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥和/或麥芽和任選的額外輔料產(chǎn)生麥芽汁的步驟。所述糖化步驟還任選地包括噴射提取，因此所述糖化步驟可以是包括噴射提取步驟的糖化步驟或不包括噴射提取步驟的糖化步驟。通常，通過(guò)碾磨雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥芽和/或雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥開(kāi)始麥芽汁的生產(chǎn)。如果添加額外的輔料， 也可以根據(jù)其性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行碾磨。如果輔料是谷類，例如可以進(jìn)行碾磨，然而通常不碾磨糖漿、糖等。碾磨促進(jìn)水分在糖化階段進(jìn)入谷粒顆粒中。在糖化過(guò)程中，制麥過(guò)程中起始的底物的酶解聚可持續(xù)進(jìn)行。在圖9中，步驟4到6顯示了由麥芽制備麥芽汁的通用方法。通常，通過(guò)合并并溫育經(jīng)研磨的麥芽和水，即在糖化工藝中制備麥芽汁。在糖化過(guò)程中，可以向所述麥芽/液體組合物補(bǔ)充額外的富含碳水化合物的輔料組合物，例如經(jīng)碾磨的大麥、玉米或水稻輔料。未發(fā)芽的谷類輔料通常含有非常少或者不含活性酶，這使得補(bǔ)充麥芽或外源酶以提供多糖解聚等所必需的酶至關(guān)重要。在糖化過(guò)程中，經(jīng)碾磨的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥芽和/或經(jīng)碾磨的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥和任選額外的輔料與液體部分，例如水一起溫育。溫育溫度通常保持恒定(恒溫糖化)或者逐漸升高，例如以連續(xù)方式升高。在任何一種情況下，在麥芽/大麥/輔料中的可溶物質(zhì)均被釋放至所述液體部分中。隨后的過(guò)濾將麥芽汁和殘留的固體顆粒分離，后者還被稱為“用過(guò)的谷?！?。因此獲得的麥芽汁還可以被稱為“第一麥芽汁”?？稍谝卜Q為噴射提取的過(guò)程中向用過(guò)的谷粒中添加額外的液體，如水。在噴射提取和過(guò)濾后，可以獲得“第二麥芽汁”。通過(guò)重復(fù)所述過(guò)程可以制備進(jìn)一步的麥芽汁。Briggs等人(上文)和Hough等人(上文)描述了制備麥芽汁的合適方法的非限制性實(shí)例。已有描述通過(guò)酶的熱處理可以降低LOX活性并且可以通過(guò)熱處理降低DMS水平。同樣，已有描述可以熱處理麥芽汁以降低LOX活性并降低DMS水平和/或在高溫下進(jìn)行糖化以實(shí)現(xiàn)相同的目的。然而，熱處理具有其它不利影響，例如降低其它酶活性并且熱處理也是耗能的。此外，熱處理僅從進(jìn)行熱處理的時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始降低脂肪氧化酶活性和DMS水平，因此不影響LOX活性衍生產(chǎn)物和DMS前體在此前的積累。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，利用以下方法制備麥芽汁，其中初始糖化溫度不超過(guò)70°C，優(yōu)選不超過(guò)69°C，因此，例如初始糖化溫度可以在30° C到69° C的范圍內(nèi)，如在35° C到69° C的范圍內(nèi)，例如在35° C到65° C的范圍內(nèi)，如在35° C到55° C的范圍內(nèi)，例如在35° C到45° C的范圍內(nèi)，如大約40° C。還優(yōu)選在糖化過(guò)程中，本發(fā)明的麥芽汁沒(méi)有在70°C或更高溫度下持續(xù)大于25分鐘，優(yōu)選不大于20分鐘，并且所述麥芽汁沒(méi)有在78°C或更高溫度下持續(xù)大于20分鐘，優(yōu)選不大于15分鐘，更優(yōu)選不大于10分鐘。如果糖化溫度過(guò)高，該性質(zhì)將影響醪液中的酶活性并可以降低，乃至消除所需酶活性，這將導(dǎo)致麥芽汁品質(zhì)改變。還優(yōu)選在糖化過(guò)程中，本發(fā)明的麥芽汁沒(méi)有在65° C或更高溫度下持續(xù)大于100分鐘，優(yōu)選不大于90分鐘，更優(yōu)選不超過(guò)80分鐘，還更優(yōu)選不超過(guò)70分鐘。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，糖化過(guò)程中的溫度不超過(guò)80 ° C，優(yōu)選不超過(guò)78。Co合適的糖化的一個(gè)非限制性實(shí)例是:(I)在35-45 ° C的溫度范圍內(nèi)，如大約40 ° C的溫度下初始糖化(marshing-1n) 10到30分鐘，如大約20分鐘；(2)在30到90分鐘范圍，優(yōu)選在45到75分鐘范圍，如大約60分鐘內(nèi)，加熱至60° C到70° C范圍，優(yōu)選60° C到65° C范圍，如大約65° C的溫度；(3)在5到15分鐘范圍，如大約10分鐘內(nèi)，加熱至70° C到80° C范圍，優(yōu)選在75° C到78° C范圍，如大約78° C的溫度。合適的糖化的另一非限制性實(shí)例是:(4)在55-65° C范圍內(nèi)，如大約60° C的溫度下初始糖化10到30分鐘，如大約20分鐘；(5)在30到90分鐘范圍，優(yōu)選在45到75分鐘范圍，如大約60分鐘內(nèi)，加熱至60° C到70° C范圍，優(yōu)選60° C到65° C范圍，如大約65° C的溫度；(6)在5到15分鐘范圍，如大約10分鐘內(nèi)，加熱至70° C到80° C范圍，優(yōu)選在75° C到78° C范圍，如大約78° C的溫度。如上提及，可通過(guò)糖化雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株或其部分，如未發(fā)芽的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥粒，特別是經(jīng)碾磨`的未發(fā)芽的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥?；蚱洳糠种苽潲溠恐M合物。未發(fā)芽的大麥粒缺少或僅含有有限量的益于麥芽汁生產(chǎn)的酶，如能夠降解細(xì)胞壁的酶或?qū)⒌矸劢饩鄢商堑拿?。因此，在使用未發(fā)芽的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT糖化的本發(fā)明的實(shí)施方案中，優(yōu)選向醪液中加入一種或多種合適的外加釀造酶。合適的酶可以是脂肪酶、淀粉降解酶(例如淀粉酶)、葡聚糖酶[優(yōu)選(1-4)-和/或(1-3，1-4)-β-葡聚糖酶]，和/或木聚糖酶(如阿拉伯木聚糖酶)，和/或蛋白酶，或包含一種或多種上述酶的酶混合物，例如Cereflo、Ultraflo或Ondea Pro (Novozymes)。用于從未發(fā)芽的大麥制備的麥芽汁生產(chǎn)飲料的方法也可稱為“大麥釀造”，并且其麥芽汁組合物稱為“大麥麥芽汁”或“大麥釀造的”麥芽汁。也可以通過(guò)使用發(fā)芽的和未發(fā)芽的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株或其部分的混合物制備麥芽汁組合物，在所述情況下制備過(guò)程中可加入一種或多種合適的酶。更具體而言，本發(fā)明的大麥可與麥芽以任何組合一起用于糖化(有或沒(méi)有外加釀造酶)，如，但不限于大麥:麥芽的比例=大約100:0，或大約75:25，或大約50:50，或大約25:75。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，優(yōu)選在糖化之前或糖化過(guò)程中不加入外加酶，特別是外加蛋白酶，和/或外加纖維素酶和/或外加α-淀粉酶和/或外加β_淀粉酶和/或外加產(chǎn)麥芽α-淀粉酶。糖化后獲得的麥芽汁也稱為“甜麥芽汁”。在常規(guī)方法中，在有酒花或沒(méi)有酒花的情況下煮沸甜麥芽汁，煮沸之后將其稱為煮沸的麥芽汁。本文所用的術(shù)語(yǔ)“大約”表示土 10%，優(yōu)選土 5%，還更優(yōu)選土 2%。加熱麥芽汁用于制備本發(fā)明基于大麥的飲料的方法包括經(jīng)在“糖化”部分中的上述糖化步驟后獲得的麥芽汁的加熱步驟。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于在不需要廣泛加熱麥芽汁的情況下可以制備具有低水平異味物及其前體，特別是T2N和DMS及其前體的基于大麥的飲料。在常規(guī)釀造中，通常將麥芽汁長(zhǎng)時(shí)間煮沸。麥芽汁煮沸有幾個(gè)目的，具體是:(i)酶失活；(ii)蛋白質(zhì)凝聚；(iii)麥芽汁滅菌；(iv)酒花化合物的提取；(V) α-酸的異構(gòu)化；(vi)DMSP轉(zhuǎn)化成DMS ;和(vii)DMS和T2N的蒸發(fā)?？稍诓贿M(jìn)行廣泛煮沸的情況下實(shí)現(xiàn)這些目的中的幾個(gè)。因此，滅菌僅需要短暫的煮沸或加熱。提取酒花化合物也可以在短暫的煮沸或加熱過(guò)程中完成。預(yù)異構(gòu)化的α-酸可通過(guò)商業(yè)途徑獲得，并可加入到麥芽汁中。通過(guò)使用功能性L0X-1和L0X-2喪失的大麥植株，不需要使LOX變性。此外，通過(guò)使用功能性L0X-1和LOX-喪失的大麥植株也可以消除降低Τ2Ν水平的需要。通過(guò)使用功能性MMT喪失的大麥植株，不需要降低DMS和DMS潛能的水平，因?yàn)樗鏊皆诖祟惔篼溨仓曛芯菢O低的。此外，可干燥大麥谷粒并且可以甚至在低溫下終止萌芽。已經(jīng)嘗試通過(guò)多種手段，例如通過(guò)減少蒸發(fā)少至3%與將無(wú)用的揮發(fā)性化合物蒸餾入蒸汽的提餾方法組合，減少麥芽汁煮沸過(guò)程中的能量消耗。然而，產(chǎn)生蒸汽也是耗能過(guò)程。也已經(jīng)嘗試了在不進(jìn)行典型的麥芽汁煮沸的情況下制備麥芽汁。然而，這些方法通常在糖化和利用蒸汽提餾麥芽汁的過(guò)程中使用高達(dá)95° C的高溫，因此被認(rèn)為是高耗能過(guò)程。本發(fā)明方法提供了優(yōu)選甚至在缺少提餾過(guò)程的情況下減少蒸發(fā)的可能性。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，加熱麥芽汁的方式使得優(yōu)選最多4%，還優(yōu)選最多3%，甚至更優(yōu)選最多2%，甚至更優(yōu)選最多1 .5%，還更優(yōu)選最多1%，甚至更優(yōu)選最多0.5%，甚至更優(yōu)選最多0.1%，如最多0.01%的麥芽汁體積被蒸發(fā)。甚至更優(yōu)選在缺少蒸汽處理麥芽汁的情況下進(jìn)行上述少量蒸發(fā)。還優(yōu)選在例如不利用蒸汽提餾麥芽汁的情況下進(jìn)行上述少量蒸發(fā)。所述少量蒸發(fā)可在基本上密閉的容器或優(yōu)選在密閉的容器中通過(guò)加熱麥芽汁而實(shí)現(xiàn)。還優(yōu)選在所述方法的任何其它步驟中不進(jìn)行液體的廣泛蒸發(fā)。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及用于制備具有低水平的一種或多種異味物及其前體(優(yōu)選Τ2Ν和DMS及其前體)的基于大麥的飲料的方法，其中所述方法包括低能量輸入，并且包括以下步驟:(i)提供大麥植株或其部分，其中所述大麥植株包含:(a)導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變；和(b)導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變；和(c)導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變；(ii)任選地對(duì)所述大麥的至少部分進(jìn)行制麥，由此獲得發(fā)芽的大麥；(iii)糖化所述大麥和/或發(fā)芽的大麥和任選的額外輔料，由此獲得麥芽汁；(iv)任選地在存在額外成分下加熱所述麥芽汁；(V)將所述加熱的麥芽汁加工成飲料；其中在方法過(guò)程中完成步驟(ii)后，或甚至在完成上述步驟(iv)后蒸發(fā)掉最多4%，例如最多3%，如最多2%，例如最多1.5%，如最多1%的液體體積，由此制得具有低水平的一種或多種異味物及其前體的來(lái)自大麥的飲料。優(yōu)選在基本上密閉的容器，如在密閉容器中利用麥芽汁進(jìn)行上文的步驟(iv)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于制備具有低水平的一種或多種異味物及其前體(優(yōu)選T2N和DMS及其前體)的基于大麥的飲料的方法，其中所述方法包括低能量輸入，且包括以下步驟:(i)提供大麥植株或其部分，其中所述大麥植株包含:(a)導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變；和(b)導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變；和

(c)導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變；(ii)任選地對(duì)所述大麥的至少部分進(jìn)行制麥，由此獲得發(fā)芽的大麥；(iii)糖化所述大麥和/或發(fā)芽的大麥和任選的額外輔料，由此獲得麥芽汁；(iv)任選地在存在額外成分下加熱所述麥芽汁；(V)將所述加熱的麥芽汁加工成飲料；其中將所述液體/麥芽汁/飲料加熱至高于80° C的溫度持續(xù)最多30分鐘，更優(yōu)選最多20分鐘，由此制備具有低水平的一種或多種異味物及其前體的來(lái)自大麥的飲料。優(yōu)選地，在所述方法中將所述液體/麥芽汁/飲料加熱至80° C到99.8° C范圍內(nèi)的溫度，優(yōu)選80° C到99.5° C范圍內(nèi)的溫度，如80° C到99° C的溫度，還更優(yōu)選90° C到99 ° C范圍內(nèi)的溫度，持續(xù)最多30分鐘，優(yōu)選最多20分鐘，如10到30分鐘，例如10到20分鐘。可以將第一麥芽汁、第二麥芽汁和進(jìn)一步的麥芽汁合并，隨后將其進(jìn)行加熱或者可以加熱每一種麥芽汁。根據(jù)本發(fā)明的方法，麥芽汁不需要必須煮沸。未煮沸的麥芽汁，無(wú)論是純的第一麥芽汁還是合并的麥芽汁，都還被稱為“甜麥芽汁”;而煮沸之后，可將其稱為“煮沸的麥芽汁”。如果麥芽汁待用于生產(chǎn)啤酒，則通常在煮沸前加入酒花。在常規(guī)釀造方法中，將麥芽汁長(zhǎng)時(shí)間煮沸，通常在60分鐘到120分鐘范圍內(nèi)，以蒸發(fā)掉至少5%，有時(shí)候甚至高達(dá)25%的麥芽汁體積。然而，因?yàn)樵S多其它原因，例如因?yàn)檠娱L(zhǎng)煮沸需要大量能量供應(yīng)，因此不希望延長(zhǎng)煮沸。根據(jù)本發(fā)明，甚至在不延長(zhǎng)煮沸的情況下也可以從雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥生產(chǎn)具有低水平T2N、T2N潛能、DMS和DMSP的麥芽汁。因此，將本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的麥芽汁煮沸最多30分鐘，更優(yōu)選最多15分鐘，甚至更優(yōu)選最多10分鐘，還更優(yōu)選最多5分鐘，甚至更優(yōu)選最多I分鐘，還更優(yōu)選根本不煮沸麥芽汁。還優(yōu)選在完成本發(fā)明方法的步驟ii)后將所述液體/麥芽汁/飲料煮沸最多30分鐘，更優(yōu)選最多15分鐘，甚至更優(yōu)選最多10分鐘，還更優(yōu)選最多5分鐘，甚至更優(yōu)選最多I分鐘，還更優(yōu)選根本不煮沸所述液體/麥芽汁/飲料。優(yōu)選地，在基本上密閉的容器中，優(yōu)選在密閉容器中進(jìn)行麥芽汁的加熱。在本文中，術(shù)語(yǔ)“煮沸”表示使液體或麥芽汁或飲料達(dá)到蒸發(fā)水分的溫度。因此，在常壓下，煮沸表示使水性液體，如麥芽汁達(dá)到100° C或稍微高于100° C。因此還優(yōu)選本發(fā)明實(shí)施方案的麥芽汁在至少100° C的溫度下保持最多30分鐘，更優(yōu)選最多15分鐘，甚至更優(yōu)選最多10分鐘，還更優(yōu)選最多5分鐘，甚至更優(yōu)選最多I分鐘，還更優(yōu)選根本不將所述麥芽汁加熱至至少100° C的溫度。此外，優(yōu)選在完成本發(fā)明方法的步驟(ii)后將所述液體/麥芽汁/飲料在至少100° C的溫度下保持最多30分鐘，更優(yōu)選最多15分鐘，甚至更優(yōu)選最多10分鐘，還更優(yōu)選最多5分鐘，甚至更優(yōu)選最多I分鐘，還更優(yōu)選根本不將所述液體/麥芽汁/飲料加熱至至少100° C的溫度。還優(yōu)選制備本發(fā)明基于大麥的飲料的整個(gè)方法在任何時(shí)候都不涉及加熱至高于99.8° C，優(yōu)選99.5° C，還更優(yōu)選99° C的溫度。然而，所述方法可包括將麥芽汁加熱至最多99.8° C，如最多99.5° C，例如最多99° C，如最多98° C的溫度持續(xù)有限量的時(shí)間的步驟。所述有限量的時(shí)間優(yōu)選為最多30分鐘，更優(yōu)選最多15分鐘，甚至更優(yōu)選最多10分鐘。因此，優(yōu)選將麥芽汁加熱至高于80° C，優(yōu)選80° C到99.8° C的范圍，如80° C到99.5° C的范圍，例如80° C到99° C的范圍，還更優(yōu)選90° C到99° C范圍內(nèi)的溫度，還更優(yōu)選95° C到99° C范圍內(nèi)的溫度持續(xù)最多30分鐘，優(yōu)選最多20分鐘，如10到30分鐘范圍，例如10到20分鐘范圍內(nèi)。在本發(fā)明額外的實(shí)施方案中，優(yōu)選在發(fā)酵前不將麥芽汁進(jìn)行(例如用CO2沖洗)隨后的麥芽汁煮沸過(guò)程。麥芽汁另一方面，本發(fā)明涉及的植物產(chǎn)品類型是麥芽汁組合物。所述麥芽汁組合物優(yōu)選由來(lái)自雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥粒的麥芽組合物制備。所述麥芽汁可僅由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥粒，或還包含其它麥粒的混合物制備。本發(fā)明還涉及單獨(dú)使用雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥，或其部分，如綠麥芽或與其它組分混合制備的麥芽汁組合物。本發(fā)明的麥芽汁組合物優(yōu)選通過(guò)上文“糖化”部分中描述的糖化制備。此外，已經(jīng)按上文“加熱麥 芽汁”部分中描述加熱了所述麥芽汁組合物。優(yōu)選的是,與以相同方式由野生型大麥,優(yōu)選cv.Power或cv.Rosalina制備的麥芽汁組合物相比，所述麥芽汁組合物優(yōu)選包含少于60%，更優(yōu)選少于50%，甚至更優(yōu)選少于40%的T2N潛能。所述麥芽汁可以為第一麥芽汁和/或第二麥芽汁和/或進(jìn)一步的麥芽汁和/或其混合物。所述麥芽汁組合物可以為甜麥芽汁、加熱的麥芽汁或其混合物。加熱的麥芽汁優(yōu)選按上文“加熱麥芽汁”步驟中所述進(jìn)行加熱。所述麥芽汁組合物還可以是大麥麥芽汁。通常，麥芽汁組合物包含高含量的氨基氮和可發(fā)酵的碳水化合物，后者主要是麥芽糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，麥芽汁可以是甜麥芽汁，即沒(méi)有進(jìn)行熱處理的麥芽汁。與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Rosalina制備的麥芽汁組合物相比,所述甜麥芽汁優(yōu)選包含少于60%，更優(yōu)選少于50%的T2N潛能。如果已經(jīng)由在低溫下進(jìn)行了烘干的麥芽制備了該麥芽汁，所述麥芽汁甚至可包含更少的T2N潛能。因此，在已經(jīng)由麥芽(其已經(jīng)在50° C到70° C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行了烘干)制備了所述甜麥芽汁的本發(fā)明實(shí)施方案中，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power制備的麥芽汁組合物相比,該甜麥芽汁可優(yōu)選包含少于50%，甚至更優(yōu)選少于45%，如少于40%的T2N潛能。在已經(jīng)由麥芽(其已經(jīng)在40° C到50° C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行了烘干)制備了所述甜麥芽汁的本發(fā)明實(shí)施方案中，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Quench或cv.Rosalina制備的麥芽汁組合物相比，所述甜麥芽汁可優(yōu)選包含少于50%，甚至更優(yōu)選少于40%，還更優(yōu)選少于30%的T2N潛倉(cāng)泛。所述甜麥芽汁優(yōu)選地還包含低水平DMSP，優(yōu)選低于150yg/L，更優(yōu)選低于100 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L,還更優(yōu)選低于15 μ g/L的DMSP(優(yōu)選SMM)。即使如果已經(jīng)由在低溫下進(jìn)行了烘干的麥芽制備了所述麥芽汁，其仍然包含低水平的DMSP。因此，在已經(jīng)由麥芽(其已經(jīng)在50° C到70° C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行了烘干)制備了所述甜麥芽汁的本發(fā)明實(shí)施方案中，所述甜麥芽汁可優(yōu)選包含低于150 μ g/L,更優(yōu)選低于100 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于30 μ g/L，甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L，還更優(yōu)選低于15 μ g/L的DMSP。在已經(jīng)由麥芽(其已經(jīng)在40° C到50° C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行了烘干)制備了所述甜麥芽汁的本發(fā)明實(shí)施方案中，所述甜麥芽汁可優(yōu)選包含低于150 μ g/L,更優(yōu)選低于100 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于 30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L,還更優(yōu)選低于15 μ g/L的DMSP。優(yōu)選地，所述甜麥芽汁還包含低水平的DMS，優(yōu)選低于90 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L的DMS。麥芽汁可以是這樣的麥芽汁，其僅已經(jīng)進(jìn)行了短時(shí)間的熱處理，如在95° C到99.8° C范圍或95° C到99° C范圍內(nèi)的溫度下熱處理10到30分鐘。在該情況下，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Rosalina制備的麥芽汁組合物相比,所述麥芽汁優(yōu)選包含最多60%，更優(yōu)選最多50%，甚至更優(yōu)選最多45%，更優(yōu)選地最多40%的T2N潛能。所述麥芽汁還優(yōu)選包含最多150 μ g/L,更優(yōu)選低于100 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L，還更優(yōu)選低于30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L,還更優(yōu)選低于15 μ g/L的DMSP。所述麥芽汁還優(yōu)選包含最多150 μ g/L,更優(yōu)選低于100 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L的DMS。麥芽汁也可以是加熱的麥芽汁(優(yōu)選按上文“加熱麥芽汁”部分中所述進(jìn)行加熱)，在所述情況下與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power制備的麥芽汁組合物相比，所述麥芽汁優(yōu)選包含最多60%，更優(yōu)選最多50%，還更優(yōu)選最多40%的T2N潛能。所述加熱的麥芽汁優(yōu)選地還包含低水平的DMSP，優(yōu)選低于150 μ g/L,更優(yōu)選低于100 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L,還更優(yōu)選低于15 μ g/L的DMSP。在已經(jīng)由麥芽(其已經(jīng)在50° C到70° C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行了烘干)制備了所述冷卻的麥芽汁的本發(fā)明實(shí)施方案中，所述甜麥芽汁可優(yōu)選包含低于150 μ g/L,更優(yōu)選低于100 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L，還更優(yōu)選低于15 μ g/L的DMSP。甚至在已經(jīng)由麥芽(其已經(jīng)在40° C到50° C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行了烘干)制備了所述冷卻的麥芽汁的本發(fā)明實(shí)施方案中，所述甜麥芽汁可優(yōu)選包含低于150 μ g/L,更優(yōu)選低于100 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L,還更優(yōu)選低于15 μ g/L的DMSP。所述加熱的麥芽汁優(yōu)選地還包含低水平的DMS，優(yōu)選低于30 μ g/L,更優(yōu)選低于20 μ g/L的DMSP。麥芽汁也可以是加熱的麥芽汁(優(yōu)選按上文“加熱麥芽汁”部分中所述進(jìn)行加熱)，其隨后已經(jīng)進(jìn)行了冷卻(本文還稱為冷卻的麥芽汁)，在所述情況下與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Rosalina制備的麥芽汁組合物相比,所述麥芽汁優(yōu)選包含最多60%，更優(yōu)選最多50%，還更優(yōu)選最多40%的T2N潛能。在已經(jīng)由麥芽(其已經(jīng)在40° C到50° C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行了烘干)制備了所述冷卻的麥芽汁的本發(fā)明實(shí)施方案中，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Rosalina制備的麥芽汁組合物相比，所述甜麥芽汁可優(yōu)選包含少于50%，更優(yōu)選少于40%，還更優(yōu)選少于30%的T2N潛能。所述冷卻的麥芽汁優(yōu)選地還包含低水平的DMSP，優(yōu)選低于90 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L,還更優(yōu)選低于15 μ g/L的DMSP。所述冷卻的麥芽汁優(yōu)選地還包含低水平的DMS，優(yōu)選低于90 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于50 μ g/L,還更優(yōu)選低于30 μ g/L,甚至更優(yōu)選低于20 μ g/L的DMS。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的麥芽汁組合物是大麥麥芽汁，如加熱的大麥麥芽汁，即通過(guò)未發(fā)芽的(并優(yōu)選經(jīng)碾磨的)雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥粒與水溫育，優(yōu)選通過(guò)糖化和噴射提取來(lái)制備的麥芽汁。該大麥麥芽汁的特征在于具有極其低水平的T2N和T2N潛能。與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power制備的大麥麥芽汁組合物相比，優(yōu)選所述大麥麥芽汁包含少于50%，更優(yōu)選少于40%，還更優(yōu)選少于30%的T2N潛能。還優(yōu)選的是，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或Quench或cv.Rosalina制備的大麥麥芽汁組合物相比，所述大麥麥芽汁優(yōu)選包含少于50%，更優(yōu)選少于40%，還更優(yōu)選少于30%的T2N前體。飲料在優(yōu)選方面,本發(fā)明涉及飲料,更優(yōu)選由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥制備的基于大麥的飲料。所述飲料在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中可以是麥芽飲料，甚至更優(yōu)選為發(fā)酵的飲料，如發(fā)酵的麥芽飲料，優(yōu)選醇飲料，如啤酒，其中所述飲料是使用雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥或其部分制備的。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選通過(guò)單獨(dú)或與其它成分組合發(fā)酵雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥或其部分或其提取物，例如通過(guò)發(fā)酵來(lái)自雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥芽的麥芽汁，來(lái)制備所述飲料。在本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施方案中，通過(guò)包括以下步驟的方法制備上述飲料:(i)提供大麥植株或其部分，其中所述大麥植株包含:(a)導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變；和(b)導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變；和(c)導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變；(ii)任選地對(duì)所述大麥的至少部分進(jìn)行制麥，由此獲得發(fā)芽的大麥；(iii)糖化所述大麥和/或發(fā)芽的大麥和任選地額外輔料，由此獲得麥芽汁；(iv)任選地在存在額外成分時(shí)加熱所述麥芽汁，其中蒸發(fā)掉最多4%的麥芽汁體積，由此獲得加熱的麥芽汁；(V)將所述加熱的麥芽汁加工成飲料。然而，在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥制備的任何基于大麥的飲料。因此，本發(fā)明還涉及使用常規(guī)方法，如常規(guī)釀造方法由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥制備的基于大麥的飲料。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述飲料是非發(fā)酵的飲料，例如麥芽汁，優(yōu)選由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥芽制備的麥芽汁。還包含在本發(fā)明內(nèi)的是可通過(guò)例如大麥釀造由未發(fā)芽的大麥植物，優(yōu)選未發(fā)芽的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株，或其部分，制備所述飲料。所述飲料可以是無(wú)醇飲料，如無(wú)醇啤酒或其它種類的無(wú)醇飲料，如無(wú)醇麥芽飲料，例如無(wú)酒精麥芽飲料(maltina)。
然而，優(yōu)選所述飲料由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥粒制備的麥芽組合物制備。更優(yōu)選地，所述飲料是啤酒。這可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何種類的啤酒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述啤酒是，例如貯藏啤酒。優(yōu)選使用包含萌芽的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥的麥芽組合物釀造啤酒，更優(yōu)選所述啤酒是利用僅由萌芽的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥制備的麥芽組合物釀造的。然而，所述麥芽組合物還可以包含其它成分，例如其它萌芽或未萌芽的谷類，例如野生型大麥、雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥、小麥和/或黑麥，或者包含糖的未萌芽原材料或源自發(fā)芽或未發(fā)芽原材料的組合物，包括糖漿組合物。然而，優(yōu)選地，用于制備所述啤酒的所有大麥，如所有發(fā)芽和/或未發(fā)芽的大麥和/或萌芽和/或未萌芽大麥優(yōu)選是雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥。因此，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)飲料的方法，所述方法包括以下步驟:(i)提供包含萌芽的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥粒的麥芽組合物；(ii)將所述麥芽組合物加工成飲料；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的飲料是從由烘干的麥芽(優(yōu)選按上文“發(fā)芽”部分中所述進(jìn)行制備)，更優(yōu)選通過(guò)糖化所述烘干的麥芽(優(yōu)選按上文“糖化”部分中所述)而制備的麥芽汁生產(chǎn)的啤酒，其中所述糖化也可任選地包括噴射提取步驟。此外，盡管在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，以常規(guī)方式通過(guò)煮沸加熱所述麥芽汁，但優(yōu)選按上文“加熱麥芽汁”部分中所述，已經(jīng)優(yōu)選加熱了所述麥芽汁。由此產(chǎn)生的啤酒在本文中也稱為“發(fā)芽的”。然而，本發(fā)明的飲料也可以是由大麥麥芽汁制備的啤酒。這種啤酒也稱為“大麥啤酒”?！銇?lái)說(shuō)，可以從發(fā)芽和/或未發(fā)芽的大麥谷粒制造醇飲料，例如啤酒。除了酒花和酵母外，麥芽也促成了啤酒的風(fēng)味和顏色。此外，麥芽還充當(dāng)了可發(fā)酵糖和酶的來(lái)源。啤酒生產(chǎn)的一般工藝的示意圖示于圖9，而適合發(fā)芽和釀酒的方法的實(shí)例的詳細(xì)描述可見(jiàn)于，例如Briggs等人(1981)和Hough等人(1982)的文獻(xiàn)。可獲得多種用于分析大麥、麥芽和啤酒產(chǎn)物的定時(shí)更新的方法,所述方法包括，例如但不限于American Associationof Cereal Chemists (199 5)、American Society of Brewing Chemists(1992)、EuropeanBrewery Convention (1998)和 Institute of Brewing(1997)。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到特定的釀酒廠使用了許多帶有顯著差異的具體工序，這些差異與當(dāng)?shù)叵M(fèi)者的喜好有關(guān)。本發(fā)明可以使用任何此類制造啤酒的方法。由麥芽汁生產(chǎn)啤酒的第一步優(yōu)選包括如上所述加熱所述麥芽汁，隨后是麥芽汁冷卻和任選地渦旋靜止(rest)的后續(xù)階段。冷卻后，麥芽汁被轉(zhuǎn)移到含酵母的發(fā)酵罐中。優(yōu)選地，所述酵母是釀酒酵母卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)?？梢詫Ⅺ溠恐l(fā)酵任何適當(dāng)時(shí)間，通常在1-100天的范圍。在持續(xù)數(shù)天的發(fā)酵過(guò)程中，糖被轉(zhuǎn)化成醇和C02，同時(shí)伴隨產(chǎn)生一些風(fēng)味物質(zhì)。隨后可以對(duì)啤酒進(jìn)行進(jìn)一步加工，例如冷藏啤酒。也可以過(guò)濾和/或儲(chǔ)藏啤酒，儲(chǔ)藏是產(chǎn)生令人愉快的芳香以及較少酵母(yeasty)味的過(guò)程。也可以加入添加劑。此夕卜，還可以加入C02。最后可以在封裝(例如裝瓶或裝罐)前，對(duì)啤酒進(jìn)行巴氏滅菌和/或過(guò)濾。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料的T2N潛能相比，本發(fā)明的飲料包含少于70%，優(yōu)選少于60%，更優(yōu)選少于50%的T2N潛能。還優(yōu)選，如果飲料所基于的原始提取物的。P被調(diào)整至10° P到12° P的范圍，更優(yōu)選11° P，那么本發(fā)明的飲料包含最多2ppb，更優(yōu)選最多1.5ppb的T2N潛能。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與以相同方式由野生型大麥,優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料的T2N前體相比，本發(fā)明的飲料包含少于70%，優(yōu)選少于60%，更優(yōu)選少于50%的T2N前體。還優(yōu)選，如果飲料所基于的原始提取物的。P被調(diào)整至10° P到12° P的范圍，更優(yōu)選11° P，那么本發(fā)明的飲料包含最多2ppb,更優(yōu)選最多1.5ppb的T2N前體。所述飲料,優(yōu)選啤酒，也優(yōu)選包含最多60ppb,更優(yōu)選低于50ppb,甚至更優(yōu)選低于40ppb,還更優(yōu)選低于30ppb,甚至更優(yōu)選低于20ppb,還更優(yōu)選低于IOppb的DMS。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，飲料是大麥啤酒，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Quench制備的大麥啤酒的T2N潛能相比,其包含少于60%,優(yōu)選少于50%的T2N潛能。在本發(fā)明的另一具體的實(shí)施方案中，所述飲料，優(yōu)選啤酒由加熱的麥芽汁制得，所述加熱的麥芽汁僅進(jìn)行了短時(shí)間的加熱處理，如在95° C到99.8° C范圍或95° C到99° C范圍的溫度下加熱了 10到30分鐘。優(yōu)選地，所述加熱的麥芽汁已經(jīng)按上文“加熱麥芽汁”部分中所述進(jìn)行了加熱。在由此類加熱的麥芽汁中制備飲料，優(yōu)選啤酒的本發(fā)明的實(shí)施方案中，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制備的啤酒的T2N潛能相比，所述飲料，優(yōu)選啤酒包含少于60%，優(yōu)選少于50%，更優(yōu)選少于45%的T2N潛能。在該實(shí)施方案中，還優(yōu)選與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料,優(yōu)選啤酒的T2N前體相比,所述飲料,優(yōu)選啤酒包含少于60%，優(yōu)選少于50%，更優(yōu)選少于45%的T2N前體。在該實(shí)施方案中，還優(yōu)選本發(fā)明的啤酒包含最多2ppb，更優(yōu)選最多1.5ppb的T2N潛能。在該實(shí)施方案中，如果飲料所基于的原始提取物的。P被調(diào)整至10° P到12° P的范圍，更優(yōu)選11° P，那么還優(yōu)選本發(fā)明的啤酒包含最多2ppb，更優(yōu)選最多1.5ppb的T2N前體。所述飲料，優(yōu)選啤酒還優(yōu)選包含最多60ppb,更優(yōu)選低于50ppb,甚至更優(yōu)選低于40ppb,還更優(yōu)選低于30ppb,甚至更優(yōu)選低于20ppb,還更優(yōu)選低于IOppb的DMS?！案泄倨焚|(zhì)”表示吸引人嗅覺(jué)和味覺(jué)的性質(zhì)。通過(guò)例如啤酒品嘗專家小組對(duì)這些品質(zhì)進(jìn)行分析。優(yōu)選地，所述小組在品嘗并描述啤酒風(fēng)味方面經(jīng)過(guò)了訓(xùn)練，尤其特別關(guān)注醛、紙樣味道、陳化味道、酯、高級(jí)醇、脂肪酸和硫(sulphury)成分。通常，所述品嘗小組由3到30位成員組成，例如5到15位，優(yōu)選8到12位成員組成。所述品嘗小組可以評(píng)價(jià)各種風(fēng)味的存在，例如紙樣、氧化、陳化和面包樣(bready)異味以及酯、高級(jí)醇、硫成分和啤酒體的風(fēng)味。與本發(fā)明有關(guān)，優(yōu)選特別降低了紙樣和/或陳化異味，然而與使用相同方法由野生型大麥制備的飲料相比，芳香的、酯的、醇/溶劑、花香的和/或酒花的風(fēng)味優(yōu)選增加。測(cè)定飲料的“感官品質(zhì)”的方法描述于國(guó)際專利申請(qǐng)WO2005/087934的實(shí)施例6中。測(cè)定飲料的“感官品質(zhì)”的另一個(gè)方法描述于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例8和9中。在下文實(shí)施例9中描述了又一實(shí)例。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，穩(wěn)定的感官品質(zhì)至少部分是低水平的T2N或T2N潛能的結(jié)果。優(yōu)選按國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例7中所述測(cè) 定芳香的、酯的、醇/溶劑、花香的和/或酒花的味道。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的飲料已按國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315在第41頁(yè)第15行，到第44頁(yè)第9行中所述評(píng)價(jià)了芳香的、酯的、醇/溶劑、花香的和/或酒花的味道。優(yōu)選地，本發(fā)明的飲料的特征在于，與以相同方式由野生型大麥植株(優(yōu)選cv.Quench或cv.Rosalina)制備的類似飲料相比,在30° C到40° C范圍內(nèi)，如約37° C儲(chǔ)藏至少I周后，其具有更少的紙樣味道。優(yōu)選地，通過(guò)經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的品嘗小組評(píng)價(jià)，所述紙樣味道少于90%，更優(yōu)選少于80%，如少于70%。還優(yōu)選與由野生型大麥制備的類似飲料相比，本發(fā)明的飲料在高溫儲(chǔ)藏后具有較少的紙樣味道。當(dāng)由受過(guò)培訓(xùn)的專家品嘗小組確定“紙樣味道”性質(zhì)(如上文所述)并以O(shè)到5分(其中O為無(wú)，5為極大)等級(jí)進(jìn)行評(píng)分時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明的飲料具有一個(gè)或優(yōu)選兩個(gè)以下所有對(duì)紙味道的分值:(i)在37°C溫育I周后，紙樣味道分值比以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料的紙樣味道分值低至少0.5,優(yōu)選低至少0.7 ；(ii)在37 °C溫育2周后，紙樣味道分值比以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Rosalina制備的飲料的紙樣味道分值低至少0.5,優(yōu)選低至少0.7,更優(yōu)選低至少0.8，低至少1 ;有趣的是，本發(fā)明公開(kāi)了根據(jù)本發(fā)明制備的飲料的總風(fēng)味分值與由野生型大麥制備的飲料相比有所提高。這可能部分由于DMS可掩蓋某些期望味道的發(fā)現(xiàn)。因此，當(dāng)在優(yōu)選使用增壓加熱而不煮沸相應(yīng)的麥芽汁的情況下已制備所述飲料時(shí)，優(yōu)選本發(fā)明的飲料具有這樣的總風(fēng)味分值，其比以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選由cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料的風(fēng)味分值高至少I,優(yōu)選至少1.5,更優(yōu)選至少2。所述風(fēng)味分值應(yīng)該在I到9分的等級(jí)上評(píng)分，其中9代表了啤酒品嘗專家小組給出的最高分值。當(dāng)飲料甚至在儲(chǔ)藏后也包含非常低水平的游離T2N時(shí)，所述飲料被稱為具有“穩(wěn)定的感官品質(zhì)”。因此，本發(fā)明的目的是提供使用雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株制造的飲料(如具有穩(wěn)定的感官品質(zhì)的啤酒)。因此，優(yōu)選在30° C到40° C范圍，優(yōu)選37° C的溫度下儲(chǔ)藏至少I周，優(yōu)選至少2周，更優(yōu)選至少3周，甚至更優(yōu)選至少4周后，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選由cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料相比,本發(fā)明的飲料包含少于80%,優(yōu)選少于70%,更優(yōu)選少于65%，甚至更優(yōu)選少于60%，甚至更優(yōu)選少于55%的游離T2N。還優(yōu)選在37° C儲(chǔ)藏2周后，本發(fā)明的飲料包含少于0.025ppb的游離T2N。在本發(fā)明的另一具體的實(shí)施方案中，飲料，優(yōu)選啤酒由僅經(jīng)過(guò)短時(shí)間熱處理，如在95到99° C范圍內(nèi)的溫度下處理10到30分鐘的加熱麥芽汁制備。優(yōu)選地，所述加熱麥芽汁已經(jīng)按上文“加熱麥芽汁”部分中所述進(jìn)行了加熱。在其中由這種加熱的麥芽汁制備飲料(優(yōu)選啤酒)的本發(fā)明的實(shí)施方案中，在30到40°C的范圍，優(yōu)選37°C的溫度下儲(chǔ)藏至少I周，優(yōu)選至少2周，更優(yōu)選至少3周，甚至更優(yōu)選至少4周后，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料相比,本發(fā)明的飲料(優(yōu)選啤酒)包含少于80%，優(yōu)選少于70%，更優(yōu)選少于65%的游離T2N。特別地,優(yōu)選在存在不超過(guò)IOppm的亞硫酸鹽水平,優(yōu)選I到IOppm范圍的亞硫酸鹽水平，更優(yōu)選I到8ppm范圍，更優(yōu)選2到6ppm范圍,還更優(yōu)選3到6ppm范圍的亞硫酸鹽水平的情況下，在30到40°C的范圍，優(yōu)選37°C的溫度下儲(chǔ)藏2周后，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選CV.Quench或cv.Rosalina制備的飲料相比，由所述加熱的麥芽汁制備的此類飲料(優(yōu)選啤酒)包含非常低水平的T2N，優(yōu)選少于80%，優(yōu)選少于70%，更優(yōu)選少于65%的游離T2N。還特別優(yōu)選在37°C儲(chǔ)藏8周后，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料相比，本發(fā)明的飲料(如啤酒,例如大麥啤酒)包含非常低水平的T2N，優(yōu)選少于80%，優(yōu)選少于70%，更優(yōu)選少于60%，甚至更優(yōu)選少于5%的游離T2N。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有低水平的某些三羥基十八碳烯酸(也被稱為THA)的飲料，如啤酒，特別是具有低水平9，12，13-THA和9，10，13-THA的飲料。THA的特征在于苦味(Baur和Grosch, 1977 ;Baur等人，1977),使得不希望所述化合物存在于飲料中。因此，期望9，12，13-THA和9，10, 13-THA的水平盡可能低，例如低于1.3ppm，如低于lppm。因此,優(yōu)選9，12, 13-THA的水平盡可能低,例如低于1.3ppm,如低于lppm。還優(yōu)選9，10, 13-THA水平也盡可能低，例如低于1.3ppm，如低于lppm。然而，源自麥芽的飲料(如啤酒)中9，12，13-THA和9，10，13-THA的總濃度還依賴于用于制備所述特定飲料的麥芽量。因此，通常高濃度啤酒將包含比淡啤酒多的9，12，13-THA和9，10，13-THA，從而使高濃度啤酒中能接受整體水平較高的9，12，13-THA和9，10，13-THA。因此，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料相比,優(yōu)選本發(fā)明的飲料包含較低水平的9，12，13-THA和9，10, 13-THA。特別地，優(yōu)選與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Rosalina制備的飲料中的水平相比,本發(fā)明的飲料中9，12, 13-THA的水平最多為50%，優(yōu)選最多為40%，更優(yōu)選最多為30%。還優(yōu)選與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制備的飲料中的水平相比，本發(fā)明的飲料中9，10, 13-THA的水平優(yōu)選最多為70%，優(yōu)選最多為60%，如最多50%，例如最多40%。可通過(guò)使用雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥制備此類飲料。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥制備的飲料具有改良的泡沫性質(zhì)。當(dāng)所述飲料是啤酒時(shí)，這具有特別重大的意義。因此，本發(fā)明的目的是提供具有優(yōu)異泡沫性質(zhì)的飲料，如啤酒。優(yōu)選地，與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Quench制備的飲料相比，本發(fā)明的飲料在60到80分鐘內(nèi)，優(yōu)選80分鐘內(nèi)產(chǎn)生的泡沫多至少1.5倍，優(yōu)選至少2倍，還更優(yōu)選至少3倍。所述泡沫的產(chǎn)生按下文實(shí)施例8中所述進(jìn)行測(cè)定。植物產(chǎn)品本發(fā)明的目的是提供植物產(chǎn)品，優(yōu)選大麥植物產(chǎn)品，其特征在于具有低水平的一種或多種異味物。特別地，本發(fā)明的目的是提供植物產(chǎn)品，優(yōu)選大麥植物產(chǎn)品，其具有低水平的T2N、DMS及其相應(yīng)的前體。如本發(fā)明所述，可由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥有利地制備此類植物產(chǎn)品。所述植物產(chǎn)品可以是麥芽，優(yōu)選上文“制麥”部分中描述的任何麥芽。所述產(chǎn)品可以是麥芽汁，優(yōu)選上文“麥芽汁”部分中描述的任何麥芽汁；其還可以是飲料，優(yōu)選上文“飲料”部分中描述的任何飲料。然而，所述植物產(chǎn)品也可以是由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株或其部分制備的其它植物產(chǎn)品，其特征在于低水平的T2N、T2N潛能、DMS和DMSP。
因此，本發(fā)明涉及植物產(chǎn)品，所述植物產(chǎn)品可以是包含下文所述的大麥植株或其部分的組合物，或者是由所述大麥植株或其部分制備的組合物，如由所述大麥植株或其部分制備的植物產(chǎn)品。由于所述大麥植株缺乏L0X-1、L0X-2和MMT活性，所述組合物通常包含非常低水平的異味物及其前體分子，特別是T2N、T2N潛能、DMS和DMSP。本文描述了包含具有導(dǎo)致功能性LOX-1完全喪失的第一突變、導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變和導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變的大麥植株或由其制備的有用植物產(chǎn)品的實(shí)例。
與以相同方式由野生型大麥植物,優(yōu)選cv.Power或cv.Quench或cv.Rosalina制備的類似植物產(chǎn)品相比，優(yōu)選所述植物產(chǎn)品包含以下一種或多種，優(yōu)選以下至少兩種，甚至更優(yōu)選以下全部:(i)少于60%，甚至更優(yōu)選少于50%，還更優(yōu)選少于40%，如少于30%，優(yōu)選少于20%，更優(yōu)選少于10%的游離T2N ；(ii)少于60%，甚至更優(yōu)選少于50%，還更優(yōu)選少于40%，如少于30%，優(yōu)選少于25%的T2N潛能；(iii)少于30%，優(yōu)選少于20%，更優(yōu)選少于15%，甚至更優(yōu)選少于10%的DMS ；(iv)少于30%，優(yōu)選少于20%，更優(yōu)選少于15%，甚至更優(yōu)選少于10%，如少于5%，例如少于2%的SMM ；(V)少于30%，優(yōu)選少于20%，更優(yōu)選少于15%，甚至更優(yōu)選少于10%的DMSP。本發(fā)明一方面涉及具有導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變、導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變和導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變的大麥粒。本發(fā)明還涉及包含所述麥粒的組合物和由所述麥粒制備的組合物，以及由所述麥粒制備的植物產(chǎn)品。在其它方面，本發(fā)明涉及植物產(chǎn)品，其可以是包含雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植物或其部分的食物組合物、飼料組合物以及香料組合物(fragrance raw materialcomposition)。食物組合物可以是,例如但不限于發(fā)芽或未發(fā)芽的大麥粒、碾磨的大麥、大麥粗粉、面包、粥、包含大麥的谷類混合物、保健品如包含大麥的飲料、大麥糖漿，以及薄片狀、碾碎的、微粉化的或擠出的大麥組合物。飼料組合物包括例如，包含大麥粒和/或粗粉的組合物。飼料組合物可以是例如醪液。下文將對(duì)香料組合物進(jìn)行描述。本發(fā)明還涉及本發(fā)明多種植物產(chǎn)品的混合物。例如，本發(fā)明一方面涉及通過(guò)以下物質(zhì)的混合物制備的組合物:(i)包含大麥植株(植物)或其部分的組合物，其中所述大麥植株(植物)或其部分包含導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變、導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變和導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變；和(ii)由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT麥粒制備的麥芽組合物。可獲得多種方法用于確定大麥植物(植物)或植物產(chǎn)品是否分別由L0X-l、L0X-2和MMT基因攜帶引起功能性L0X-1完全喪失、功能性L0X-2完全喪失和功能性MMT完全喪失的突變的大麥植株制備。植物產(chǎn)品通常會(huì)包含至少一些來(lái)自用于生產(chǎn)該植物產(chǎn)品的植物的基因組DNA。因此，麥芽將包含大量的基因組DNA，但即便是大麥或麥芽提取物(如麥芽汁)也可以包含來(lái)自所述大麥或麥芽的基因組DNA或其片段。同樣,基于大麥的飲料(如啤酒)也可包含來(lái)自所述植物的基因組DNA或其片段。通過(guò)分析植物產(chǎn)品中的DNA，可以確定用于制備植物產(chǎn)品的植物是否攜帶引起功能性L0X-1完全喪失、功能性L0X-2完全喪失和功能性MMT完全喪失的L0X-1、L0X-2和MMT基因突變。所述突變可以是，例如在下文“功能性LOX的喪失”部分中描述的L0X-1和L0X-2基因的任何突變。MMT基因中的所述突變可以是例如在下文“功能性MMT的喪失”部分中描述的MMT基因的任何突變?？梢酝ㄟ^(guò)任何有用的方法，如通過(guò)測(cè)序或者通過(guò)基于擴(kuò)增的方法(包括基于PCR的方法)分析所述基因組DNA。如果認(rèn)為L(zhǎng)OX-1基因和/或L0X-2基因和/或MMT基因具有特定突變，則可以采用多態(tài)性分析，例如SNP分析。對(duì)于確定L0X-1基因和/或L0X-2基因中的突變，在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355實(shí)施例10中描述了有用的SNP分析的非限制性實(shí)例。對(duì)于確定MMT基因中的突變，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315在實(shí)施例13和17中描述了有用的SNP分析的非限制性實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)@些實(shí)施例中描述的特定SNP分析進(jìn)行適應(yīng)性改進(jìn)以用于其它突變或者其它起始材料。如果上述植物產(chǎn)品僅由雙無(wú)效LOX無(wú)效-MMT的大麥植株制備，則大麥L0X_lmRNA、L0X-2mRNA和MMT mRNA和/或大麥L0X-1蛋白、L0X-2蛋白和MMT蛋白的存在與否也可以作為表明所述植物產(chǎn)品是否由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植物制備的指標(biāo)?？梢岳肳estern印跡分析，或者其它蛋白質(zhì)分析，或者 利用RT-PCR,或者利用Northern印跡分析,或者利用其它mRNA分析完成植物產(chǎn)品的檢測(cè)。當(dāng)所述植物產(chǎn)品為麥芽時(shí)，此類分析特別有用。大麥植物(植株)本發(fā)明涉及基于谷類的飲料。谷類可以選自例如大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、稻、高粱、小米、黑小麥、蕎麥、fonio和quinona。更優(yōu)選地,所述谷類選自大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米和稻，更優(yōu)選地所述谷類是大麥。因此，本發(fā)明優(yōu)選涉及基于大麥的飲料和用于制備本發(fā)明飲料的大麥植植株。大麥?zhǔn)且活愔参铩！耙吧篼湣?Hordeum vulgare ssp.Spontaneum)被認(rèn)為是當(dāng)今大麥栽培形式的祖先。認(rèn)為大麥從野生態(tài)至栽培態(tài)的轉(zhuǎn)變與多個(gè)基因座的等位基因頻率的重要變化同時(shí)發(fā)生。農(nóng)場(chǎng)主積極選擇稀少的等位基因和新突變事件，并很快在稱作“大麥當(dāng)?shù)仄贩N”的馴化植物群體中確立新特征。與野生大麥相比，這些大麥在遺傳上與現(xiàn)代栽培品種更密切相關(guān)。直至十九世紀(jì)晚期，大麥當(dāng)?shù)仄贩N才作為近交系和雜種分離子的高度異源混合物出現(xiàn)，其包括由較早世代的隨機(jī)雜交而來(lái)的少數(shù)植株。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，大多數(shù)當(dāng)?shù)仄贩N已經(jīng)被純系栽培品種取代。剩余當(dāng)?shù)仄贩N的特征在于中等水平或高水平的遺傳多樣性。最初，“現(xiàn)代大麥”栽培品種代表了自當(dāng)?shù)仄贩N的選擇。后來(lái)，這些栽培品種來(lái)源于確定的純系，例如不同地理來(lái)源的純系之間連續(xù)多輪的雜交。最后，導(dǎo)致在許多，也可能是所有現(xiàn)代農(nóng)作物的遺傳基礎(chǔ)顯著縮小。與當(dāng)?shù)仄贩N相比，現(xiàn)代大麥栽培品種有多個(gè)改良的性質(zhì)(Nevo, 1992; von Bothmer等人,1992)，例如但不限于以下以下一個(gè)或多個(gè):(i)隱藏和裸露的麥粒；Qi)種子休眠；(iii)抗病性；Qv)環(huán)境耐受性(例如對(duì)干旱或土壤pH的耐受性)；(v)賴氨酸和其它氨基酸的量；(vi)蛋白含量；(vii)氮含量；(viii)碳水化合物組成；Qx)大麥醇溶蛋白(hordein)的含量和組成；(x) (1-3, 1_4)-β -葡聚糖和阿拉伯糖基木聚糖的含量；(xi)產(chǎn)率；(xii)麥桿硬度；和(xiii)株高。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“大麥植物(植株)”包括任何大麥植物(植株)，如大麥當(dāng)?shù)仄贩N或現(xiàn)代大麥栽培品種。因此，本發(fā)明涉及包含導(dǎo)致功能性L0X-1完全喪失的第一突變、導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變和導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變的任何大麥植株。該大麥植株的實(shí)例描述于下文實(shí)施例中并稱作“三無(wú)效”或“三無(wú)效大麥”。然而，優(yōu)選用于本發(fā)明的大麥植物是現(xiàn)代大麥栽培品種或純系。待根據(jù)本發(fā)明使用的大麥栽培品種可以選自例如Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、MaresiΛ Steff1、GimpeK CheriΛ Krona、CamargueΛ Chariot、Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi5、K0U AΛSwan Hals、Kanto Nakate Gold、HakataN0.2、Kirin - choku N0.1、Kanto late Variety Gold、Fuji Nijo、New Golden、SatukioNijo、Seijo N0.17、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、Nishino Gold、Misatogolden、Haruna Ni jo、Scarlett、Rosalina 和 Jersey，優(yōu)選選自 Haruna Ni jo、Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda 和 Power，優(yōu)選選自 Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Frankl in、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Mares1、Steff1、GimpeK CheriΛ Krona、CamargueΛ Chariot、DerkadoΛ Prisma、Union、Beka、KymΛAsahi5、KOUAΛ Swan Hals、Kanto Nakate Gold、Hakata N0.2、Kirin-choku N0.1、Kantolate Variety Gold、FujiNijo、New Golden、Satukio Nijo、Seijo N0.17、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、Nishino Gold、Misato golden、Haruna Ni jo、Scarlett 和Jersey,優(yōu)選選自 Haruna Nijo、Sebastian、Tangent、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Power λ Quench、NFC Tipple、Barke Λ Class 和 Vintage。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述大麥植物是包含導(dǎo)致功能性LOX-1完全喪失的第一突變、導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變和導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變的現(xiàn)代大麥栽培品種(優(yōu)選選自上文列出的大麥栽培品種的栽培品種)。因此，在該實(shí)施方案中，優(yōu)選所述大麥植物不是大麥當(dāng)?shù)仄贩N。所述大麥植株可以是任何適合的形式。例如，本發(fā)明的大麥植株可以是能活的大麥植株、干燥的植株、均質(zhì)化的植株或者經(jīng)碾磨的大麥粒。所述植株可以是成熟的植株、胚、萌芽的麥粒、發(fā)芽的麥粒或經(jīng)碾磨的發(fā)芽麥?；蚪?jīng)碾磨的麥粒等。大麥植株的部分可以是所述植株的任何合適的部分，例如麥粒、胚、葉、莖、根、花或其小部分(fraction)。所述小部分可以是,例如麥粒、胚、葉、莖、根或花的部分。大麥植株的部分還可以是勻漿的小部分或者經(jīng)碾磨的大麥植物或麥粒的小部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中`，大麥植株的部分可以是所述大麥植株的細(xì)胞，如可以在體外組織培養(yǎng)物中繁殖的活細(xì)胞。然而，在另一實(shí)施方案中，大麥植株的部分可以是不能成熟為完整大麥植物的活細(xì)胞，即不是生殖物質(zhì)的細(xì)胞。功能性LOX的喪失本發(fā)明涉及具有第一突變、第二突變和第三突變的大麥植株或其部分或其植株產(chǎn)品，其中所述第一突變導(dǎo)致功能性LOX-1的完全喪失，并且所述第二突變導(dǎo)致功能性L0X-2的完全喪失。如在下文“功能性MMT喪失”部分中更詳細(xì)的描述，所述第三突變導(dǎo)致功能性MMT的完全喪失。功能性LOX-1的完全喪失和功能性L0X-2的完全喪失可獨(dú)立地基于不同的機(jī)制。例如，LOX-1和L0X-2活性中的一個(gè)或兩個(gè)的功能完全喪失可以由大麥植株中的異常蛋白質(zhì)，即異常LOX-1和/或L0X-2蛋白引起，如由沒(méi)有可檢測(cè)到的9-HP0DE形成活性的突變LOX-1蛋白(其中優(yōu)選按照國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355實(shí)施例4中描述來(lái)測(cè)定9-HP0DE)引起，和/或由沒(méi)有可檢測(cè)到的13-HP0DE形成活性的突變L0X-2蛋白質(zhì)(其中優(yōu)選按照國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355實(shí)施例4中描述來(lái)測(cè)定13-HP0DE)弓丨起。功能性LOX-1和/或L0X-2的完全喪失可以由L0X-1和/或L0X-2蛋白的缺乏引起。明顯地，LOX-1蛋白質(zhì)的缺乏將導(dǎo)致功能性LOX-1喪失，而L0X-2蛋白質(zhì)的缺乏將導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失。因此，所述大麥植株可優(yōu)選不包含，或僅包含非常少的LOX-1和/或L0X-2蛋白，更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的L0X-1和/或L0X-2蛋白。L0X-1和/或L0X-2蛋白可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方式進(jìn)行檢測(cè)。然而，優(yōu)選通過(guò)其中利用特異性的L0X-1和L0X-2抗體(例如L0X-1和L0X-2的多克隆抗體)檢測(cè)L0X-1蛋白的技術(shù)對(duì)所述蛋白進(jìn)行檢測(cè)。所述技術(shù)可以是，例如Western印跡或ELISA。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。然而，優(yōu)選所述抗體為分別識(shí)別L0X-1和L0X-2蛋白中的數(shù)個(gè)不同表位的多克隆抗體。還可以間接檢測(cè)L0X-1和/或L0X-2蛋白質(zhì)，例如通過(guò)測(cè)定L0X-1活性的方法，或者通過(guò)測(cè)定L0X-2活性的方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，利用國(guó)際專利申請(qǐng)TO 2005/087934的實(shí)施例4中列出的方法檢測(cè)L0X-1蛋白?？梢岳门c大麥L0X-2結(jié)合的抗體以類似的方式檢測(cè)L0X-2蛋白。L0X-1和L0X-2活性中的一個(gè)或兩個(gè)的功能完全喪失還可以是沒(méi)有或幾乎沒(méi)有表達(dá)L0X-1轉(zhuǎn)錄本和/或L0X-2轉(zhuǎn)錄本的結(jié)果，優(yōu)選是沒(méi)有表達(dá)L0X-1轉(zhuǎn)錄本和/或L0X-2轉(zhuǎn)錄本的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解L0X-1和/或L0X-2轉(zhuǎn)錄本的缺失也將分別導(dǎo)致L0X-1或L0X-2翻譯蛋白的缺失。或者，功能性L0X-1和功能性L0X-2的完全喪失也可以是表達(dá)異常的L0X-1轉(zhuǎn)錄本和/或異常的L0X-2轉(zhuǎn)錄本的結(jié)果。異常的L0X-1和/或L0X-2轉(zhuǎn)錄本可能是由轉(zhuǎn)錄本的異常剪接導(dǎo)致的，例如由于剪接位點(diǎn)的突變。因此，本發(fā)明的大麥植株可以具有位于剪接位點(diǎn)中的突變，例如位于5’剪接位點(diǎn)或3’剪接位點(diǎn)中，例如在內(nèi)含子最5’端的一個(gè)或兩個(gè)核苷酸中，或者在內(nèi)含子最3’端的核苷酸之一中。L0X-1轉(zhuǎn)錄本具有異常剪接的突變的實(shí)例為W02005/087934中描述的突變體A618。編碼L0X-1或L0X-2的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)可以通過(guò)，例如Northern印跡或RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。突變已經(jīng)引起了 本發(fā)明的大麥植株的功能性L0X-1和L0X-2酶的完全喪失。因此，本發(fā)明的大麥植株通常在L0X-1基因中攜帶突變。所述突變可以在調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)，例如在啟動(dòng)子或內(nèi)含子內(nèi)，或者所述突變可以在編碼區(qū)內(nèi)。所述突變也可以是L0X-1基因或其部分的缺失，如完整編碼區(qū)的缺失。類似地，本發(fā)明的大麥植株通常在L0X-2基因中攜帶突變。所述突變可以在調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)，例如在啟動(dòng)子或內(nèi)含子內(nèi)，或者所述突變可以在編碼區(qū)內(nèi)。所述突變也可以是L0X-2基因或其部分的缺失，如完整編碼區(qū)的缺失。因此，還可以通過(guò)鑒定L0X-1編碼基因中或者L0X-2編碼基因中的突變而檢測(cè)功能性L0X-1和/或L0X-2酶完全喪失的原因。L0X-1和L0X-2編碼基因中的突變可以通過(guò)，例如對(duì)所述基因進(jìn)行測(cè)序而檢測(cè)。優(yōu)選地，在鑒定所述突變后，通過(guò)測(cè)定L0X-1和/或L0X-2活性而驗(yàn)證功能的完全喪失。術(shù)語(yǔ)“L0X-1 蛋白質(zhì)”是指涵蓋 SEQ ID NO: 3 (對(duì)應(yīng)于 TO2005/087934 的 SEQ IDNO:3)或 SEQ ID N0:7(對(duì)應(yīng)于W02005/087934 的SEQ ID NO:7)所示的大麥全長(zhǎng) L0X-1 蛋白或其功能同源物。L0X-1的活性位點(diǎn)位于所述酶的C末端部分。特別地，認(rèn)為跨越氨基酸殘基520-862的區(qū)域或其部分(優(yōu)選氨基酸號(hào)520-862的整個(gè)區(qū))與L0X-1活性有關(guān)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，L0X-1無(wú)效大麥優(yōu)選包含編碼缺失L0X-1氨基酸520-862中的部分或全部氨基酸的突變形式L0X-1的基因。所述突變L0X-1還可以缺失存在于野生型L0X-1中的其它氨基酸殘基。因此，本發(fā)明的雙無(wú)效LOX大麥可以包含非功能性的截短形式的L0X-1，例如N-末端或C-末端被截短的形式。優(yōu)選地，所述截短形式包含SEQ ID NO: 3 (對(duì)應(yīng)于W02005/087934的SEQ ID NO: 3)所示L0X-1的不超過(guò)800個(gè)，更優(yōu)選不超過(guò)750個(gè)，甚至更優(yōu)選不超過(guò)700個(gè)，還更優(yōu)選不超過(guò)690個(gè)，甚至更優(yōu)選不超過(guò)680個(gè)，還更優(yōu)選不超過(guò)670個(gè)LOX-1的連續(xù)氨基酸，例如不超過(guò)665個(gè)，例如不超過(guò)650個(gè)，如不超過(guò)600個(gè)，例如不超過(guò)550個(gè)，如不超過(guò)500個(gè)，例如不超過(guò)450個(gè)，如不超過(guò)425個(gè)，例如不超過(guò)399個(gè)連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，所述截短形式僅包含L0X-1的N末端片段，優(yōu)選SEQ ID NO: 3 (對(duì)應(yīng)于W02005/087934的SEQ ID NO: 3)的N-末端的最多800個(gè)，更優(yōu)選最多750個(gè)，甚至更優(yōu)選最多700個(gè)，還更優(yōu)選最多690個(gè)，甚至更優(yōu)選最多680個(gè)，還更優(yōu)選最多670個(gè)，甚至更優(yōu)選最多665個(gè)氨基酸，如包含SEQ ID NO: 3 (對(duì)應(yīng)于W02005/087934的SEQ ID NO: 3)的N-末端的不超過(guò)665個(gè)，例如不超過(guò)650個(gè)，如不超過(guò)600個(gè)，例如最多550個(gè)，如最多500個(gè)，例如最多450個(gè)，如最多425，例如最多399個(gè)氨基酸。除了 L0X-1的片段，所述截短形式還可任選地包含野生型L0X-1中不存在的額外C末端序列。如果所述截短形式由異常剪接引起，這可能尤其如此。優(yōu)選地，所述額外的C末端序列由最多50個(gè)，更優(yōu)選最多30個(gè)，甚至更優(yōu)選最多10個(gè)，還更優(yōu)選最多4個(gè)，或最多I個(gè)氨基酸組成。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述截短形式可以由SEQ ID N0:3(對(duì)應(yīng)于W02005/087934 的 SEQ ID NO:3)的氨基酸 1-665 組成。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，大麥植株包含被轉(zhuǎn)錄成mRNA的L0X-1編碼基因，其中所述mRNA在野生型LOX-1mRNA的終止密碼子的上游包含無(wú)義密碼子或者終止密碼子。這種無(wú)義密碼子在本文中被命名為提前終止的無(wú)義密碼子。優(yōu)選地，所述植株的所有轉(zhuǎn)錄成mRNA的L0X-1編碼基因都包含提前終止的無(wú)義密碼子或終止密碼子。所述無(wú)義密碼子或終止密碼子優(yōu)選位于起始密碼子下游的最多800個(gè)，更優(yōu)選最多750個(gè)，甚至更優(yōu)選最多700個(gè)，還更優(yōu)選最多690個(gè)，甚至更優(yōu)選最多680個(gè)，還更優(yōu)選最多670個(gè)，甚至更優(yōu)選最多665個(gè)密碼子處。編碼L0X-1的野生型基因組DNA的序列示于SEQ ID NO:1 (對(duì)應(yīng)于 TO2005/087934 的 SEQ ID NO:1)或者 TO2005/087934 的 SEQ ID NO: 5。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的大麥植物包含編碼L0X-1的基因，其中由所述基因轉(zhuǎn)錄的相應(yīng)的前mRNA包含對(duì)應(yīng)于W02005/087934的SEQID NO: 2的序列。在本發(fā)明的非常 優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的雙無(wú)效LOX大麥植株的突變L0X-1的編碼基因包含無(wú)義突變，所述突變對(duì)應(yīng)于W02005/087934的SEQ ID N0:1的第3574位的G — A取代。術(shù)語(yǔ)“L0X-2蛋白質(zhì)”表示涵蓋本申請(qǐng)SEQ ID NO: 7 (對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的SEQ ID NO: 5)所示的大麥全長(zhǎng)L0X-2蛋白或其功能同源物。L0X-2的活性位點(diǎn)位于L0X-2的C末端部分。特別地，認(rèn)為跨越氨基酸殘基515-717的區(qū)域或其部分與L0X-2的活性有關(guān)。根據(jù)大豆L0X-1晶體結(jié)構(gòu)的檢測(cè)，認(rèn)為氨基酸殘基515-525和707-717代表了大麥L0X-2酶的活性位點(diǎn)裂隙的序列延伸段。所翻譯的突變L0X-2蛋白，即大麥雙無(wú)效LOX突變體A689的C-末端截短形式，最多包含684個(gè)殘基，并且因此缺失活性位點(diǎn)裂隙的第二序列延伸段，從而導(dǎo)致其失活。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的雙無(wú)效LOX大麥優(yōu)選包含編碼L0X-2的突變形式的基因，其中所述突變形式缺失L0X-2的氨基酸515-717中的一些或者全部氨基酸，優(yōu)選缺失氨基酸707-717中的一些或全部氨基酸，甚至更優(yōu)選缺失氨基酸707-717中的全部氨基酸。所述突變L0X-2還可以缺乏野生型L0X-2中存在的其它氨基酸殘基。因此，雙無(wú)效LOX大麥可包含非功能性的截短形式的L0X-2，例如N-末端或C-末端被截短的形式。優(yōu)選地，所述截短形式包含本申請(qǐng)的SEQ IDN0:7(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的SEQ ID NO: 5)的L0X-2的不超過(guò)800個(gè)，更優(yōu)選不超過(guò)750個(gè)，甚至更優(yōu)選不超過(guò)725，還更優(yōu)選不超過(guò)700個(gè)，甚至更優(yōu)選不超過(guò)690個(gè)，還更優(yōu)選不超過(guò)684個(gè)連續(xù)氨基酸。優(yōu)選地，所述截短形式僅包含LOX-2的N-末端片段。因此，優(yōu)選所述截短形式包含本申請(qǐng)SEQ ID N0:7(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355 的SEQ ID NO:5)的N-末端的最多800個(gè)，更優(yōu)選最多750個(gè)，甚至更優(yōu)選最多725個(gè)，還更優(yōu)選最多700個(gè)，甚至更優(yōu)選最多690個(gè)，還更優(yōu)選最多684個(gè)氨基酸。除了 LOX-12的片段，所述截短形式還可任選地包含野生型LOX-2中不存在的額外C末端序列。如果所述截短形式由異常剪接引起，則尤其如此。優(yōu)選地，所述額外的C末端序列由最多50個(gè)，更優(yōu)選最多30個(gè)，甚至更優(yōu)選最多10個(gè)，還更優(yōu)選最多4個(gè),或最多I個(gè)氨基酸組成。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述截短形式可以由本申請(qǐng)的SEQ IDN0:7(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的SEQ ID NO:5)的氨基酸1-684組成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述大麥植株包含被轉(zhuǎn)錄成L0X-2的mRNA的基因，其中所述mRNA在野生型L0X-2mRNA的終止密碼子的上游包含無(wú)義密碼子或者終止密碼子。這種無(wú)義密碼子在本文中被命名為提前終止的無(wú)義密碼子。優(yōu)選地，所述植物的轉(zhuǎn)錄成編碼L0X-2的mRNA的所有基因都包含提前終止的無(wú)義密碼子或終止密碼子。所述無(wú)義密碼子或終止密碼子優(yōu)選位于起始密碼子下游的最多800個(gè)，更優(yōu)選最多750個(gè)，甚至更優(yōu)選最多725個(gè)，還更優(yōu)選最多700個(gè)，甚至更優(yōu)選最多690個(gè)，還更優(yōu)選最多684個(gè)密碼子處。編碼L0X-2的野生型基因組DNA的序列示于SEQ ID NO: 5 (對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355 的 SEQ ID NO:1) 在本發(fā)明的非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述雙無(wú)效LOX大麥植株的突變L0X-2的編碼基因包含無(wú)義突變，所述突變對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:5(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355 的 SEQ ID NO:1)在第 2689 位的 G — A 取代。本發(fā)明的大 麥植物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的方法制備，優(yōu)選通過(guò)下文“雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥的制備”部分列出的方法之一制備。功能性MMT的喪失本發(fā)明涉及具有第一突變、第二突變和第三突變的大麥植株或其部分或其植物產(chǎn)品，其中所述第一突變導(dǎo)致功能性L0X-1的完全喪失，并且所述第二突變導(dǎo)致功能性L0X-2的完全喪失，兩者均更詳細(xì)地描述于“功能性LOX的喪失”部分中。所述第三突變導(dǎo)致功能性MMT的完全喪失。功能性MMT的完全喪失可基于不同的機(jī)制。例如，功能性MMT的完全喪失可以由所述植株中的異常蛋白質(zhì)，即異常MMT酶，如沒(méi)有可檢測(cè)到的活性的突變MMT蛋白引起。例如，突變體的MMT蛋白可以是截短的蛋白。MMT活性的喪失可類似地基于不同的機(jī)制，例如由異常MMT蛋白引起。優(yōu)選地，突變MMT蛋白的活性通過(guò)其催化甲基基團(tuán)從SAM轉(zhuǎn)移到Met上由此形成SMM的能力來(lái)測(cè)定。該測(cè)定可按照例如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例4中的描述進(jìn)行。優(yōu)選地，通過(guò)測(cè)定相應(yīng)的分離大麥cDNA的翻譯序列來(lái)獲得突變MMT的氨基酸序列。該過(guò)程可基本上按照國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例8中的描述進(jìn)行?；蛘?，按照國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)例11和實(shí)施例12中的描述，通過(guò)在細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物中的異源表達(dá)，隨后驗(yàn)證重組蛋白質(zhì)作為MMT酶是失活的，來(lái)獲得本發(fā)明的大麥植株的突變MMT?？赏ㄟ^(guò)缺失MMT蛋白實(shí)現(xiàn)功能性MMT的完全喪失。MMT蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致MMT功能的喪失。因此，大麥植株可不包含或僅包含很少的，優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的MMT蛋白。MMT蛋白的存在與否可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適方法檢測(cè)。然而，優(yōu)選通過(guò)其中通過(guò)識(shí)別MMT的特異性抗體檢測(cè)MMT蛋白的技術(shù)來(lái)分析蛋白質(zhì)。所述技術(shù)例如可以是蛋白印跡或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，并且所述特異性抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。然而，優(yōu)選所述抗體是識(shí)別MMT蛋白內(nèi)若干不同表位的多克隆抗體。還可以通過(guò)例如MMT活性測(cè)定法，間接檢測(cè)MMT蛋白。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)在植株中沒(méi)有可檢測(cè)的MMT蛋白時(shí)，認(rèn)為所述大麥植株在編碼MMT的基因中攜帶了突變，由此引起MMT活性的完全喪失。特別地，當(dāng)通過(guò)蛋白印跡分析在所述大麥植株，優(yōu)選在所述大麥植株的麥粒中沒(méi)有可檢測(cè)到的具有約120kDa，±10%質(zhì)量的MMT蛋白時(shí)，即是如此。功能性MMT的完全喪失也可以是沒(méi)有，或非常少，優(yōu)選沒(méi)有MMTmRNA轉(zhuǎn)錄的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，MMT轉(zhuǎn)錄本的缺失也會(huì)導(dǎo)致MMT蛋白的缺失。然而，優(yōu)選地，功能性MMT的完全喪失是異常MMT轉(zhuǎn)錄本表達(dá)的結(jié)果。所述轉(zhuǎn)錄本可優(yōu)選由初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的異常剪接事件(例如由于剪接位點(diǎn)的突變)引起的。例如可通過(guò)Northern印跡或通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)編碼MMT的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。本發(fā)明大麥植株中功能性MMT的完全喪失是由一個(gè)或多個(gè)突變引起的。因此，本發(fā)明的大麥植物通常在MMT基因中攜帶至少一個(gè)突變。所述突變可以在調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)，例如在啟動(dòng)子或內(nèi)含子內(nèi)，或所述突變?cè)诘鞍踪|(zhì)編碼區(qū)內(nèi)。所述突變也可以是MMT基因或其部分的缺失，例如MMT基因編碼區(qū)的缺失。因此，也可通過(guò)分析MMT編碼基因中的突變來(lái)檢測(cè)功能性MMT的喪失。例如可通過(guò)對(duì)所述基因進(jìn)行測(cè)序，隨后將其與野生型序列，優(yōu)選SEQ IDNO:9所示的cv.Prestige的野生型序列(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315中作為SEQ ID N0:3給出的序列)或cv.Sebastian的野生型序列(SEQ ID NO: 11，其對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的SEQID NO: 16)進(jìn)行比較來(lái)檢測(cè)MMT編碼基因中的突變。優(yōu)選地，鑒定完突變后，按照例如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)例2或?qū)嵤├?中描述，通過(guò)檢測(cè)MMT活性來(lái)驗(yàn)證功能的喪失。術(shù)語(yǔ)MMT蛋白表示涵蓋SEQ ID NO: 13 (對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO:6)所示的大麥全長(zhǎng)MMT蛋白或其功能同源物。在該上下文中，功能同源物是與SEQ ID NO: 13所示的大麥MMT蛋白具有相同水平MMT活性，±25%的MMT蛋白質(zhì)，其中按照國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)例2或?qū)嵤├?中描述來(lái)測(cè)定MMT活性。
攜帶引起MMT活性完全喪失的第三突變的大麥植株可包含MMT的無(wú)功能截短形式，如N末端或C末端截短形式。大麥植株可包含多于一個(gè)MMT截短形式，如2個(gè),或例如3個(gè)，或如多于3個(gè)不同的MMT截短形式，其可由異常剪接的轉(zhuǎn)錄本引起。所述截短形式僅包含MMT的N末端片段。除了野生型MMT的N末端片段外，所述MMT截短形式可包含野生型MMT中未發(fā)現(xiàn)的額外的C末端序列。所述額外的C末端序列可例如翻譯成內(nèi)含子序列，如由于異常剪接而包含在突變體mRNA中的那些內(nèi)含子序列。優(yōu)選地，所述截短MMT形式包含SEQ ID N0:13(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315 的SEQ ID NO:6)的N末端的最多500個(gè)，更優(yōu)選最多450個(gè)，甚至更優(yōu)選最多400個(gè)，還更優(yōu)選最多350個(gè)，甚至更優(yōu)選最多320個(gè)，還更優(yōu)選最多311個(gè)，或最多288個(gè)氨基酸殘基。當(dāng)所述大麥植株MMT活性完全喪失時(shí)，尤其如此。然而，所述MMT也可包含SEQ ID NO: 13 (對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO: 6)的N末端的更少個(gè)，如不多于300個(gè)，例如不多于250個(gè)，如不多于200個(gè)，例如最多150個(gè)，例如不多于147個(gè)或不多于133個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短形式的MMT可由SEQ ID N0:13(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO:6)的氨基酸1-311或氨基酸1-288和野生型MMT中不存在的任選地額外C末端序列組成。優(yōu)選地，所述額外的C末端序列由最多50個(gè)，更優(yōu)選最多30個(gè)，甚至更優(yōu)選最多10個(gè)，還更優(yōu)選最多4個(gè)，或最多I個(gè)氨基酸組成。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，MMT截短形式可以是國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的SEQ IDN0:11，或國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO: 13，或國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315 的 SEQ ID N0:15 的蛋白質(zhì)。國(guó)際專利申請(qǐng) PCT/DK2009/050315 的 SEQ IDNO: 11或SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15的蛋白均不代表功能性MMT酶。在另一非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，截短形式的MMT可由SEQ ID N0:14(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO: 18)的氨基酸1-147或氨基酸1-133和野生型MMT中不存在的任選地額外C末端序列組成。優(yōu)選地，所述額外的C末端序列由最多50個(gè)，更優(yōu)選最多40個(gè)，甚至更優(yōu)選最多39個(gè)，或最多33個(gè)，或最多30個(gè)氨基酸組成。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，MMT的截短形式可以是SEQ ID NO: 15,SEQ ID N0:16或SEQ ID N0:17(分別對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng) PCT/DK2009/050315 的 SEQ ID N0:22 或 SEQ ID N0:24 或 SEQ IDNO: 26)的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 17 (分別對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng) PCT/DK2009/050315 的 SEQ ID N0:22 或 SEQ ID N0:24 或 SEQ ID NO:26)的蛋白質(zhì)均不是功能性MMT酶。

MMT的上述截短形式可以例如存在于在MMT基因中攜帶突變的大麥植株中，其中所述突變引入提前成熟的終止密碼子，其形成編碼MMT上述截短形式的基因。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，大麥植株包含被轉(zhuǎn)錄成mRNA的MMT基因，所述mRNA包含一些，但不是全部剪接在一起且沒(méi)有干擾的野生型MMT基因(大麥野生型MMT基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)示于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的圖9中)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，因此優(yōu)選本發(fā)明大麥植株的MMT mRNA包含剪接在一起而沒(méi)有干擾的最多1、2、3、4和5號(hào)外顯子，或例如剪接在一起而沒(méi)有干擾的最多I號(hào)和2號(hào)外顯子。除了所述剪接在一起的外顯子外，本發(fā)明大麥植株的MMT mRNA還可包含衍生自野生型內(nèi)含子和/或外顯子的額外的3’末端序列，其中內(nèi)含子將外顯子序列隔開(kāi)。在通過(guò)RT-PCR確定并因此以bp表示片段長(zhǎng)度時(shí)，本發(fā)明大麥植株的異常MMT mRNA的優(yōu)選實(shí)例例示于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的圖12和圖16中。更優(yōu)選地，本發(fā)明大麥植株的異常mRNA是示于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的圖12中的那些mRNA (其在5’末端還包含I號(hào)和2號(hào)外顯子)，或示于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的圖16中的mRNA(其在5’末端還包含I號(hào)外顯子)。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，在MMT基因中攜帶引起功能性MMT完全喪失的第三突變的大麥植株在MMT基因內(nèi)的剪接位點(diǎn)上包含突變，其導(dǎo)致異常剪接的mRNA。更優(yōu)選地，所述突變定位于MMT基因的內(nèi)含子中，甚至更優(yōu)選定位于內(nèi)含子的5’剪接位點(diǎn)上，如I號(hào)內(nèi)含子(分隔I號(hào)和2號(hào)外顯子的內(nèi)含子)的5’剪接位點(diǎn)上，如2號(hào)內(nèi)含子(分隔2號(hào)和3號(hào)外顯子的內(nèi)含子)的5’剪接位點(diǎn)上，如3號(hào)內(nèi)含子(分隔3號(hào)和4號(hào)外顯子的內(nèi)含子)的5’剪接位點(diǎn)上，如4號(hào)內(nèi)含子(分隔4號(hào)和5號(hào)外顯子的內(nèi)含子)的5’剪接位點(diǎn)上，如5號(hào)內(nèi)含子(分隔5號(hào)和6號(hào)外顯子的內(nèi)含子)的5’剪接位點(diǎn)上，如6號(hào)內(nèi)含子(分隔6號(hào)和7號(hào)外顯子的內(nèi)含子)的5’剪接位點(diǎn)上,最優(yōu)選定位于2號(hào)內(nèi)含子或5號(hào)內(nèi)含子的5’剪接位點(diǎn)上。優(yōu)選所述突變是上述內(nèi)含子5’末端堿基的G —A突變。因此，非常優(yōu)選的突變是2號(hào)內(nèi)含子末端5’堿基的G —A突變，或5號(hào)內(nèi)含子最5’堿基的G —A突變。本發(fā)明的大麥植株可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適方法，優(yōu)選通過(guò)下文“制備雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥”部分中列出的方法制備。制備雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥本發(fā)明的大麥植株可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適方法制備。優(yōu)選地，本發(fā)明的大麥植株通過(guò)包括以下步驟的方法制備:誘變大麥植株或其部分(例如大麥粒)，然后篩選和選出特征在于功能性L0X-1完全喪失、功能性L0X-2完全喪失和/或功能性MMT完全喪失的大麥植株。本發(fā)明的大麥植株包含至少3個(gè)突變。因此，可通過(guò)以下來(lái)制備所述植株:制備僅包含一個(gè)所述突變的單獨(dú)大麥植株，然后雜交所述大麥植株或通過(guò)向大麥植株中連續(xù)引入所述突變或通過(guò)這些方法的組合來(lái)獲得具有所有3個(gè)突變的大麥植株。因此，本發(fā)明的大麥植物可通過(guò)以下來(lái)制備:誘變大麥植株或其部分(例如大麥粒)，然后篩選和選出特征在于功能性L0X-1完全喪失的大麥植株，并誘變另一大麥植株或其部分(例如大麥粒)，然后篩選和選出特征在于功能性L0X-2完全喪失的大麥植株，并誘變又一大麥植株或其部分(例如大麥粒)，然后篩選和選出特征在于功能性MMT完全喪失的大麥植株。所選出的大麥植株可最后進(jìn)行幾輪雜交，以獲得攜帶所有三個(gè)突變的大麥植株?；蛘撸景l(fā)明的大麥植株可以通過(guò)以下來(lái)制備:誘變大麥植株或其部分(例如大麥粒)，然后篩選和選出特征在于功能性XX完全喪失的大麥植株。可任選地繁殖所選出的大麥植株并且然后可誘變這些大麥植株或其部分(例如大麥粒)，然后篩選并選出特征在于功能性YY完全喪失的大麥植株?？扇芜x地繁殖所選出的大麥植株或其部分，然后:(i)可誘變這些大麥植株或其部分(例如大麥粒)，然后篩選并選出特征在于功能性ZZ完全喪失的大麥植株；或(ii)這些大麥植株可與特征在于功能性ZZ完全喪失的大麥植株雜交。在上述雜交中，XX、YY和ZZ各自表示L0X-1、L0X-2或MMT，其中XX不同于YY，YY不同于ZZ。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過(guò)以下方法制備所述大麥植株，所述方法包括誘變大麥植株或其部分(例如大麥粒)，然后篩選并選出還攜帶引起功能性L0X-2完全喪失的突變的大麥植株(即無(wú)效L0X-1-無(wú)效L0X-2或雙無(wú)效LOX植株)，其中所述大麥植株已經(jīng)攜帶了引起功能性L0X-1酶完全喪失的突變。該方法還涉及誘變其它大麥植株或其部分，篩選并選出功能性MMT完全喪失的大麥植株，最終將這些大麥植株與無(wú)效L0X-1-無(wú)效L0X-2大麥植株進(jìn)行雜交。合適地，無(wú)效L0X-1大麥植株為，例 如描述于國(guó)際專利申請(qǐng)W02005/087934中。
優(yōu)選篩選方法利用萌芽胚作為鑒定特征在于功能性L0X-2完全喪失的大麥植株的初始材料。有趣的是，根據(jù)多達(dá)21，000個(gè)成熟胚的篩選(其不揭示單個(gè)無(wú)效L0X-2大麥突變體)，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)較不優(yōu)選將成熟胚作為篩選L0X-2活性的初始材料。本發(fā)明的目的是提供用于制備雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株的方法，所述方法包括以下步驟:(i)制備雙無(wú)效LOX大麥植株；和(ii)制備無(wú)效MMT大麥植株；(iii)將所述雙無(wú)效LOX大麥植株與所述無(wú)效MMT大麥植株雜交；(iv)選出雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株。優(yōu)選通過(guò)包括以下步驟的方法制備所述雙無(wú)效LOX大麥植株:(i)提供L0X-1活性功能完全喪失，例如功能性L0X-1酶完全喪失的大麥植株或其部分；和(ii)誘變所述大麥植株,和/或來(lái)自所述大麥植株的大麥細(xì)胞,和/或大麥組織，和/或大麥粒，和/或大麥胚，由此獲得MO代大麥；和(iii)培育所述誘變后的大麥植株、麥粒和/或胚至少2代，由此獲得Mx代的大麥植株，其中X為≥2的整數(shù)；和(iv)獲得所述Mx大麥植株的胚；和(V)使所述胚萌芽；和(vi)測(cè)定所述萌芽胚或其部分中的L0X-1和L0X-2活性；和(vii)選 出所述萌芽胚中L0X-1活性和L0X-2活性完全喪失的植株；和(viii)分析L0X-1基因和L0X-2基因中的突變；和(ix)選出在L0X-1基因和L0X-2基因中攜帶突變的植株，即雙無(wú)效LOX植株；由此獲得在L0X-1和L0X-2基因中攜帶引起功能性L0X-1和功能性L0X-2完全喪失的突變的大麥植株。優(yōu)選使用包括以下步驟的方法制備所述無(wú)效MMT大麥植株:(i)誘變大麥植株,和/或大麥細(xì)胞,和/或大麥組織,和/或大麥粒,和/或大麥胚，由此獲得MO代大麥；和(ii)繁殖(例如通過(guò)培育)所述誘變后的大麥植株、麥粒和/或胚>2代，由此獲得Mx代的大麥植株，其中X為彡2的整數(shù)；和(iii)獲得所述Mx大麥植株的樣品；和(iv)測(cè)定所述樣品中SMM的水平；和(V)選出這樣的植株:其中所述樣品包含低于IOppb SMM，優(yōu)選低于5ppb SMM，更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM ;和(vi)對(duì)MMT基因的至少部分進(jìn)彳丁測(cè)序；和(vii)選出在MMT基因中攜帶突變的植株。L0X-1活性完全喪失的上述大麥植株可以是例如W02005/087934中描述的L0X-1活性完全喪失的任何大麥植株，優(yōu)選突變體D112或其子代植株。上述方法中的誘變步驟可以包括誘變選自以下的活材料:大麥植株、大麥細(xì)胞、大麥組織、大麥粒和大麥胚，優(yōu)選選自大麥植株、大麥粒和大麥胚，更優(yōu)選大麥粒。誘變可以通過(guò)任何合適的方法而進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將誘變劑和大麥植株或其部分一起溫育，例如和來(lái)自大麥的大麥?；騿为?dú)細(xì)胞一起溫育而進(jìn)行誘變。所述誘變劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括例如但不限于疊氮化鈉(NaN3)、甲磺酸乙酯(EMS)、疊氮丙三醇(AG，3-疊氮-1，2-丙烷-二醇)、甲基亞硝基脲(MNU)和馬來(lái)酰肼(MH)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)照射，例如通過(guò)紫外線照射大麥植株或其部分，例如麥粒來(lái)進(jìn)行誘變。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)下文“化學(xué)誘變”部分中列出的任何方法進(jìn)行誘變。合適的誘變方案的非限制性實(shí)例公開(kāi)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例2中。優(yōu)選進(jìn)行誘變的方式使得在篩選M3代的大麥時(shí)，期望突變體的預(yù)期頻率為每10, 000個(gè)谷粒至少0.5個(gè)，例如0.5-5個(gè)，例如0.9-2.3個(gè)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)大麥粒進(jìn)行誘變。用于誘變物的麥粒命名為MO代(另見(jiàn)圖8)?？梢栽谟擅妊看篼溑呓M成的樣品中，優(yōu)選在萌芽大麥胚的液體提取物中測(cè)定LOX活性。所述樣品，例如所述提取物可以由所述萌芽胚的任何合適的部分制備。通常，在制備大麥樣品的提取物和測(cè)定L0X-2活性前，必須利用任何合適的方法對(duì)所述樣品進(jìn)行勻質(zhì)。特別地，優(yōu)選蛋白提取物由萌芽胚或其部分制備，并且利用所述提取物測(cè)定LOX活性?？梢岳?，例如機(jī)械力，例如通過(guò)振蕩或攪拌，如通過(guò)在存在珠(例如玻璃珠或沙珠)的情況下振蕩而進(jìn)行勻質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述萌芽胚為Mx代的，其中X是> 2整數(shù)，優(yōu)選X是2-10的整數(shù)，更優(yōu)選是3-8的整數(shù)。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，在M3代的萌芽胚中或者在源自此胚的樣品中測(cè)定LOX活性。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選培育MO代的誘變大麥粒以獲得大麥植株，將所述大麥植株進(jìn)行雜交以得到Ml代的麥粒。重復(fù)該過(guò)程直至獲得M3代的麥粒(另見(jiàn)圖8)。LOX活性的測(cè)定可以利用任何合適的試驗(yàn)進(jìn)行，優(yōu)選使用下文所列的方法之一而進(jìn)行。特別地，優(yōu)選所述試驗(yàn)提供關(guān)于通過(guò)L0X-1和L0X-2的雙加氧作用將亞油酸轉(zhuǎn)化成9-HP0DE和13-HP0DE的數(shù)據(jù) 。因此，所述試驗(yàn)通常包括以下步驟:(i)提供由萌芽大麥胚或其部分制備的蛋白提取物；和(ii)提供亞油酸；和(iii)將所述蛋白提取物和所述亞油酸一起溫育；并(iv)測(cè)定亞油酸至9-HP0DE和13-HP0DE的雙加氧作用。所述方法的步驟(iv)優(yōu)選包括測(cè)定所述萌芽胚中，優(yōu)選由所述萌芽胚制備的蛋白提取物中的9-HP0DE和13-HP0DE的水平。所述步驟可以包括直接或間接測(cè)定9-HP0DE和13-HP0DE的水平?？梢詼y(cè)定所有HPODE的總水平，在此情況下優(yōu)選為了驗(yàn)證而進(jìn)行9-HP0DE和13-HP0DE的專門測(cè)定。一個(gè)方法可以是，例如其中使來(lái)自萌芽胚的蛋白提取物與作為底物的亞油酸一起溫育用以形成9-HP0DE和13-HP0DE的方法。然后可以通過(guò)多種方法檢測(cè)所述HP0DE。一個(gè)方法可以包括產(chǎn)生可檢測(cè)的化合物，例如染料。例如,所述方法可以是在血紅素存在下由所形成的HPODE催化的3- 二甲基氨基苯甲酸和3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙的氧化偶聯(lián)，以形成可以利用分光光度計(jì)在A595測(cè)定的吲達(dá)胺染料。此方法的實(shí)例描述于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例1和2中。利用該試驗(yàn)，認(rèn)為小于0.2A595單位的吸光讀數(shù)表示不存在L0X-1和不存在L0X-2活性。然而，用于測(cè)定L0X-1和L0X-2活性的更精確的方法是使來(lái)自萌芽胚的蛋白提取物和亞油酸一起溫育，然后測(cè)定9-HP0DE和13-HP0DE的含量。9-HP0DE和13-HP0DE的含量可以通過(guò)，例如利用基于HPLC的分析而測(cè)定。亞油酸至9-HP0DE和13-HP0DE的雙加氧作用可以直接或間接測(cè)定。本發(fā)明可以使用任何合適的測(cè)定方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)到了亞油酸氫過(guò)氧化物。例如，可以通過(guò)例如色譜法，如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355實(shí)施例4描述的HPLC直接測(cè)定 9-HP0DE 和 13-HP0DE。本發(fā)明公開(kāi)了用于為測(cè)定LOX活性而從萌芽胚提取蛋白質(zhì)的方法的某些方面是非常重要。因此，優(yōu)選利用酸性緩沖液，優(yōu)選PH為2到6的范圍，更優(yōu)選pH為3到5的范圍，甚至更優(yōu)選pH為3.5到5的范圍，還更優(yōu)選pH為4到5的范圍，甚至更優(yōu)選pH為4.5的酸性緩沖液提取所述蛋白質(zhì)。用于提取的緩沖液優(yōu)選基于有機(jī)酸，更優(yōu)選乳酸緩沖液。最優(yōu)選地，利用IOOmM乳酸緩沖液(pH4.5)制備蛋白提取物。本發(fā)明的某些實(shí)施方案公開(kāi)了用于檢測(cè)無(wú)效-L0X-1和無(wú)效-L0X-2植株的方法，所述方法包括9-HP0DE和13-HP0DE與染料(例如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)的反應(yīng)。優(yōu)選地，在加入亞油酸之后將所述染料(例如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙)加入到蛋白提取物中。優(yōu)選地，在使所述蛋白提取物與亞油酸接觸至少I分鐘，更優(yōu)選至少5分鐘，甚至更優(yōu)選至少10分鐘，例如I到 60分鐘，例如5到30分鐘，例如10到20分鐘后加入所述染料。用于選出本發(fā)明的大麥植株的優(yōu)選方法詳述于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例2中。所述選擇方法可經(jīng)調(diào)整用于基于微滴定板的實(shí)驗(yàn)方案或允許快速篩選許多樣品的其它已知的高通量重復(fù)測(cè)定方式。優(yōu)選分析至少5000株，例如至少7500株，例如至少10，000株，例如至少15，000，例如至少20，000，例如至少25，000誘變后的大麥植物的L0X-1活性和L0X-2活性?？梢酝ㄟ^(guò)數(shù)個(gè)不同的方法測(cè)定L0X-1編碼基因中的突變。例如，可以對(duì)L0X-1基因進(jìn)行完全或部分測(cè)序，并且將其序列與SEQ ID NO:1 (對(duì)應(yīng)于W02005/087934的SEQ IDNO:1)或者W02005/087934的SEQ ID NO: 5比較。如果尋找特異突變，可以采用SNP分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠設(shè)計(jì)可用于檢測(cè)給定的特異突變的引物，例如用于檢測(cè)在L0X-1的編碼序列內(nèi)產(chǎn)生提前終止密碼子的突變(例如上文描述的任意提前終止密碼子)的引物。如何進(jìn)行SNP分析的一個(gè)實(shí)例描述在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例10中，其中的引物可用于檢測(cè)在L0X-1基因的第3474位核苷酸的G — A突變?？梢酝ㄟ^(guò)幾種不同的方法測(cè)定L0X-2編碼基因中的突變。例如，可以對(duì)L0X-2基因進(jìn)行完全或部分測(cè)序，并將所述序列與SEQ ID N0:5(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的SEQ ID NO:1)比較。如果尋找特定突變，可以采用SNP分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠設(shè)計(jì)可用于檢測(cè)給定的特定突變的引物，例如用于檢測(cè)在L0X-2的編碼序列內(nèi)產(chǎn)生提前終止密碼子的突變(例如上文描述的任意提前終止密碼子)的引物。如何進(jìn)行SNP分析的一個(gè)實(shí)例描述于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例10中，其中的引物可用于檢測(cè)在L0X-2基因的第2689位核苷酸的G — A突變。如上文該部分詳述的雙無(wú)效LOX大麥植株的制備方法中的步驟(viii)和(ix)可以在步驟(vi)和(vii)之前進(jìn)行，在這種情況下，所述方法將包括順序依次為(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(viii)、(ix)、(vi)和(vii)的步驟,這種方法也包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。特別地，當(dāng)尋找特異突變時(shí)，例如在已經(jīng)鑒定的雙無(wú)效LOX大麥植株的子代植株中尋找特異突變時(shí)就是這種情況。優(yōu)選地，選出功能性MMT完全喪失的大麥植株包括從誘變的大麥植株，優(yōu)選萌芽的誘變大麥植株中獲得樣品，甚至更優(yōu)選從已經(jīng)萌芽了 4天的誘變的大麥植株獲得樣品。優(yōu)選所述樣品來(lái)自胚芽鞘和/或初生葉，優(yōu)選來(lái)自葉。因此，所述樣品可以是例如Icm到3cm的葉組織。如本文所述，可根據(jù)新開(kāi)發(fā)的多步驟方案提取并分析樣品，所述方案包括連續(xù)使用不同溶劑和結(jié)合物質(zhì)。通常，可以利用例如溶劑或溶劑混合物，優(yōu)選水和/或有機(jī)溶劑提取樣品。所述有機(jī)溶劑可以是例如醇，優(yōu)選甲醇，或者所述有機(jī)溶劑例如可以是鹵代烷，優(yōu)選氯仿。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述溶劑是水、甲醇和氯仿的混合物。有利地，可在例如使用振蕩器或混合器混合的同時(shí)進(jìn)行所述提取?？上蛉軇?樣品混合物中加入固體支持物，例如珠，如玻璃珠。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于測(cè)定MMT活性的上述葉樣品從Mx代麥粒中獲得，其中X是> 2整數(shù)，優(yōu)選2到10，更優(yōu)選3到8的整數(shù)。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，在M3代的萌芽植株中或其樣品(如葉)中測(cè)定MMT的水平。在所述實(shí)施方案中，優(yōu)選培育MO代的誘變大麥粒以獲得大麥植株，并隨后進(jìn)行雜交以得到Ml代的麥粒。重復(fù)該過(guò)程直至獲得M3代的麥粒(見(jiàn)圖8)。SMM水平的測(cè)定優(yōu)選基于下文所述的新方法。有趣的是，該方法可以進(jìn)行高通量篩選，使其可以鑒定特征在于功能性MMT完全喪失的大麥植物。一般來(lái)說(shuō)，所述方法優(yōu)選包括使如上所述制備的樣品，或優(yōu)選所述樣品的提取物與能夠結(jié)合SMM的化合物進(jìn)行反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)OPA試劑(Sigma，目錄號(hào)P7914;參考國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的圖2，下文中僅稱為0ΡΑ)尤其可用于測(cè)定SMM水平。OPA與除其他的SMM反應(yīng)，形成被稱為SMM-OPA的分子(參考國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的圖2)。所述反應(yīng)優(yōu)選包括將OPA與如上所述制備的樣品的提取物溫育。此外，還優(yōu)選向反應(yīng)混合物中加入3-巰基丙酸。所述混合物優(yōu)選維持在堿性pH，優(yōu)選pH8到pHll的范圍，更優(yōu)選pH9到pHll的范圍，甚至更優(yōu)選ρΗ9.5到ρΗΙΟ.5的范圍，如pHIO。優(yōu)選在0° C到10° C范圍，優(yōu)選1° C到8° C，甚至更優(yōu)選2° C到6° C，還更優(yōu)選3° C到5° C，如4° C溫度下進(jìn)行溫育。溫育時(shí)間優(yōu)選彡10分鐘?；赟MM-OPA分別在340nm和450nm吸收并發(fā)射光的觀察結(jié)果，可以通過(guò)使用熒光光譜進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的初始過(guò)程優(yōu)選包括在柱，優(yōu)選在30X2mm Gemini3yC18柱(Phenomenex,目錄號(hào)00A-4439-80;Phenomenex, 2006)上提取分離，隨后使用高通量液相色譜系統(tǒng)，優(yōu)選設(shè)計(jì)用來(lái)鑒定并測(cè)量在340nm激發(fā)并在450nm發(fā)射的分子的熒光水平的超高效液相色譜(UPLC系統(tǒng)，Waters)進(jìn)行熒光檢測(cè)。當(dāng)使用該方法時(shí)，“沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM”表示沒(méi)有與SMM共洗脫的可檢測(cè)到的化合物。在該上下文中，認(rèn)為色譜峰上的小“肩”是假峰。參考圖2,因此不認(rèn)為Asn/Ser右手邊上的小肩代表SMM峰。因此,作為示例,認(rèn)為圖2B中顯示的上邊兩個(gè)色譜圖描述了 “沒(méi)有可檢測(cè)的SMM”，然而所述圖中下邊的色譜圖則代表包含SMM的樣品的分離。
優(yōu)選按實(shí)施例2或?qū)嵤├?中所述進(jìn)行SMM的檢測(cè)。在下文實(shí)施例2中描述了用于選出本發(fā)明的大麥植株的優(yōu)選方法。用于分析的組織優(yōu)選取樣自萌芽的大麥植株，甚至更優(yōu)選已經(jīng)萌芽了 4天的大麥植株。應(yīng)注意的是，上述篩選方法特別有用。首先，所述分析方法是新的。此外，上述方法的顯著優(yōu)勢(shì)是建立了所述方法，其用于測(cè)定萌芽的大麥植株(如萌芽的大麥植株的葉)中的SMM水平。從萌芽大麥中取樣的時(shí)機(jī)獲得了意想不到干凈的制備物，用于基于UPLC檢測(cè)SMM。其它樣品(例如上述類似谷類的麥芽汁樣品)在組成上太復(fù)雜，通常不能用于測(cè)定SMM水平的所述色譜方法中。
在具有低于IOppb SMM，優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM的大麥植株的鑒定之后，通常將相應(yīng)的MMT基因或其部分進(jìn)行測(cè)序，以確定正在討論的大麥植株是否可以定義為在MMT基因中具有突變。然后選出特征在于沒(méi)有可檢測(cè)的SMM，并且其中MMT編碼基因的一個(gè)或多個(gè)堿基與野生型序列相比不同的大麥植株。在該上下文中，所述野生型序列優(yōu)選為在相應(yīng)的野生型大麥栽培品種中發(fā)現(xiàn)的序列，優(yōu)選SEQ ID N0:9(對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315中的SEQ ID NO:3)給出的序列。上文描述了優(yōu)選突變?？蛇M(jìn)一步繁殖所選出的大麥突變體，并根據(jù)SMM含量重新篩選后代植株。選出有用的大麥植株后，可將這些植株包括在這樣的育種方案中，所述育種方案利用在下文“植物培育”部分中描述的那些傳統(tǒng)方法。一旦鑒定出在L0X-1基因中包含特定突變且在L0X-2基因中包含特定突變且在MMT基因中包含特定突變(如上述任何突變)的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株，即可以通過(guò)傳統(tǒng)的育種方法，如通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的那些方法產(chǎn)生具有相同突變的其它大麥植株。例如，所述雙無(wú)效LOX大麥植株可以與另一大麥栽培品種回交。在選出功能性L0X-1、L0X-2和MMT完全喪失的有用大麥植物后，可以任選進(jìn)行一次或多次額外的篩選。例如，可以進(jìn)一步繁殖所選出的突變體，并且可以針對(duì)功能性L0X-1、L0X-2和MMT的完全喪失對(duì)新一代的植株進(jìn)行檢測(cè)。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選本發(fā)明的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株具有類似于野生型大麥的植物生長(zhǎng)生理學(xué)和谷粒發(fā)育。因此，優(yōu)選雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株在株高、每株的分蘗數(shù)、開(kāi)始開(kāi)花和/或每穗的谷粒數(shù)方面類似于野生型大麥(優(yōu)選cv.Power 或 cv.Quench 或 cv.Rosalina)。同樣，優(yōu)選本發(fā)明的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株在株高、抽穗期、抗病性、抗倒伏、穗破損、成熟時(shí)間和產(chǎn)量方面類似于野生型大麥，特別是類似于cv.Power或cv.Quench。在本發(fā)明上下文中，在表述數(shù)目的情況下，將“類似”理解為相同± 10%。這些參數(shù)可以按照下文實(shí)施例5中所述進(jìn)行測(cè)定。在本發(fā)明非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)將大麥系A(chǔ)689 (ATCC專利保藏名稱:PTA-9640)與大麥系8063 (ATCC專利保藏名稱:PTA_9543)雜交來(lái)制備大麥植物，隨后任選地進(jìn)行進(jìn)一步培育。大麥系A(chǔ)689的種子已經(jīng)在2008年12月4日以〃大麥，Hordeum vu IgareL.;A689系〃的名稱保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，地址為美國(guó)弗吉尼亞洲(VA20110)馬納薩斯市大學(xué)街(10801)專利存放處(Patent Depository, 10801UniversityBlvd., Manassas, VA20110, United States)(保藏號(hào) PTA-9640)。大麥系8063的種子已經(jīng)在2008年10月10日以〃大麥，Hordeum vulgare; 8063系〃的名稱保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，地址為美國(guó)弗吉尼亞洲(VA20110)馬納薩斯市大學(xué)街(10801)專利存放處(ATCC專利保藏號(hào):PTA-9543)。
化學(xué)誘變?yōu)榱水a(chǎn)生本發(fā)明的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株，可以通過(guò)任何合適的誘變方法，例如通過(guò)使用大麥粒的化學(xué)誘變法，通常通過(guò)多輪制備非常大量的大麥突變體。已知該方法隨機(jī)引入突變。可以利用任何化學(xué)誘變物質(zhì)進(jìn)行大麥的誘變。然而，優(yōu)選利用NaN3*理谷粒，使存活的谷粒萌芽，然后分析子代植株。由誘變的谷粒長(zhǎng)成的植株世代(稱為MO)包含任何給定突變的雜合嵌合體。在自花傳粉之后收集的子代植株稱為Ml代，在Ml代中，給定突變分離至相應(yīng)的雜合子和純合子中(參見(jiàn)圖8)。利用NaN3處理麥粒不等同于處理單個(gè)細(xì)胞，原因是處理之后的谷粒可包含一些未突變的細(xì)胞和多個(gè)具有DNA突變的細(xì)胞。由于在不形成種系細(xì)胞的細(xì)胞譜系中的突變會(huì)丟失，因此，目標(biāo)就是將誘變劑靶向發(fā)育為生殖性組織的少數(shù)細(xì)胞，其促成Ml代的產(chǎn)生。

為了評(píng)價(jià)整體突變效率，可計(jì)數(shù)MO和Ml代中的白化(albino)嵌合體和白化植株。由作為存活植株的函數(shù)的突變體計(jì)數(shù)(scoring mutant number)可得出估計(jì)的突變效率，而作為已處理種子的函數(shù)的突變體計(jì)數(shù)測(cè)定了突變效率和谷粒死亡二者。應(yīng)注意的是，在基因表達(dá)的幾乎每個(gè)步驟，細(xì)胞都具有可緩和損害突變的影響的質(zhì)量保證機(jī)制。真核生物中的一個(gè)經(jīng)過(guò)深入研究的實(shí)例是無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(稱為NMD)，其阻止合成潛在有害的提前截短蛋白質(zhì)(Maquat和Carmichael，2001; Wu等人，2007)。在NMD中，通過(guò)終止密碼子相對(duì)于下游脫穩(wěn)定元件的位置將其鑒定為翻譯提前終止密碼子。產(chǎn)生翻譯提前終止(無(wú)義)密碼子(PTC)的突變有時(shí)提高了選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄本的水平，由此跳過(guò)有害突變，從而可能挽救了蛋白質(zhì)的功能(Mendell和Dietz, 2001)。植物育種在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，目的是提供包含雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT特征的在農(nóng)業(yè)上有用的大麥植株。農(nóng)作物發(fā)育常為始于引入新特征的長(zhǎng)期且困難的過(guò)程。然而，從植物育種家的觀點(diǎn)看，這一步驟幾乎總是產(chǎn)生與現(xiàn)在的市場(chǎng)品種相比，農(nóng)業(yè)性狀總體譜圖不甚理想的植株。除了雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT特性之外，在產(chǎn)生用于制麥和/或釀造和/或作為飲料基礎(chǔ)的商業(yè)大麥品種的領(lǐng)域還要考慮其它因素，例如麥粒產(chǎn)量和大小以及與制麥性能或釀造性能相關(guān)的其它參數(shù)。因?yàn)橐呀?jīng)顯示許多(即便不是所有)相關(guān)特性都處于遺傳控制之下，本發(fā)明還提供了現(xiàn)代的純合且高產(chǎn)量的制麥栽培品種，其可以通過(guò)與本申請(qǐng)公開(kāi)的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株雜交而制備。專業(yè)大麥育種者將能夠選出并培育大麥植株，該大麥植株在與雙無(wú)效LOX大麥-無(wú)效 MMT大麥雜交后將產(chǎn)生更好的栽培品種。或者，大麥育種者可以利用本發(fā)明植株用于進(jìn)一步的誘變，以產(chǎn)生源自雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥的新栽培品種。確保在子代中維持雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT特征的一個(gè)方法涉及L0X-1基因、L0X-2基因和MMT基因的SNP分析。優(yōu)選地，還對(duì)L0X-1、L0X-2和MMT活性進(jìn)行測(cè)定?？梢詫⒈景l(fā)明的大麥植株引入到任何合適的育種方案中。本發(fā)明的另一目的是提供包含雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT特征的在農(nóng)藝上優(yōu)良的大麥植株。因此，本發(fā)明還涉及通過(guò)使第一親本大麥植株與第二親本大麥植株雜交而產(chǎn)生新的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株的方法，其中所述第一植株或第二植株是雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥。此外，第一親本大麥植株和第二親本大麥植株均可來(lái)自雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥品種。因此，利用雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥品種的任何此類方法都是本發(fā)明的一部分:自花授粉、回交和群體雜交等。利用雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥品種作為親本產(chǎn)生的所有植株都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括由衍生自雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥品種的品種形成的那些植株。在將外源DNA引入至雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT植株或植株組織并在其中表達(dá)的情況下，雙無(wú)效LOX無(wú)-效MMT大麥還可以用于遺傳轉(zhuǎn)化。本發(fā)明可以使用回交方法以將突變大麥植株的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT特征引入至另一個(gè)栽培品種中，例如都是當(dāng)代高產(chǎn)麥芽的大麥栽培品種的cv.Scarlett或cv.Jersey或cv.Quench或cv.Rosalina中。在標(biāo)準(zhǔn)的回交操作中，將原始目標(biāo)品種(即輪回親本植株)與攜帶有待轉(zhuǎn)移的目標(biāo)突變LOX基因的第二品種(非輪回親本植株)雜交。隨后，將這次雜交產(chǎn)生的雙無(wú)效LOX子代植株與輪回親本植株雜交，重復(fù)這一過(guò)程直至獲得這樣的大麥植株，即其中除了非輪回親本植株的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT特征外，輪回親本特有的幾乎所有特征也都被恢復(fù)在所產(chǎn)生的植物中。最后，將最后產(chǎn)生的回交植株自交以產(chǎn)生純的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT育種子代植株。加快植物育種過(guò)程的方法包括通過(guò)應(yīng)用組織培養(yǎng)和再生技術(shù)對(duì)所產(chǎn)生的突變體進(jìn)行初始增殖。因此，本發(fā)明另一個(gè)方面是提供生長(zhǎng)和分化后產(chǎn)生具有雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT特征的大麥植株的細(xì)胞。例如，育種可以包括傳統(tǒng)雜交、制備源自可育花藥的植物或利用小孢子培養(yǎng)。LOX通路產(chǎn)物 在多種實(shí)施方案中，本發(fā)明均涉及包含低水平的T2N和T2N潛能的大麥植株和其產(chǎn)品。LOX酶催化帶有順式-1，順式-4戊二烯系統(tǒng)的多不飽和脂肪酸的二加氧作用。在大麥中，C18多不飽和脂肪酸亞油酸(18:2Δ9’12)和α -亞麻酸(18:3Δ9’12’15)是主要的LOX底物。通過(guò)在酰基鏈的C-9位(多由L0X-1催化)或C-13位(多由L0X-2催化)加入分子氧而啟動(dòng)脂肪酸代謝的脂肪氧化酶通路，產(chǎn)生相應(yīng)的9-HP0DE和13-HP0DE[當(dāng)?shù)孜餅棣?-亞麻酸時(shí)產(chǎn)物是9-氫過(guò)氧化十八碳三烯酸和13-氫過(guò)氧化十八碳三烯酸(HPOTE)，但HPOTE不發(fā)揮Τ2Ν前體的功能]。在LOX通路的氫過(guò)氧化物裂解酶支路中，9-HP0DE和13-HP0DE均可以被裂解成短鏈含氧酸和醛(參見(jiàn)圖1Α)。特別地，9-HP0DE可以被裂解成被轉(zhuǎn)化成Τ2Ν的順-壬烯醒，而13-HP0DE是2-Ε-己烯醛的前體。因此，預(yù)期作為L(zhǎng)0X-2催化的亞油酸的雙加氧作用的主要產(chǎn)物的13-HP0DE不是導(dǎo)致形成陳化味Τ2Ν的通路的上游成分。認(rèn)為本發(fā)明涵蓋了影響L0X-1和L0X-2催化作用的下游代謝物的產(chǎn)生，其不作為L(zhǎng)0X-1或L0X-2催化反應(yīng)的直接產(chǎn)物而產(chǎn)生，但是隨后的系列反應(yīng)的結(jié)果。這些反應(yīng)包括自然發(fā)生的、因素誘導(dǎo)的或者酶催化的異構(gòu)化和轉(zhuǎn)化。因此，可能通過(guò)調(diào)節(jié)該通路中其它成分(例如氫過(guò)氧化物裂解酶HPL)的表達(dá)而影響這些下游代謝物的產(chǎn)生。Τ2Ν和DMS及其前體本發(fā)明涉及用于制備具有低水平的一種或多種異味物及其前體的飲料的方法。優(yōu)選地，所述異味物是Τ2Ν和DMS，并且其所述前體分別是Τ2Ν潛能和DMSP。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是降低或消除Τ2Ν潛能。因此，本發(fā)明的目的是減少Τ2Ν前體和醛加合物的形成。雖然與啤酒老化(陳化)有關(guān)的數(shù)個(gè)化學(xué)反應(yīng)仍不清楚，但由Τ2Ν潛能產(chǎn)生游離Τ2Ν被認(rèn)為是啤酒產(chǎn)品中形成陳化風(fēng)味的主要原因(KuiOda等人，見(jiàn)上文)。因此，本發(fā)明的目的是提供具有低水平的Τ2Ν潛能的飲料和具有低水平的Τ2Ν前體的飲料。多數(shù)T2N潛能從麥芽汁轉(zhuǎn)移至成品啤酒，在成品啤酒中可以釋放出游離T2N(Li6ge0is等人，2002)，并且酸度和溫度都是該過(guò)程中的重要因素。根據(jù)本發(fā)明，T2N潛能的定義如上文在定義部分中的描述。也可以使用其它測(cè)定T2N潛能的水平的方法。為了避免混淆，在本申請(qǐng)中“T2N潛能”的含義如上文在定義部分中的描述。具有釋放T2N或者轉(zhuǎn)化成T2N的能力的化學(xué)物質(zhì)在本文中都被稱為“T2N前體”，并且通過(guò)除測(cè)定T2N潛能的方法外的其它方法確定或測(cè)定的T2N前體被稱為“T2N前體”。特別可以通過(guò)首先處理樣品從而使具有釋放T2N或轉(zhuǎn)化成T2N能力的基本上所有(優(yōu)選所有)或其化學(xué)物質(zhì)都實(shí)際上確實(shí)分別釋放T2N和/或轉(zhuǎn)化成T2N。此后，測(cè)定T2N的水平。本發(fā)明的大麥粒除了不含MMT活性外，還不含L0X-1和L0X-2活性。有趣的是，這種大麥粒包含非常少的T2N潛能。因此，利用雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥粒產(chǎn)生的啤酒將不僅具有非常低水平的T2N，還具有非常低水平的T2N潛能。雙無(wú)效LOX-無(wú)效MTT大麥粒在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中所述大麥粒產(chǎn)生的啤酒產(chǎn)品包含非常低水平的T2N潛能，優(yōu)選為以相同方式由野生型大麥(優(yōu)選cv.Power)生產(chǎn)的類似啤酒產(chǎn)品的T2N潛能的水平的少于60%，更優(yōu)選少于50%。并且，還優(yōu)選源自雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥粒的植物產(chǎn)品具有非常低的T2N前體水平。由雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥粒制備的植物產(chǎn)品在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中所述植物產(chǎn)品包含的T2N前體的水平為以相同方式由野生型大麥(優(yōu)選cv.Power)生產(chǎn)的類似植物產(chǎn)品的T2N前體的水平的少于60%，更優(yōu)選少于50%。應(yīng)注意的是，在小試發(fā)芽原料的樣品中或在來(lái)自小試發(fā)芽原料的產(chǎn)品中測(cè)定的T2N值常高于在來(lái)自較大規(guī)模生產(chǎn)的原材料，例如30-kg規(guī)模的中試發(fā)芽樣品測(cè)定的T2N值。然而，大規(guī)模和小規(guī)模實(shí)驗(yàn)之間，T2N潛能的相對(duì)實(shí)驗(yàn)值通常是相似的。

類似地還應(yīng)注意的是，在小試發(fā)芽原料的樣品中和在來(lái)自小試發(fā)芽原料的產(chǎn)品中測(cè)定的T2N潛能和T2N前體常常高于在來(lái)自較大規(guī)模生產(chǎn)的原材料，例如30-kg規(guī)模的中試發(fā)芽樣品中測(cè)定的T2N潛能和T2N前體。然而，大規(guī)模和小規(guī)模實(shí)驗(yàn)之間，T2N潛能的相對(duì)實(shí)驗(yàn)值通常是相似的。本發(fā)明的另一目的是減少或消除DMS和DMSP，其中DMSP優(yōu)選為SMM?？赏ㄟ^(guò)任何合適的方法測(cè)定植物產(chǎn)品中SMM和DMS的量?？苫景瓷衔摹爸苽潆p無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥植株”部分中所述(在該部分中描述了在大麥樣品中測(cè)定SMM水平)，測(cè)定SMM。因此，可通過(guò)將SMM偶聯(lián)到化合物(如0ΡΑ)上，并例如通過(guò)使用UPLC系統(tǒng)測(cè)定熒光來(lái)測(cè)定SMM。對(duì)于定量測(cè)定，可確定對(duì)應(yīng)于SMM峰的色譜圖面積。對(duì)于更精確的測(cè)定，優(yōu)選使用高分辨率的毛細(xì)管氣相色譜測(cè)定DMS和DMSP (如SMM)兩者的量，后一化合物在激活后以DMS進(jìn)行測(cè)定。麥芽汁或啤酒樣品中的總DMS在本文中定義為游離DMS及其前體形式(稱為DMSP)的數(shù)量總和。使用該定義，麥芽汁或啤酒樣品中DMSP的量可確定為總DMS(在煮沸的樣品，優(yōu)選在堿性條件下煮沸I小時(shí)的樣品中進(jìn)行測(cè)定)和游離DMS(在非煮沸樣品中測(cè)定)之間的差異。實(shí)施例4詳細(xì)描述了測(cè)定總DMS和游離DMS水平的優(yōu)選方法。將DMSP還有SMM的量以DMS的濃度給出，所述DMS可通過(guò)在堿性條件下煮沸I小時(shí)從所述DMSP或所述SMM中釋放。實(shí)施例本文的實(shí)施例例示說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且不應(yīng)認(rèn)為這些實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的限制。除非另有說(shuō)明，否則用于操作核酸和細(xì)菌的基本分子生物學(xué)技術(shù)均按照SambiOOk和Russel (2001)中的描述進(jìn)行。實(shí)施例1在萌芽的大麥胚中篩選低L0X-2活性改良的篩詵材料。根據(jù)Kleinhofs等人(1978)提供的詳述，將從通過(guò)(無(wú)效L0X-1突變體D112X Jer sey) XSebastian雜交產(chǎn)生的無(wú)效L0X-1系Ca211901的大麥植株中收集的麥粒與誘變劑NaN3溫育。大麥無(wú)效L0X-1突變體Dl 12描述于W02005/087934中并于2003年9月11日以PTA-5487的保藏號(hào)保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，地址為美國(guó)弗吉尼亞洲(VA20110)馬納薩斯市大學(xué)街(10801)。選擇該方法的原因是已知其在大麥基因組DNA中誘導(dǎo)點(diǎn)突變，最終導(dǎo)致誘變后的DNA所編碼的蛋白的氨基酸殘基的取代或截短。在本申請(qǐng)的誘變實(shí)驗(yàn)中，選擇使Ml代的突變谷粒在田間土地經(jīng)歷隨后兩代繁殖，最終產(chǎn)生高比例的純合植株用于篩選(參考圖8)。盡管沒(méi)有篩選M2代的谷粒(主要原因是預(yù)期這些谷粒包含有相對(duì)高比例的雜合點(diǎn)突變)，但使用M3代的突變谷粒作為篩選材料，預(yù)期每10，000個(gè)谷粒具有0.9-2.3個(gè)突變(Kleinhofs 等人,上文)。意外地，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與分析成熟胚的提取物(如國(guó)際申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例1所述)相比，萌芽胚的分析產(chǎn)生的試驗(yàn)結(jié)果明顯改進(jìn)。因此，建立高通量篩選方法以測(cè)定包括子葉盤組織在內(nèi)的萌芽胚中的L0X-2活性。從35，125個(gè)大麥穗的成熟麥粒分離出兩個(gè)胚(無(wú)效L0X-1突變體Dl 12的M4代的20，977個(gè)系，和無(wú)效L0X-1系Ca21190系的M3代的14，148個(gè)系)，并轉(zhuǎn)移至96孔儲(chǔ)藏板(ABgene)。在向各個(gè)孔中加入20 μ L水后開(kāi)始胚萌芽,其中用濕的Kimnett薄紙和塑料蓋覆蓋所述孔。將平板在塑料袋中于20°C溫育48小時(shí)。溫育后，提取L0X-2酶；首先向各孔中加入5-mm玻璃珠和200 μ L提取緩沖液(IOOmM乳酸溶液，ρΗ4.5)，然后在麗300實(shí)驗(yàn)室磨(Retsch)中以27sec4的頻率碾磨35秒。隨后，將平板在Allegra6R離心機(jī)(Beckman-Coulter)中在4°C以4，OOOrpm離心10分鐘，以沉淀不溶物質(zhì)?；景凑沼糜诔墒炫咛崛∥锏腖0X-2活性分析(參考國(guó)際申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例1)的描述測(cè)定L0X-2活性，區(qū)別僅在于每個(gè)試驗(yàn)僅使用30 μ L提取物而非40 μ L。潛在突變體的鑒定。如上文所述，分析上述35，125個(gè)大麥系的兩個(gè)谷粒中每個(gè)谷粒的L0X-2活性，目的在于鑒定當(dāng)與L0X-1無(wú)效和野生型谷粒相比時(shí)，所述活性高度降低的谷粒。在Ca211901系的M3代中，共鑒定出7個(gè)潛在原始突變體。在溫室中進(jìn)一步繁殖這些突變體，收獲，并再篩選與非常低的LOX活性相關(guān)的特征。最后，僅Ca211901系的一個(gè)突變體(命名為突變體A689)顯示基本沒(méi)有L0X-2活性。利用LOX活性幾乎完全由L0X-2產(chǎn)生的萌芽胚的提取物進(jìn)行總LOX活性的詳細(xì)測(cè)定(Schmitt和van Mechelen, 1997)。對(duì)于突變體A689的M3谷粒的萌芽胚，由LOX比色試驗(yàn)測(cè)定的總LOX活性為0.163±5.5%A595U/萌芽胚，而對(duì)于無(wú)效L0X-1母本品種Ca211901則為1.224±3.8%A595U/萌芽胚(無(wú)效L0X-1原始突變體D112的相應(yīng)值為1.215±6.0%A595U/萌芽胚)。大麥A689系的種子已于2008年12月4日以“大麥，Hordeum vulgare L.;A689系”的名稱保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，地址為美國(guó)弗吉尼亞洲(VA20110)馬納薩斯市大學(xué)街(10801)專利存放處(American Type Culture Collection(ATCC), Patent Depository,10801UniversityBlvd.，Manassas, VA20110，United States)(保藏號(hào)為 PTA-9640)。突變體A689中的HPODE分析描述于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例4中。突變體A689的特征描述于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例5中。大麥突變體A689中L0X-2基因的測(cè)序描述于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例10中，并且其中表7概述了突變體A689的L0X-1和L0X-2基因中的突變。檢測(cè)雙無(wú)效LOX突變體A689的方法描述于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050355的實(shí)施例11中。所述方法為用于檢測(cè)L0X-1中的突變和L0X-2中的突變的基于SNP的方法。實(shí)施例2篩選無(wú)效MMT大麥突變體根據(jù)Kleinhofs 等人(1978)提供的詳細(xì)實(shí)驗(yàn)，將從 cv.Prestige 和 cv.Sebastian的大麥植株中收集的麥粒分別與誘變劑NaN3溫育。選擇該方法的原因是由于已知其在大麥基因組DNA中誘導(dǎo)點(diǎn)突變的潛力。在本實(shí)驗(yàn)中，使Ml代的突變谷粒在田間土地繁殖經(jīng)歷隨后兩代，最后產(chǎn)生高比例的M3代的純合植物用于篩選目。預(yù)期M3代的突變谷粒具有每10，000個(gè)谷粒包含0.9-2.3個(gè)基因突變的頻率(Kleinhofs等人，上文)。應(yīng)注意的是不篩選M2代谷粒。

有趣的是，本發(fā)明描述了用于檢測(cè)喪失MMT活性的M3代突變體大麥谷粒(在制麥過(guò)程中缺乏可檢測(cè)到的SMM合成)的快速高通量篩選方法。因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SMM主要在萌芽大麥的胚芽鞘和初生葉中積累，并且可以通過(guò)從磨碎的4天齡萌芽谷粒的葉組織中提取氨基酸并隨后將所提取的氨基酸與OPA反應(yīng)以產(chǎn)生強(qiáng)熒光產(chǎn)物來(lái)進(jìn)行SMM的檢測(cè)(參考圖2) ο實(shí)際上，通過(guò)將來(lái)自94個(gè)潛在突變體和兩個(gè)野生型植株各自的兩粒谷粒在帶有一張Whatman#l濾紙(296X20.9mm)的密閉塑料盒中萌芽來(lái)進(jìn)行每一試驗(yàn)。對(duì)于多個(gè)潛在的突變谷粒進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)(見(jiàn)下文)。在開(kāi)始萌芽時(shí)，向所述塑料盒中加入25mL自來(lái)水，隨后在萌芽?jī)商鞎r(shí)再加入15mL自來(lái)水。在萌芽4天時(shí)，將l-3cm的葉組織轉(zhuǎn)移到儲(chǔ)藏板(ABgene)中，其中96個(gè)1.2-mL孔的各個(gè)孔均含有5-_直徑的玻璃珠和500 μ L的水:甲醇:氯仿的12:5:6(v/v/v)混合物。隨后將板在MM300實(shí)驗(yàn)室磨(Retsch)中以30Hz的頻率振動(dòng)45秒。隨后，將板轉(zhuǎn)移到離心機(jī)(Rotanta460R，Hettich)中，并在室溫以4，OOOrpm離心15分鐘以沉淀不溶性物質(zhì)。將10 μ L的上清液轉(zhuǎn)移到96孔儲(chǔ)藏板(Waters，目錄號(hào)186002481)中并與 200yL H2O 和 60 μ L 含比例為 15，000:45 (v/v)的 OPA 試劑(Sigma,目錄號(hào)P7914):3_巰基丙酸(Aldrich,目錄號(hào)M5801)混合物的反應(yīng)溶液混合。將該混合物在4° C至少溫育10分鐘以獲得用OPA的定量衍生的樣品氨基酸。使用裝配有熒光檢測(cè)器的基于 Waters 的 UPLC 系統(tǒng)，在 3-μ m 顆粒的 2.1 X 30-mm C18Gemini 柱(Phenomenex,目錄號(hào)00A-4439-80)上使用通過(guò)將流動(dòng)相A (40-mM NaH2PO4緩沖液，調(diào)整pH值至7.8)和流動(dòng)相B[如描述(Phenomenex, 2006)的比例為45:45:10 (v: v: v)的乙腈:甲醇:水溶液]混合的梯度洗脫對(duì)2 μ L的衍生化混合物進(jìn)行分離。洗脫的OPA衍生物的激發(fā)在340nm處，并在450nm處測(cè)定光發(fā)射。色譜圖的實(shí)例顯示于圖2中，其顯示了天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)和SMM的洗脫譜。由于項(xiàng)目總體目的是鑒定出喪失合成SMM能力的大麥植株，即其相應(yīng)的色譜圖峰非常小或優(yōu)選不存在的植株，因此包括后一化合物SMM。分別篩選大麥cv.Prestige 和 cv.Sebastian 的總計(jì) 10，248 粒和 3，858 粒 NaN3 突變的麥粒的SMM含量，目的為鑒定出與野生型谷粒相比所述含量高度降低的麥粒。僅鑒定出M3代的2個(gè)潛在突變體，稱為樣品8，063號(hào)的谷粒(來(lái)自cv.Prestige,并在下文中表示為突變體8063，該命名也用于后代谷粒)，和樣品14，018號(hào)的谷粒(來(lái)自cv.Sebastian,并在下文中表示為突變體14018，該命名也用于后代谷粒)。將各突變體的谷粒繁殖到M4代，隨后收獲，并最終再次分析。結(jié)果證實(shí)了突變體8063和突變體14018的谷粒具有極低的SMM含量，其可能完全缺乏SMM。蛋白印跡分析已證實(shí)，突變體8063和突變體14018缺少M(fèi)MT酶(見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315 的實(shí)施例 3)。MMT活性測(cè)定也已證實(shí)，突變體8063缺乏MMT活性(見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315 的實(shí)施例 4)。按國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例9中所述對(duì)大麥突變體8063中MMT基因進(jìn)行的測(cè)序顯不，在5號(hào)內(nèi)含子的第一個(gè)堿基(SEQ ID NO: 10的第3076位核苷酸,而SEQ ID N0:10則對(duì)應(yīng)于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的SEQ ID NO:8)處具有G — A的堿基轉(zhuǎn)換。按國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例14中所述對(duì)大麥突變體14018中MMT基因的測(cè)序顯示，在2號(hào)內(nèi)含子的第一個(gè)堿基處、2號(hào)外顯子緊下游的剪接供體位點(diǎn)處，更具體為在第1462位核 苷酸處,具有G — A的堿基轉(zhuǎn)換。此外已證實(shí)，突變體8063中MMT mRNA是截短的(見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例11)并且由所述截短的mRNA編碼的突變體MMT蛋白不具有MMT活性(見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例12)。還已經(jīng)證實(shí)，在突變體14018中MMT mRNA是截短的(見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例15)并且由所述截短的mRNA編碼的突變MMT蛋白不具有MMT活性(見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例16)。在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例11中描述了用于檢測(cè)突變體8063的MMT基因中突變的方法，并且在國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/DK2009/050315的實(shí)施例17中描述了用于檢測(cè)突變體14018的MMT基因中突變的方法。實(shí)施例3大麥雜交圖3概述了如何通過(guò)大麥A689系[雙無(wú)效L0X，參考PCT專利申請(qǐng)?zhí)朠CT/DK2009/050355]與 8063 系[無(wú)效MMT，參考 PCT 專利申請(qǐng)?zhí)?PCT/DK2009/050315]的第一次雜交來(lái)培育本發(fā)明的雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT大麥系。使用標(biāo)準(zhǔn)育種技術(shù)培育出雙單倍體系，并在溫室中進(jìn)行了繁殖。在這些株系中，選擇在農(nóng)學(xué)性能方面具有最佳性狀并缺乏L0X-1活性(參考Breddam, K.等人的美國(guó)專利第7，420，105號(hào)中的實(shí)施例2)、缺乏L0X-2活性(參考PCT申請(qǐng)第PCT/DK2009/050355號(hào)中的實(shí)施例2和本文的實(shí)施例1)、以及缺乏SMM和MMT活性(PCT申請(qǐng)第PCT/DK2009/050315號(hào)中的實(shí)施例2和實(shí)施例4，以及本文的實(shí)施例2)的株系進(jìn)行進(jìn)一步的繁殖和分析。本文將這些株系表示為“三無(wú)效”。通常對(duì)于LOX活性的測(cè)定，收獲雙單倍體系的種子并隨后分析各株系和對(duì)照品種的12粒谷粒，測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)差為<5%(圖4) ο實(shí)施例4SMM水平的測(cè)定基本上按PCT申請(qǐng)PCT/DK2009/050315中所述進(jìn)行SMM測(cè)定。首先，從l_3cm長(zhǎng)的部分大麥葉片中提取SMM，即將所述葉片置于1.2-mL孔的微滴定板中，其中各孔均含有5-mm直徑的玻璃珠和500μ L的水:甲醇:氯仿的12:5:6 (ν/ν/ν)混合物。隨后將所述板在ΜΜ300實(shí)驗(yàn)室磨(Retsch)中溫育45秒，電學(xué)調(diào)整至以30Hz的頻率振動(dòng)。離心后，將10 μ L的上清液轉(zhuǎn)移到96孔儲(chǔ)藏板(Waters,目錄號(hào)186002481)中，并與200 μ L水和60 μ L含OPA 試劑(Sigma,目錄號(hào) P7914):3-巰基丙酸(Aldrich,目錄號(hào) M5801)的 15，000:45 (v/v)混合物的反應(yīng)溶液混合。將混合物在4° C溫育至少10分鐘以用OPA定量衍生的樣品氨基酸。使用裝配有熒光計(jì)的UPLC系統(tǒng)(Waters)，在3- μ m顆粒的2.1 X 30-mm C18Gemini柱(Phenomenex,目錄號(hào)00A-4439-80)中，使用含有乙腈:甲醇:水的45:45:10 (v:v:v)溶液且pH值調(diào)至7.8的40-mM磷酸鈉緩沖液作為流動(dòng)相(Phenomenex2006)來(lái)分離2 μ L的衍生混合物。OPA衍生物的激發(fā)在340nm處，且在450nm處測(cè)定光發(fā)射。色譜圖實(shí)例顯示于圖5中，其顯示了來(lái)自野生型和三無(wú)效突變體的天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)和SMM的洗脫譜。觀察到了三無(wú)效突變體明顯缺乏合成SMM的能力。實(shí)施例5農(nóng)學(xué)性能在田間試驗(yàn)中檢測(cè)了商品化大麥CVS.Quench和Power以及無(wú)效LOX-1、無(wú)效MMT、無(wú)效L0X-1-無(wú)效L0X-2 ( 雙無(wú)效L0X)、無(wú)效L0X-1-無(wú)效MMT和三無(wú)效植株，從而對(duì)它們的農(nóng)學(xué)性能進(jìn)行比較。定期獲取株高、抽穗期、抗病性、抗倒伏、成熟時(shí)間和產(chǎn)量的數(shù)據(jù)(見(jiàn)表I)。根據(jù)用于田間試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行試驗(yàn)。因此，將商品化品種和突變體系的等量麥粒播種于兩處7.88-m2的土地中，每一處含3個(gè)重復(fù)。根據(jù)觀察突變體和商品化品種的農(nóng)學(xué)性狀沒(méi)有大的差別。不同突變體系和品種的大麥質(zhì)量分析證明，所有收獲的谷粒均具有優(yōu)良且可接受的制麥和釀造特性。實(shí)施例6小試制麥和小試糖化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用以下六種不同的大麥系和栽培品種進(jìn)行小試制麥和小試糖化實(shí)驗(yàn)(圖6A)，其還顯示了下文描述的實(shí)驗(yàn)流程:⑴三無(wú)效；⑵無(wú)效L0X-1-無(wú)效MMT ； (3)無(wú)效L0X-1-無(wú)效L0X-2 (大麥A689系)；(4)無(wú)效MMT (大麥8063系)；(5)無(wú)效L0X-1 (大麥Dl 12系)；
(6)cv.Power。用來(lái)自上文提及的各株系或栽培品種的三份225-g大麥樣品進(jìn)行小試制麥實(shí)驗(yàn)。如下進(jìn)行浸泡和萌芽:⑴在16 ° C浸泡:潤(rùn)濕3小時(shí)，干燥21小時(shí)，潤(rùn)濕3小時(shí)，干燥21小時(shí)，潤(rùn)濕3小時(shí)，干燥21小時(shí)，最終水含量為45% ；(ii)萌芽:在16。C下萌芽48-72小時(shí)直至>95%的修飾。萌芽后，用不同的干燥方案對(duì)所述三份樣品進(jìn)行干燥(圖6A中稱為烘干):(i)85° C干燥:12.5小時(shí)由開(kāi)始的30° C至55° C的斜坡(ramping)升溫，隨后是7.5小時(shí)至85° C的斜坡升溫，在85° C保持1.5小時(shí)；(ii)75° C干燥:12.5小時(shí)由開(kāi)始的30° C至55° C的斜坡升溫，隨后是7.5小時(shí)至75° C的斜坡升溫，在75° C保持1.5小時(shí)；(iii)40。C 干燥:40° C 保持 48 小時(shí)。在萌芽后立即處理在85° C和40° C干燥的樣品，而將剩余樣品冷凍2天，解凍，并隨后進(jìn)行如上文概述的75° C干燥。通過(guò)將90-g碾磨的麥芽樣品與270mL自來(lái)水混合，隨后在500_mL瓶中進(jìn)行小試糖化。在40° C溫育20分鐘。溫度在25分鐘內(nèi)斜坡升溫至65° C，隨后為在65° C60分鐘時(shí)長(zhǎng)的糖化停止(saccharification pause)。隨后,在78° C、10分鐘時(shí)長(zhǎng)的糖化終止階段前在13分鐘內(nèi)將溫度斜坡升溫至78° C。然后將所獲得的麥芽汁在冰上冷卻，用700mL冰冷的自來(lái)水稀釋,并經(jīng)折疊的MN_616V4濾紙(Macherey-Nagel)過(guò)濾。將400mL麥芽汁轉(zhuǎn)移到500-mL瓶中，蓋緊瓶蓋并在沸水浴中加熱60分鐘。將瓶子額外置于水浴中60分鐘，而不進(jìn)行進(jìn)一步加熱。DMSP水平的數(shù) 據(jù)為了檢測(cè)多種烘干溫度如何影響本發(fā)明的野生型和突變體麥芽中的DMSP含量，谷粒首先進(jìn)行小試制麥并隨后以等分試樣分開(kāi)，然后在40° C、75° C和85° C三個(gè)不同溫度下烘干。含野生型MMT基因的大麥株系的谷粒特征在于，最終的麥芽中含高水平DMSP。然而，在更高溫度下烘干后檢測(cè)到水平降低(表2)。相比之下，在所有無(wú)效MMT基因型的麥芽中均檢測(cè)到明顯低水平的DMSP。還測(cè)定了由上文提及的麥芽產(chǎn)生的麥芽汁中的DMSP水平，給出的DMSP水平對(duì)應(yīng)于在麥芽中測(cè)定的水平。該發(fā)現(xiàn)與Dickenson和Anderson (1981)之前的結(jié)果一致,顯示了麥芽和麥芽汁的DMSP含量之間的緊密關(guān)聯(lián)。對(duì)于所有無(wú)效MMT基因型，在相應(yīng)的麥芽汁中均檢測(cè)到明顯低的DMSP水平，這與制備麥芽所用的烘干溫度無(wú)關(guān)。T2N前體和游離T2N水平的數(shù)據(jù)為了檢測(cè)多種烘干溫度如何影響游離T2N和T2N前體的水平，按照上文描述測(cè)定經(jīng)小試制麥和小試糖化產(chǎn)生的甜麥芽汁和冷麥芽汁中所述化合物的濃度。結(jié)果顯不于表3中。對(duì)于野生型麥芽的麥芽汁，烘干溫度對(duì)T2N和T2N前體的濃度具有顯著影響。當(dāng)使用野生型麥芽時(shí)，高烘干溫度對(duì)于避免T2N前體的大量產(chǎn)生是完全必要的。烘干溫度對(duì)于無(wú)效L0X-1-無(wú)效MMT麥芽中T2N及其加合物的產(chǎn)生具有較小的影響。還值得注意的是對(duì)于三無(wú)效麥芽的麥芽汁，游離T2N及其前體的濃度在所有樣品中均很低，而與烘干溫度無(wú)關(guān)。實(shí)施例7
利用未發(fā)芽大麥的小試糖化通過(guò)將90-g碾磨的大麥樣品與270mL自來(lái)水以及0.12g大麥釀造酶混合物OndeaPro (Novozymes)混合，隨后在500_mL瓶中54° C溫育30分鐘，實(shí)現(xiàn)cv.Power和三無(wú)效的未發(fā)芽大麥的小試糖化。在10分鐘內(nèi)將溫度斜坡升溫至64° C，隨后為在64° C45分鐘時(shí)長(zhǎng)的糖化停止。然后14分鐘內(nèi)將溫度斜坡升溫至78。C，之后為在所述溫度10分鐘時(shí)長(zhǎng)的糖化終止(marshing-off)階段。隨后的冷卻、稀釋、過(guò)濾和加熱步驟均按照對(duì)小試發(fā)芽糖化的描述進(jìn)行(見(jiàn)實(shí)施例4)。測(cè)定由cv.Power和三無(wú)效的大麥粉生產(chǎn)的麥芽汁中的DMSP水平(表4)。顯然，由三無(wú)效大麥生產(chǎn)的麥芽汁中的DMSP含量要顯著低于野生型cv.Power中的含量。由于認(rèn)為大麥不含有 DMSP (Yang, B.等人:Factors involved in the formation of two precursorsof dimethyl sulphide during malting, J.Am.Soc.Brew.Chem.56:85-92，1998)，因此這是一個(gè)令人驚喜的發(fā)現(xiàn)。如PCT專利申請(qǐng)第PCT/DK2009/050355號(hào)(參考所述申請(qǐng)中的圖12和實(shí)施例9)中所示，在來(lái)自雙無(wú)效LOX的樣品的煮沸的大麥釀造麥芽汁和煮沸的正常麥芽汁的T2N前體水平明顯較低。因此，預(yù)期三無(wú)效大麥的麥芽汁具有類似性質(zhì)，使得三無(wú)效大麥成為用于具有低的或完全不含T2N和DMS異味物的大麥釀造飲料的高品質(zhì)原材料。實(shí)施例8中試規(guī)模的制麥和釀造
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用三無(wú)效和cv.Quench (對(duì)照麥芽)麥芽的制麥和釀造分析包括以下步驟:(i)制麥；Qi)制備麥芽汁；(iii)分離麥芽汁；(iv)煮沸麥芽汁；(v)用卡爾酵母發(fā)酵麥芽汁；(vi)貯藏啤酒；(vii)過(guò)濾清啤酒和(viii)啤酒裝瓶(參考圖6B、C)。用三無(wú)效和cv.Quench的麥粒以20_kg重的規(guī)模進(jìn)行制麥實(shí)驗(yàn),在制麥廠中如下進(jìn)行:⑴16°C浸泡:潤(rùn)濕I小時(shí)，干燥I小時(shí)，潤(rùn)濕I小時(shí)，干燥I小時(shí)，潤(rùn)濕I小時(shí)，最
終水含量為45% ；(ii)發(fā)芽120小時(shí)，開(kāi)始16° C并斜坡降溫至14° C ；(iii)干燥14小時(shí)，開(kāi)始65° C并斜坡升溫至85° C ;在85° C保持3小時(shí)。對(duì)于三無(wú)效和cv.Quench(后者用作參照)的糖化,使用25kg麥芽樣品。將各麥芽樣品碾磨后，加入自來(lái)水至體積為146-L。在40°C進(jìn)行20分鐘起始糖化(mashing-1n),然后為25分鐘的從40°C至65°C的斜坡升溫。65°C的糖化停止為60分鐘，然后為在13分鐘的加熱階段加熱至78°C，以及10分鐘的78°C糖化終止。將野生型cv.Quench的一份麥芽汁樣品和三無(wú)效的一份樣品分別在101° C煮60分鐘(導(dǎo)致6.7%的蒸發(fā))，而剩余兩份麥芽汁樣品在98° C加熱60分鐘(導(dǎo)致3.9%的蒸發(fā))。如上文提及的其余釀造步驟(即過(guò)濾、渦旋分離、發(fā)酵、貯藏和包裝在綠色玻璃瓶中)均按照標(biāo)準(zhǔn)釀造實(shí)踐的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行?；旧先鏗ysert等人(1980)所述,使用靜態(tài)頂空氣相色譜法在350B硫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(Sievers)上用硫特異檢測(cè)來(lái)測(cè)定DMSP和DMS水平。使用HS-40自動(dòng)設(shè)備(PerkinElmer)進(jìn)行頂空取樣。
通過(guò)將各個(gè)樣品在堿性條件下煮沸I小時(shí)，獲得綠色烘干麥芽的麥芽汁和提取物中的總DMS水平，即游離DMS和DMSP的之和。隨后將煮沸和未煮沸的樣品進(jìn)行頂空分析，以測(cè)定DMS水平。將總DMS(在煮沸樣品中測(cè)定的)和游離DMS(在未煮沸樣品中測(cè)定的)間的差異定義為等于樣品中存在的DMSP量。啤酒中游離DMS的量測(cè)定為基本與麥芽汁中的測(cè)定相同(Hysert等人,上文)。耒芽汁樣品中DMSP/DMS和T2N前體/游離T2N水平的數(shù)據(jù)使用現(xiàn)代釀造設(shè)備，通常需要蒸發(fā)6-10%的麥芽汁來(lái)在相應(yīng)的成品啤酒中獲得令人滿意的DMS水平，S卩[DMS]〈50ppb，這是人對(duì)異味的味覺(jué)閾值水平。根據(jù)這些事實(shí)，按上文描述來(lái)設(shè)計(jì)中試釀造試驗(yàn)。目的是檢測(cè)降低能量輸入(例如在加壓溫育過(guò)程中不煮沸)對(duì)麥芽汁和最終的啤酒中DMS水平的影響。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括與標(biāo)準(zhǔn)條件下的麥芽汁煮沸的比較。在cv.Quench麥芽汁的加熱過(guò)程中測(cè)到了高水平的DMSP和游離DMS，并在加壓麥芽汁中觀察到游離DMS水平隨時(shí)間增高。相比之下，煮沸并蒸發(fā)的麥芽汁在煮沸結(jié)束時(shí)僅積累了很少量的DMS，而之后游離DMS再度積累。與上文描述的小試糖化的結(jié)果一致，中試規(guī)模的三無(wú)效麥芽的麥芽汁的特征是，與衍生自cv.Quench的類似樣品相比，其具有極低水平的DMSP和游離DMS (參考表5)。應(yīng)注意的是，即使在麥芽汁中，三無(wú)效麥芽的所述DMS水平仍顯著低于50-ppb的味覺(jué)閾值水平。基本上如Gronqvist等人(1993)所述,用O- (2, 3, 4, 5, 6_五氟節(jié)基)輕胺對(duì)羰基衍生化后，通過(guò)GC-MS測(cè)定來(lái)自野生型麥芽cv.Quench和三無(wú)效麥芽的麥芽汁和啤酒中T2N前體和游離T2N的濃度。在cv.Quench麥芽汁的加熱過(guò)程中測(cè)到了高濃度的T2N前體，并發(fā)現(xiàn)在煮沸/加熱處理開(kāi)始時(shí)的值最大(表6)。對(duì)于由三無(wú)效麥芽制成的麥芽汁，發(fā)現(xiàn)T2N前體的食品顯著較低(大約為使用野 生型原材料時(shí)水平的40%)，并且在煮沸/加熱處理開(kāi)始時(shí)的值最大。低能加熱方案(即采用加壓熱處理)對(duì)兩種麥芽類型的T2N前體水平僅具有較小的影響。在所有的麥芽汁樣品中，均檢測(cè)到了低水平的游離T2N。應(yīng)注意的是，即使在麥芽汁加熱過(guò)程中采用了低能量輸入，無(wú)效LOXl和無(wú)效L0X-2突變的有益作用仍是明顯可見(jiàn)的。啤酒樣品中DMS和T2N前體/游離T2N的水平的數(shù)據(jù)測(cè)定了使用上文描述的兩種不同的煮沸/加熱方案由三無(wú)效麥芽以及野生型麥芽cv.Quench制成的新鮮啤酒中的DMS濃度。結(jié)果總結(jié)于表7中。使用標(biāo)準(zhǔn)煮沸方案由cv.Quench的野生型麥芽生產(chǎn)的啤酒含有65ppbDMS，即略高于50-ppb的味覺(jué)閾值。使用上文描述的節(jié)能方法(如“在加壓溫育過(guò)程中不煮沸”)和野生型麥芽導(dǎo)致最終的啤酒中的DMS濃度非常高(151ppb)。相比之下，無(wú)論用何種加熱方法，由三無(wú)效麥芽生產(chǎn)的啤酒均含非常低水平的DMS。無(wú)論用何種麥芽汁制備方法，由三無(wú)效麥芽生產(chǎn)的啤酒的T2N前體含量遠(yuǎn)小于無(wú)論使用何種煮沸方法由野生型麥芽cv.Quench生產(chǎn)的啤酒的T2N前體含量(總計(jì)下降56%至 58%)(表 7)。在所檢測(cè)的四份新鮮啤酒(即，使用cv.Quench或三無(wú)效的麥芽并結(jié)合允許蒸發(fā)或加壓的麥芽汁制備物)中，新鮮啤酒中的游離T2N水平均低，但在37° C強(qiáng)制陳化2周后，觀察到了顯著區(qū)別。盡管由采用標(biāo)準(zhǔn)煮沸或加壓加熱制備的野生型麥芽制成的啤酒分別含0.041ppb和0.061ppb的T2N，但由三無(wú)效麥芽生產(chǎn)的啤酒的相應(yīng)值卻更低，即分別下降至95%和64% (表7)。啤酒泡沫的數(shù)據(jù)比較了在cv.Quench (參考圖6B)和三無(wú)效(參考圖6C)麥芽的麥芽汁加熱過(guò)程中進(jìn)行蒸發(fā)或加壓生產(chǎn)的中試釀造啤酒。啤酒取自取樣點(diǎn)9(參考圖6B、C)，在超聲浴中脫氣20分鐘，然后加入50mL H2O至150mL啤酒中。將混合物緩慢倒入由16_cm長(zhǎng)、7_cm寬的玻璃管(在底部和頂部分別有玻璃濾器和接頭)組成的發(fā)泡塔中。將隊(duì)氣以400mL/分鐘的流速?gòu)牡撞堪l(fā)泡通過(guò)所述混合物以產(chǎn)生啤酒泡沫。將其引導(dǎo)通過(guò)管，并收集到位于秤(weight)上的分級(jí)沉淀杯中。以5分鐘間隔記錄四種啤酒各自的總泡沫重量直至發(fā)泡終止(圖7)。無(wú)論蒸發(fā)或加壓方法，泡沫水平都是相似的。然而，在用三無(wú)效麥芽作為原材料的啤酒中，發(fā)泡得到顯
著改善。啤酒味道專家品嘗小組對(duì)所生產(chǎn)的四種啤酒(即，使用cv.Quench或三無(wú)效的麥芽并結(jié)合允許蒸發(fā)或加壓的麥芽汁制備物)，以新鮮生產(chǎn)的啤酒和在37° C強(qiáng)制陳化I周和2周后的啤酒分別進(jìn)行了評(píng)價(jià)(表8)。無(wú)論用何種煮沸方法，由三無(wú)效麥芽生產(chǎn)的新鮮啤酒均獲得了最高的總風(fēng)味分值。相比之下，使用標(biāo)準(zhǔn)煮沸方案由野生型麥芽生產(chǎn)的啤酒獲得的總風(fēng)味分值略低；被認(rèn)為是“輕度DMS”。應(yīng)用加壓加熱技術(shù)導(dǎo)致啤酒具有非常低的總風(fēng)味分值，并被認(rèn)為是“重度DMS ”。在37° C強(qiáng)制陳化I周或2周后，由三無(wú)效麥芽生產(chǎn)的啤酒獲得的總陳化分值顯著低于由野生型麥芽生產(chǎn)的啤酒，尤其是由于源自較低濃度的陳化組分T2N的“紙樣”性質(zhì)的分值降低。實(shí)施例9中試規(guī)模的制麥和釀造實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用三無(wú)效(雙無(wú)效LOX-無(wú)效MMT)和cv.Rosalina (野生型參照)的麥芽的制麥和釀造分析包括以下步驟:(i)制麥；(ii)制備麥芽汁；(iii)分離麥芽汁；(iv)煮沸麥芽汁；(V)用卡爾酵母發(fā)酵麥芽汁；(vi)貯藏啤酒；(vii)過(guò)濾清啤酒；和(viii)啤酒裝瓶。用三無(wú)效和cv.Rosalina的麥粒以21_kg重的規(guī)模進(jìn)行制麥實(shí)驗(yàn),在制麥廠如下進(jìn)行:(i) 16°C浸泡:潤(rùn)濕I小時(shí),干燥I小時(shí),潤(rùn)濕I小時(shí)，干燥I小時(shí)，潤(rùn)濕I小時(shí)，滴水36小時(shí)至最終水含量為45% ；(ii)萌芽120小時(shí)，開(kāi)始16° C斜坡將溫至14° C ；(iii)在中試烘干機(jī)中用常溫程序或低溫程序進(jìn)行萌芽麥粒的干燥/烘干；

(iv)正常干燥/烘干程序，開(kāi)始于45° C，在14小時(shí)內(nèi)斜坡升溫至85° C，然后在85° C溫育2小時(shí)；
(V)低溫干燥/烘干程序，開(kāi)始于45° C，在12小時(shí)內(nèi)斜坡升溫至75° C，然后在75° C溫育2小時(shí)。對(duì)于三無(wú)效和cv.Rosalina兩者的糖化，均使用34kg麥芽樣品。將各麥芽樣品碾磨后,加入自來(lái)水至體積為180-L。在60°C進(jìn)行20分鐘糖化起始,然后是5分鐘從60°C至65°C的斜坡升溫。65°C的糖化停止為60分鐘，然后為13分鐘的加熱階段加熱至78°C，和10分鐘在78 °C的糖化終止。將野生型cv.Rosalina和三無(wú)效樣品的麥芽汁樣品分別在開(kāi)口容器中100° C煮沸60分鐘(導(dǎo)致4.5%的蒸發(fā))，或在密閉容器中加熱至99.5° C并在99.5° C保持60分鐘(導(dǎo)致0%的蒸發(fā))。用栽培品種、烘干條件和煮沸條件的不同組合，制成六種不同的麥芽汁(見(jiàn)表9).
如上文提及的其余釀造步驟(即渦旋分離、發(fā)酵、貯藏、過(guò)濾和包裝在綠色玻璃瓶中)均按照標(biāo)準(zhǔn)釀造實(shí)踐的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。按上文實(shí)施例8中的描述測(cè)定DMSP和DMS水平。耒芽樣品中DMSP/DMS水平的數(shù)據(jù)在現(xiàn)代制麥廠里，為了獲得可從中得到具有令人滿意的DMS水平的麥芽汁的麥芽，麥粒干燥通常需要在85° C的固化溫度保持至少2個(gè)小時(shí)以將麥芽中的DMSP降至低水平(即低于4.5mg/kg的麥芽)(見(jiàn)下文)。根據(jù)這些事實(shí)，按上文描述設(shè)計(jì)中試制麥試驗(yàn)。目的是檢測(cè)低能量輸入(例如低溫干燥)對(duì)麥芽、麥芽汁和最終的啤酒中DMS和DMSP水平的影響。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括與根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件干燥的谷粒的比較。在使用85° C標(biāo)準(zhǔn)干燥由cv.Rosalina制成的麥芽中，測(cè)定DMSP為4.7mg/kg麥芽。在使用75° C干燥由cv.Rosalina制成的麥芽中，測(cè)定DMSP為16.2mg/kg(表10)。在由三無(wú)效的谷粒制成的麥芽中，無(wú)論干燥溫度多少，均獲得了實(shí)際低于檢測(cè)限的極低的DMSP水平。耒芽汁樣品中DMSP/DMS水平的數(shù)據(jù)使用現(xiàn)代釀造技術(shù)，為了在相應(yīng)的成品啤酒中獲得令人滿意的DMS水平，優(yōu)選為[DMS]〈50ppb，通常需要具有4.5-10%的麥芽汁蒸發(fā)量的至少一小時(shí)的煮沸。根據(jù)這些事實(shí)，按上文描述設(shè)計(jì)釀造試驗(yàn)。目的是檢測(cè)低能量輸入(例如低溫麥粒干燥或在密閉容器中的無(wú)蒸發(fā)熱處理)對(duì)麥芽汁和最終的啤酒中DMS水平的影響。因此，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括與標(biāo)準(zhǔn)條件的谷粒干燥和麥芽汁煮沸的比較。在用正常干燥制成的cv.Rosalina麥芽汁的加熱過(guò)程中，測(cè)到了高水平的DMSP和游離DMSP。在密閉容器中觀察到游離DMS水平隨時(shí)間上升。相比之下，煮沸并蒸發(fā)的麥芽汁在煮沸結(jié)束時(shí)僅積累了很少量的DMS，隨后游離DMS再度積累(表11)。使用cv.Rosalina低溫干燥，DMSP和DMS水平比用正常干燥高得多。在用cv.Rosalina制成的所有三種麥芽汁中，最終的麥芽汁均具有高于50-ppb的DMS水平。與上文描述的其它結(jié)果一致，三無(wú)效麥芽的麥芽汁的特征在于與衍生自cv.Rosalina的類似樣品相比，其具有極低水平的DMSP和游離DMS。應(yīng)注意的是，無(wú)論使用何種烘干和煮沸方案，即使在麥芽汁中，三無(wú)效麥芽的所述DMS水平均仍顯著低于50-ppb。麥芽汁樣品中T2N前體/游離T2N水平的數(shù)據(jù)
基本上按Gronqvist等人(1993)所述，用O-(2，3，4，5，6_五氟芐基)羥胺對(duì)羰基衍生化后，通過(guò)GC-MS測(cè)定來(lái)自野生型麥芽cv.Rosalina和三無(wú)效麥芽的麥芽汁和啤酒中T2N前體和游離T2N的濃度。在cv.Rosalina的麥芽汁中測(cè)到了高濃度的T2N前體(表12)。發(fā)現(xiàn)由三無(wú)效麥芽制成的麥芽汁中的T2N前體水平尤其較低，為當(dāng)使用野生型原材料時(shí)水平的 40%。低能加熱方案(即低溫烘干或在密閉容器中麥芽汁的無(wú)蒸發(fā)熱處理)對(duì)于兩種麥芽類型的T2N前體水平僅具有很小的影響。在所有的麥芽汁樣品中，均檢測(cè)到低水平的游離T2N。應(yīng)注意的是，即使使用低能量輸入，無(wú)效LOXl和無(wú)效L0X-2突變的有益作用仍是明顯可見(jiàn)的。啤酒樣品中DMS和T2N前體/游離T2N水平的數(shù)據(jù)使用上文描述的兩種不同的麥粒干燥和煮沸/加熱方案，測(cè)定了由三無(wú)效麥芽以及cv.Rosali na的野生型麥芽制成的新鮮啤酒中的DMS濃度。結(jié)果總結(jié)于表13中。由使用標(biāo)準(zhǔn)干燥條件產(chǎn)生的cv.Rosalina的野生型麥芽通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)煮沸方案生產(chǎn)的啤酒含有117ppb DMS，即高于50-ppb。使用上文描述的節(jié)能方法(如“在密閉容器中無(wú)蒸發(fā)”)及野生型麥芽產(chǎn)生174ppb DMS，即最終的啤酒中具有非常高濃度的異味物。相比之下，無(wú)論使用何種煮沸和烘干方法，由三無(wú)效麥芽生產(chǎn)的啤酒均含非常低水平的DMS。在所檢測(cè)的啤酒(S卩，使用cv.Rosalina或三無(wú)效的麥芽并結(jié)合允許蒸發(fā)的煮沸或在密閉容器中無(wú)蒸發(fā)的熱處理)中，新鮮啤酒中的游離T2N水平均低，但在37° C強(qiáng)制陳化2周后，觀察到了顯著區(qū)別。盡管通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)煮沸和在密閉容器中的無(wú)蒸發(fā)熱處理生產(chǎn)的野生型麥芽制成的啤酒分別含0.055ppb和0.035ppb T2N，但由三無(wú)效麥芽生產(chǎn)的啤酒的相應(yīng)值卻明顯更低，即分別下降67%和51%(參考表13)。啤酒味道專家品嘗小組對(duì)所生產(chǎn)的6種啤酒(S卩，使用cv.Rosalina或三無(wú)效的麥芽并結(jié)合允許蒸發(fā)的煮沸或在密閉容器中的無(wú)蒸發(fā)的熱處理或標(biāo)準(zhǔn)或低溫干燥)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，均以新鮮生產(chǎn)的啤酒和在37° C強(qiáng)制陳化2周后的啤酒而進(jìn)行(表14)。無(wú)論使用何種烘干和煮沸方法，由三無(wú)效麥芽生產(chǎn)的新鮮啤酒獲得的總風(fēng)味分值均最高。相比之下，使用標(biāo)準(zhǔn)煮沸方案由85° C烘干的野生型麥芽生產(chǎn)的啤酒獲得的總風(fēng)味分值低得多；這被認(rèn)為是“顯著DMS”。將在密閉容器里的無(wú)蒸發(fā)熱處理應(yīng)用于麥芽汁制備物，產(chǎn)生總風(fēng)味分值甚至更低的啤酒，其被認(rèn)為是“重度DMS”.
在37° C強(qiáng)制陳化2周后，由85° C烘干的三無(wú)效麥芽經(jīng)正常煮沸生產(chǎn)的啤酒獲得的總陳化分值顯著低于由野生型麥芽生產(chǎn)的相應(yīng)啤酒的總陳化分值，原因尤其是源自較低濃度的陳化組分T2N的“紙樣”性質(zhì)的低分值。對(duì)于由野生型麥芽生產(chǎn)的啤酒，評(píng)估老化特征并非真正可行，主要原因是顯著至重度的DMS異味。實(shí)施例10比較大麥釀造啤酒和普通啤酒-THA幾十年前早已描述了來(lái)自亞油酸的啤酒特異性THA(Drost等人，1974)。此后，多個(gè)報(bào)告均已證實(shí)啤酒中THA的總量為 5-12ppm(Hamberg，1991;及其中的參考文獻(xiàn))。盡管9，12，13-THA通常構(gòu)成了啤酒中75-85%的THA (9，10, 13-THA的量占15-25%)，但也發(fā)現(xiàn)了痕量的其它異構(gòu)體。在由三無(wú)效大麥麥芽制備的麥芽汁生產(chǎn)的啤酒中(參考實(shí)施例9)，9，12，13-THA的濃度與由cv.Rosalina麥芽制成的對(duì)照啤酒相比降低了 80_87% (表15)。觀察到9，10, 13-THA異構(gòu)體具有65-72%的降低。使用標(biāo)準(zhǔn)HPLC質(zhì)譜分析進(jìn)行這些測(cè)定(Hamberg，上文)。實(shí)施例11啤酒中源自原材料的DNA的擴(kuò)增盡管PCR方法可用于確定麥芽粉混合物中物種特異性DNA序列的存在與否，但啤酒樣品的認(rèn)定存在更多挑戰(zhàn)。在啤酒生產(chǎn)中，原材料來(lái)源的核酸酶、高溫和過(guò)濾的組合效應(yīng)使得啤酒產(chǎn)品僅含有非常低水平的完整DNA，用于擴(kuò)增植物基因片段。在此，描述了結(jié)合了DNA提取和擴(kuò)增的有效的新方法，其產(chǎn)生了用于可視化的足量DNA。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出用于啤酒樣品的原材料認(rèn)定的新的四步法。所述方法以連續(xù)方式利用三種生物分子試劑盒的試劑和方案，最終形成用于可視化的DNA片段的擴(kuò)增:(i)通過(guò)與磁珠結(jié)合從啤酒中提取DNA[按照DNA提取試劑盒(Tepnel BiosystemsLtd.,目錄號(hào)901040N)的說(shuō)明書(shū)中針對(duì)液體樣品的說(shuō)明的建議];(i i)通過(guò)等溫鏈置換擴(kuò)增DNA (I I lustra GenomiPhi V2DNA擴(kuò)增試劑盒，GEHealthcare,目錄號(hào) 25-6600-30) ; (iii)使用 REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix (Sigma,目錄號(hào)XNAP-1KT)用引物進(jìn)行PCR，以檢測(cè)特異性DNA突變；(iV)瓊脂糖凝膠 電泳，以分離擴(kuò)增產(chǎn)物，隨后用溴化乙錠染色使其可視化。上文步驟(i)涉及從以下樣品的400-μ L等分試樣中純化DNA:(a)使用野生型麥芽:大麥的75%: 25%混合物的面粉(Carlsberg Breweries A/S;商標(biāo)注冊(cè) 26.11.11704)生產(chǎn)的 TuborgGr0HPilsner;(b)使用含50%無(wú)效L0X-1麥芽的混合物(Carlsberg試驗(yàn)標(biāo)識(shí)號(hào)2C10084)以中試規(guī)模生產(chǎn)的啤酒；(c)使用由三無(wú)效大麥生產(chǎn)的麥芽以中試規(guī)模釀造的非煮沸麥芽汁(Carlsberg試驗(yàn)標(biāo)識(shí)號(hào)2C11001);(d)使用三無(wú)效麥芽以中試規(guī)模釀造的煮沸麥芽汁(CarI sberg試驗(yàn)標(biāo)識(shí)號(hào)2C11001)，即由上文(C)中的描述而加工的麥芽汁。將從每一種上文提及的樣品(a)、(b)、(c)和(d)中純化的DNA最終重懸于50 μ L的 ρΗ7.4 的 10-mM Tris-EDTA 緩沖液中。在上文的步驟(ii)中，將1-UL按(i)中詳述純化的麥芽汁來(lái)源或啤酒來(lái)源的DNA的樣品等分試樣進(jìn)行擴(kuò)增。將DNA在含非特異結(jié)合DNA的隨機(jī)六聚物的樣品緩沖液中短暫熱變性并隨后冷卻。加入含DNA聚合酶、隨機(jī)六聚物、核苷酸、鹽和緩沖液的主體混合物(master-mix)，并使用20 μ L的最終反應(yīng)體積在30°C進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增2.0小時(shí)。隨后，在65° C溫育10分鐘內(nèi)將聚合酶熱失活。關(guān)于上文步驟(iii)，14-μ L PCR擴(kuò)增的參數(shù)(包括1.0或4.2_ μ L如上文(ii)中描述制備的樣品的模板等分試樣，和7pmol的用于檢測(cè)無(wú)效L0X-1突變的每一種引物FL820(W02010/075860 的 SEQ ID NO: 10)和 FL823 (W02010/075860 的 SEQ ID NO: 11) '參考Skadhauge, B.等人的 W02010/075860 中的圖 18B)如下:⑴I個(gè)循環(huán)，96° C變性2分鐘；(^)30個(gè)循環(huán):(a) 95。C 變性 I 分鐘；(b)68° C 退火 I 分鐘；(c) 72。C 延伸 I 分鐘(iii) 72° C 終延伸 10 分鐘(iv)保持上文的步驟(iv)由在摻有溴化乙錠的2%(w/v)瓊脂糖凝膠中電泳分離全部PCR混合物組成。電泳后，用UV光照射凝膠并拍照(圖10)。圖10中顯示的DNA帶型分析，表明由Tuborg啤酒的等分試樣沒(méi)有產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，由于原材料為野生型來(lái)源(即不來(lái)源于無(wú)效L0X-1大麥)，因此這是預(yù)料之中的結(jié)果。然而，可從由含50%無(wú)效L0X-1麥芽的混合物釀造的啤酒樣品檢測(cè)到預(yù)期長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物。類似但更為顯著地，在由三無(wú)效麥芽制備的非煮沸麥芽汁中獲得了染色?？赡苡捎跓釗p傷及隨后沉淀的原因，在三無(wú)效原材料的煮沸麥芽汁樣品中擴(kuò)增PCR產(chǎn)物較少。利用在獨(dú)立的PCR中用引物對(duì)FL1034-FL1039(分別為W02010/075860的SEQID N0:9 和 SEQ ID N0:8;還見(jiàn)于 Skadhauge 等人的 W02010/075860 中的圖 18)、引物組20 (TO2010/063288 的 SE Q ID N0:77 和 SEQID NO:81)及引物組 21 (W02010/063288 的 SEQID N0:78 和 SEQ ID NO:82;還見(jiàn)于Knudsen 等人的 W02010/063288 中的圖 15)以上文(ii)中的描述產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物，但按照與上文詳述的本實(shí)施例的條件相似的條件，證明是否通過(guò)使用三無(wú)效原材料生產(chǎn)麥芽汁或啤酒樣品。
權(quán)利要求
1.用于制備基于谷類的飲料的方法，所述飲料具有低水平的一種或多種異味物和/或其前體，其中所述方法包括低能量輸入，所述方法包括以下步驟: (i)提供谷類植株或其部分，其中所述谷類植株包含: (a)導(dǎo)致功能性脂肪氧化酶(LOX)-1完全喪失的第一突變；和 (b)導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變；和 (c)導(dǎo)致功能性S-腺苷甲硫氨酸:甲硫氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(MMT)完全喪失的第三突變； (ii)任選地對(duì)所述谷類的至少部分進(jìn)行制麥，由此獲得發(fā)芽的谷類； (iii)糖化所述谷類和/或發(fā)芽的谷類和任選的額外輔料，由此獲得麥芽汁； (iv)在存在任選的額外成分時(shí)，加熱所述麥芽汁，其中蒸發(fā)掉最多4%的麥芽汁體積，由此獲得加熱的麥芽汁； (V)將所述加熱的麥芽汁加工成飲料； 由此制得具有低水平的一種或多種異味物和/或其前體的源自谷類的飲料。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其為用于制備具有低水平的一種或多種異味物和/或其前體的基于大麥的飲料的方法，其中所述方法包括低能量輸入，所述方法包括以下步驟: (i)提供大麥植株 或其部分，其中所述大麥植株包含: (a)導(dǎo)致功能性脂肪氧化酶(LOX)-1完全喪失的第一突變；和 (b)導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變；和 (c)導(dǎo)致功能性S-腺苷甲硫氨酸:甲硫氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(MMT)完全喪失的第三突變； (ii)任選地對(duì)所述谷類的至少部分進(jìn)行制麥，由此獲得發(fā)芽的谷類； (iii)糖化所述谷類和/或發(fā)芽的谷類和任選的額外輔料，由此獲得麥芽汁； (iv)在存在任選的額外成分時(shí)，加熱所述麥芽汁，其中蒸發(fā)掉最多4%的麥芽汁體積，由此獲得加熱的麥芽汁； (V)將所述加熱的麥芽汁加工成飲料； 由此制備具有低水平的一種或多種異味物和/或其前體的源自谷類的飲料。如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述谷類植株是大麥植株。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟(i)包括提供大麥粒。
4.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述異味物是二甲基硫化物(DMS)和反式-2-壬烯醛(T2N)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中低水平的DMS是低于30ppb，優(yōu)選低于25ppb，更優(yōu)選低于20ppb的DMS水平，T2N水平低于0.025ppb,如低于0.024ppb。
6.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中異味物的所述前體是S-甲基-甲硫氨酸(SMM)和T2N潛能。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中低水平的SMM和T2N潛能是低于50ppb，優(yōu)選低于40ppb，更優(yōu)選低于30ppb，甚至更優(yōu)選低于20ppb的SMM水平并且T2N潛能的水平低于2ppb,優(yōu)選低于1.5ppb。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中在以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Quench制備的飲料中，所述低水平的SMM是低于50ppb,優(yōu)選低于40ppb,更優(yōu)選低于30ppb,甚至更優(yōu)選低于20ppb的SMM水平，并且低水平的T2N潛能是低于60%的T2N潛能水平，優(yōu)選低于50%的T2N潛能水平。
9.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述提供的大麥全部是發(fā)芽的。
10.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中使用包括以下步驟的方法對(duì)所述大麥進(jìn)行制麥: a)浸泡所述大麥； b)使所述大麥萌芽； c)烘干所述大麥。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中在最高80°C的溫度，更優(yōu)選在最高75° C的溫度，如最高70° C的溫度，例如最高65° C的溫度，如最高60° C的溫度，例如最高55° C的溫度，如最高50° C的溫度，例如最高45° C的溫度，如最高40° C的溫度下，烘干所述大麥。
12.如權(quán)利要求10至11任何一項(xiàng)所述的方法，其中在烘干過(guò)程中的任何時(shí)間內(nèi)所述烘干溫度不超過(guò)80° C，優(yōu)選不超過(guò)75° C。
13.如權(quán)利要求2至7任何一項(xiàng)所述的方法，其中所提供的大麥均不是發(fā)芽的。
14.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中在所述糖化前碾磨所述大麥和/或所述發(fā)芽的大麥。
15.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中已經(jīng)通過(guò)包括使用糖化溫度不超過(guò)69° C的糖化步驟的方法生產(chǎn)了所述麥芽汁組合物。
16.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中在糖化過(guò)程中任何時(shí)間的溫度均不超過(guò)80° C，優(yōu)選不超過(guò)78° C。
17.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(iii)中加入額外的輔料，并且所述額外輔料選自除大麥以外的玉米、稻和未發(fā)芽的谷類。
18.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(iv)中加入額外的成分，并且所述額外成分是酒花或其提取物。
19.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中將所述麥芽汁加熱至最高99.8° C，如最高99.5° C，例如最高99° C的溫度。
20.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法,其中使麥芽汁在基本上密閉的容器中，優(yōu)選在密閉容器中，進(jìn)行包括加熱所述麥芽汁的步驟(iv)。
21.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中將所述麥芽汁加熱至高于80°C的溫度最多30分鐘，優(yōu)選最多20分鐘。
22.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中蒸發(fā)掉最多3%，如最多2%，例如最多1%，如最多0.5%，例如最多0.1%，如最多0.01%的麥芽汁體積。
23.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中步驟V)包括冷卻所述加熱的麥芽汁。
24.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中步驟V)包括發(fā)酵所述麥芽汁。
25.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法在任何步驟都不涉及加熱至超過(guò)99° C的溫度。
26.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法不涉及加熱至超過(guò)80°C的溫度超過(guò)30分鐘，優(yōu)選超過(guò)20分鐘。
27.大麥植株或其部分，其中所述大麥植株包含: a)導(dǎo)致功能性LOX-1完全喪失的第一突變；和 b)導(dǎo)致功能性L0X-2完全喪失的第二突變；和 c)導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的第三突變。
28.如權(quán)利要求27所述的大麥植株，其中所述植株的L0X-1編碼基因包含選自移碼突變、缺失、無(wú)義突變、插入和剪接位點(diǎn)突變的突變。
29.如權(quán)利要求27所述的大麥植株或其部分，其中所述植株的L0X-1編碼基因包含提前終止密碼子。
30.如權(quán)利要求27至29任何一項(xiàng)所述的大麥植株或其部分，其中所述植株的L0X-1編碼基因包含位于起始密碼子下游最多705個(gè)，優(yōu)選最多665個(gè)密碼子位置上的提前終止密碼子。
31.如權(quán)利要求30所述的大麥植株或其部分，其中所述植株的L0X-1編碼基因包含無(wú)義密碼子，所述密碼子對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:2的第3572-3574號(hào)堿基。
32.如權(quán)利 要求27至31任何一項(xiàng)所述的大麥植株，其中所述植株的L0X-2編碼基因包含選自移碼突變、缺失、無(wú)義突變、插入和剪接位點(diǎn)突變的突變。
33.如權(quán)利要求27至32任何一項(xiàng)所述的大麥植株或其部分，其中所述植株的L0X-2編碼基因包含提前終止密碼子。
34.如權(quán)利要求27至33任何一項(xiàng)所述的大麥植株或其部分，其中所述植株的L0X-2編碼基因包含位于所述起始密碼子下游最多707個(gè)，優(yōu)選最多684個(gè)密碼子位置上的提前終止密碼子。
35.如權(quán)利要求34的所述大麥植株或其部分，其中所述植株的L0X-2編碼基因包含在SEQ ID NO: 5的第2689位核苷酸發(fā)生的突變，導(dǎo)致形成終止密碼子。
36.如權(quán)利要求27至35任何一項(xiàng)所述的大麥植株，其中所述植株的MMT編碼基因包含選自移碼突變、缺失、無(wú)義突變、插入和剪接位點(diǎn)突變的突變。
37.如權(quán)利要求27至36任何一項(xiàng)所述的大麥植株或其部分，其中所述MMT編碼基因中的突變位于剪接位點(diǎn)內(nèi)。
38.如權(quán)利要求27至37任何一項(xiàng)的所述大麥植株或其部分，其中所述MMT編碼基因中的突變位于內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)內(nèi)。
39.如權(quán)利要求27至38任何一項(xiàng)的所述大麥植株或其部分，其中所述MMT編碼基因中的突變是內(nèi)含子的5’剪接位點(diǎn)內(nèi)的突變，如內(nèi)含子末端5’堿基的G —A突變。
40.如權(quán)利要求27至39任何一項(xiàng)所述的大麥植株或其部分，其中所述MMT編碼基因中的突變是內(nèi)含子的5’剪接位點(diǎn)內(nèi)的突變，所述內(nèi)含子選自2號(hào)和5號(hào)內(nèi)含子。
41.如權(quán)利要求40所述的大麥植株或其部分，其中所述MMT編碼基因中的突變是SEQID NO:9的3076號(hào)堿基的G — A突變。
42.如權(quán)利要求40所述的大麥植株或其部分，其中所述MMT編碼基因中的突變是SEQID NO: 11的1462號(hào)堿基的G — A突變。
43.如權(quán)利要求27至42任何一項(xiàng)所述的大麥植株或其部分，其中所述突變產(chǎn)生編碼MMT截短形式的基因，所述MMT截短形式包含野生型MMT的N末端片段和任選的野生型MMT中未發(fā)現(xiàn)的額外C末端序列，其中所述N末端片段包含SEQ ID NO: 13的最多500個(gè)，更優(yōu)選最多450個(gè)，甚至更優(yōu)選最多400個(gè)，還更優(yōu)選最多350個(gè)，甚至更優(yōu)選最多320個(gè)，還更優(yōu)選最多311個(gè),或最多288個(gè)N末端氨基酸殘基。
44.如權(quán)利要求27至43任何一項(xiàng)所述的大麥植株或其部分，其中所述植株是2008年10月13日以保藏號(hào)PTA-9543保藏在ATCC的名稱為〃大麥，Hordeum vulgare:8063系〃的大麥植株和以保藏號(hào)PTA-9640保藏在ATCC的名稱為〃大麥，Hordeumvulgare L.:A689系"的大麥植株的子代。
45.包含加工的大麥植株或其部分的麥芽組合物，其中所述大麥植株是權(quán)利要求27至44任何一項(xiàng)所述的大麥植株。
46.如權(quán)利要求45所述的麥芽組合物，其中所述大麥植株的所述部分是麥粒。
47.如權(quán)利要求45至46任何一項(xiàng)所述的麥芽組合物，其中所述麥芽組合物選自綠麥芽和烘干的麥芽。
48.如權(quán)利要求45至47任何一項(xiàng)所述的麥芽組合物，其中所述麥芽組合物是經(jīng)碾磨的麥芽。
49.如權(quán)利要求45至48任何一項(xiàng)所述的麥芽組合物，其中所述麥芽組合物包含最多.2μ g/g,優(yōu)選最多I μ g/g，更優(yōu)選最多0.5 μ g/g,甚至更優(yōu)選最多0.2 μ g/g的SMM。
50.基于大麥的飲料，其由權(quán)利要求27至44任何一項(xiàng)的大麥植株或其部分制備。
51.如權(quán)利要求50所述的飲料，其中所述飲料通過(guò)權(quán)利要求2至26任何一項(xiàng)所述的方法制備。
52.如權(quán)利要求50至51任何一項(xiàng)所述的飲料，其中所述飲料是麥芽飲料。
53.如權(quán)利要求50至52任何一項(xiàng)所述的飲料，其中所述飲料是發(fā)酵的麥芽飲料。
54.如權(quán)利要求50至53任何一項(xiàng)所述的飲料，其中所述飲料是啤酒。
55.如權(quán)利要求50至51和54任何一項(xiàng)所述的飲料，其中所述飲料是大麥啤酒。
56.如權(quán)利要求50至55任何一項(xiàng)所述的飲料，其中所述飲料是無(wú)醇麥芽飲料。
57.如權(quán)利要求50至56任何一項(xiàng)所述的飲料，其中與以相同方式由野生型大麥，優(yōu)選cv.Quench制備的飲料相比,所述飲料在60至80分鐘內(nèi)產(chǎn)生更多的泡沫,為野生型的至少.1.5倍，優(yōu)選至少2倍，還更優(yōu)選至少3倍。
全文摘要
使用高能耗方法，例如麥芽廠和釀造廠中分別用于烘干和麥芽汁煮沸的操作，大量生產(chǎn)基于大麥的飲料。本發(fā)明涉及用于制備基于大麥的飲料的節(jié)能方法，以及用于此類方法的大麥植株。特別地，本發(fā)明描述了在一植株中具有無(wú)效脂肪氧化酶-1(無(wú)效LOX-1)、無(wú)效脂肪氧化酶-2(無(wú)效LOX-2)和無(wú)效S-腺苷甲硫氨酸甲硫氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶的組合特征的大麥植株，其特別用于制備基于大麥的飲料，如啤酒的節(jié)能方法。
文檔編號(hào)C12C12/00GK103209584SQ201180027413
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2011年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月3日
發(fā)明者索倫·克努森, 普雷本·里斯, 伯吉特·斯卡德豪奇, 萊恩·M·貝克, 奧利·奧爾森 申請(qǐng)人:嘉士伯釀酒有限公司, 海尼肯供應(yīng)鏈股份有限公司