專利名稱：稀有細胞的磁性分離的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分離包括細胞的粒子。本發(fā)明的一些實施例涉及稀有細胞的磁性分離。
背景技術：
在文獻(例如美國專利4，710，472和其中引用的多個出版物)中描述了大量涉及生物細胞的磁性分離的申請。許多這樣的申請不但需要分離一種或多種特殊類型的細胞(以下簡稱“靶細胞(target cell)”)，還需要維護靶細胞和/或非靶細胞中細胞膜的品質。因此，在正向選擇過程中，使靶細胞與用于檢查或用于研究、診斷或臨床目的的樣品分離；而在去除過程中，該樣品耗盡了用于檢查的靶細胞或使用了非靶細胞。使靶細胞與非靶細胞 分離，以及維護靶細胞和非靶細胞的薄膜，對目前正在利用淋巴細胞群處理的研究以及早期癌癥檢測是尤其重要的。目前，用于分離生物細胞的一項技術使用MiniMACS分選柱(separationcolumns) (Miltenyi Biotec GmbH,德國美天旎生物技術有限公司)。該項技術使用極其小且直徑大約為50nm (即與病毒尺寸相比體積比真核細胞小大約100萬倍)的順磁微珠。這樣的磁微珠被制造具有某些細胞(即，靶細胞)的選擇性親和力，以便對靶細胞進行磁性標記或染色。將所述樣品引入包括透水磁體的磁選柱中，例如，鋼絲綿或鋼絲網(wǎng)，并且向整個柱上施加磁場，使得將磁性染色細胞保持在柱的透水磁體中，同時未染色的細胞穿過該柱。然而在該已知過程中，發(fā)現(xiàn)細胞膜被透水磁體過度損壞，降低了研究或臨床用技術的有效性。在某些情況下，靶細胞在樣品中很罕見，諸如，給分離過程帶來挑戰(zhàn)的癌細胞、干細胞或胎細胞。下面參照胎細胞，作為非限制實例。人們對母體血液中存在胎細胞的了解已超過一個世紀，因為SchmorK I)展示了在死于子癇的女性的肺循環(huán)中的滋養(yǎng)層細胞。從那以后，已經(jīng)證明五種不同的胎細胞類型在母體血液中循環(huán)，包括滋養(yǎng)層細胞(I)、淋巴細胞(2 )、有核紅血球(NRBC) (3 )、粒細胞(4)、干細胞(5)。胎細胞在母體循環(huán)中的頻率很低，經(jīng)定量PCR技術(6)檢測，平均為每毫升母體血液具有I. 2個細胞。在與母體血液隔離的所有胎細胞類型之中,NRBC作為用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷(7)的最佳候選細胞。研究人員一直試圖利用熒光激活細胞分類術法(FACS)和磁珠細胞分選法(MACS)胎兒NRBC的分離和富集(enrichment)，包括由NIH資助的大規(guī)模研究(NIFTY研究)。該項研究實現(xiàn)了低靈敏度的胎細胞檢測，F(xiàn)ACS的回收率為13%，MACS的回收率為44% (領先的磁選技術)(8)，并得出這樣的結論當母體血液中胎兒NRBC的比例低，且現(xiàn)有分離技術的回收率低時，F(xiàn)NRBC并不適用于臨床應用。由于分離這些細胞是極其困難的，所以采用基于不同遺傳物質諸如DNA片段(9)的替代且不太有效的方法。這些物質必須利用PCR加倍，以對其進行有效分析，且不能提供與FNRBC可能具有的三體有關的決定性結果水平相同的水平。
對于本發(fā)明的某些發(fā)明人及其他人，美國專利6，482，328公開了一種使所選類型的靶粒子與樣品磁性分離的方法和設備，以便濃縮樣品中的靶粒子，或相對于靶粒子而耗盡樣品，這是通過制造帶有具有選擇性親和力的磁粒子的樣品的樣品混合物以對靶粒子進行磁性染色而實現(xiàn)的。仍然迫切需要對高產(chǎn)率、高純度的稀有活細胞進行快速、可靠的磁分離。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種快速、高效定性定量地使稀有細胞與流體樣品磁性分離的系統(tǒng)，該流體樣品具有相對于其余細胞的較低豐度的稀有細胞，同時，保持細胞活力。例如，稀有細胞包括地中海貧血患者體內存在的有核紅細胞(NRBC)，或母體循環(huán) 中存在的胎兒有核紅細胞(FNRBC)、外周血中的癌細胞、胎兒或成體干細胞或在循環(huán)內由⑶71，CD8, CD34或CD 133表征的細胞。在某些實施例中，該分離提供了足夠濃度和/或數(shù)量的稀有細胞，以對所述細胞或其部分進行顯著的可靠的臨床分析、遺傳分析、化學分析或其他分析。例如，孕婦循環(huán)中的胎兒有核紅細胞相對其他細胞來說極為罕見，大約IOOppb或更少，阻礙了對胎兒細胞或DNA進行可靠的遺傳分析。根據(jù)在本文中公開的方法，可以從常規(guī)血液樣品中獲得充分或足夠數(shù)量的FNRBC，諸如，樣品中存在的95%以上的FNRBC。因此，該方法能夠進行有效分離，且所獲得的細胞隨后可以根據(jù)技術中已知的可用方法中的一種方法而用于遺傳分析或診斷。在典型實施例中，對包括靶細胞的初級樣品(例如，血液樣品)細胞進行處理以便使該細胞結合或偶聯(lián)到磁珠上(該磁珠對初級樣品中的靶細胞具有偶聯(lián)或結合特異性)，以便至少大體上形成其他非磁化細胞中的磁化細胞樣品。在一些實施例中，結合到磁珠上的革巴細胞在大部分不相關非磁化細胞中是稀有或極為少見的細胞類型。在一些實施例中，諸如，當要分離(或去除，depletion)活細胞時，處理所述細胞，使得細胞活力得以保存并在保持(維持)細胞活力的環(huán)境下分離所述細胞。下面對合適介質或載液的實例進行描述。所述樣品與載液混合，構成來維持活細胞，然后受驅通過管道，該管道在不考慮重力的情況下以受控速率在管道內傳遞混合物。所述管道穿過一個或多個具有由電磁體產(chǎn)生并主動控制的磁通量的磁化區(qū)(本文中也稱為‘分離區(qū)’)。所述電磁體被構造成提供磁通量，該磁通量形成為實現(xiàn)對稀有磁性靶細胞進行有效磁分離。根據(jù)優(yōu)選實施例，分離并恢復所述細胞，同時混合物以足夠高的速率流動，防止為了維持細胞活力而長期暴露在不理想的條件下(諸如缺乏通氣)的條件下，對細胞活力產(chǎn)生不利影響。根據(jù)一些實施例，以最初存在于樣品中的稀有細胞的至少50%，或者至少60%，或者至少70%，或者至少80%，或者至少90%或更高的效率保留或分離所述磁性靶細胞。在其他實施例中，所述磁性靶細胞包括大部分所采集的分離細胞。在各種實施例中，所述磁性靶細胞實現(xiàn)了所恢復的分離細胞的60%以上,或者70%以上,或者80%以上,或者90%以上,或者95%以上，諸如98%的比例。每種可能性均是本發(fā)明的獨立實施例。分離的磁性靶細胞聚集在和/或粘附在一個或多個磁分離區(qū)中的管壁上。然后，在阻止磁場以減少磁性細胞被吸引到管道，用載液(或其他液體)將分離的磁性靶細胞清洗(沖洗)到收集容器中。
本發(fā)明還提供了用于幫助從管壁上有效除去并釋放分離細胞的機構，提高分離(細胞量)的定量產(chǎn)率(回收率)。在一些實施例中，通過使分離區(qū)消磁，消除剩磁并減少所分離的靶細胞對管壁的磁引力，來提高從管壁清洗所分離的磁性靶細胞的效率。在其他實施例中，通過以下至少一種操作來機械輔助進行清洗使一個或多個氣泡穿過管道、突然改變導致液體沖擊的流速或使管道振動、向分離區(qū)或分離區(qū)附近的管道施加超聲波。所述電磁體被設計成利用充足的電力來提供并集中管道周圍的磁通量，便于有效分離，同時避免可能會例如由于散熱而對細胞或設備產(chǎn)生不利影響的不必要的或者過度的電力消耗。此外，為了實現(xiàn)快速而高質量的分離，所述系統(tǒng)配置為，促使混合物以提供快速分離的足夠高的速率(同時避免損害細胞)流過具有足夠大內徑或橫截面的管道。 在一些實施例中，稀有細胞要達到90%以上的純度以及大約或90%以上的回收率的典型分離的周期在幾分鐘內，諸如，在大約5分鐘至大約15分鐘內完成。在一些實施例中，所述系統(tǒng)如此構成，使得所述管道基本上水平地穿過或設置在分離區(qū)，從而提供便攜式設備，便攜式設備在包括但不限于無菌室或通風柜的不同位置安裝并操作。這樣的密封空間優(yōu)選水平配置，與垂直定向系統(tǒng)相對。在分離區(qū)之間的分離、獲取及清洗順序、流速、分離區(qū)的磁場、載液及清洗液的化學和理化特性(例如粘度)、清洗率和/或氣體參數(shù)和操作都是控制變量。這些變量適于提供預期的或充分的結果，同時維持細胞活力，基本上避免了非靶細胞與磁性靶細胞聚合和/或避免聚合在可以降低純度和/或稀有細胞分離的產(chǎn)率的管壁上。在一些實施例中，對分離的工作環(huán)境進行控制，以便根據(jù)磁性靶細胞的磁響應性，在分離區(qū)中產(chǎn)生大致間歇式分離。這些實施例類似于分餾。應注意，雖然本文舉例說明了高效分離稀有細胞的上述分離技術，但該技術在分離和/或去除非稀有細胞時是有效的。應注意，術語“分離”，反之及“去除”不一定是指全部分離靶細胞或相反地全部切除靶細胞，而是指實際上或足夠高的定性定量分離，以及反之所對應的去除。


在下列附圖中對本發(fā)明的一些非限制示例性實施例進行說明。一個或多個附圖中出現(xiàn)的相同或重復或同等或類似的結構、元件或部件通常用相同附圖標記表示，可選用一個額外字母或多個額外字母標記以對類似對象或對象變體進行區(qū)分，但不重復標記和/或描述。選擇圖中所示的部件和裝置的尺寸以便方便表達或清楚表達，且該尺寸不一定是按比例或真實的角度顯示的。為了方便或清晰起見，未示出一些元件或結構或只示出了一部分和/或從不同角度或視角示出。應注意，有些圖被轉化成了黑白底，從而通過減少某些細節(jié)或紋理或細度而降低了圖片質量。圖IA示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的稀有細胞分離系統(tǒng)；圖IB示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的諸如圖IA的系統(tǒng)的分離裝置的透視圖IC示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的諸如圖IA的系統(tǒng)的分離裝置的剖視圖；圖ID示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的諸如圖IA的系統(tǒng)的磁化區(qū)的放大剖視圖；圖IE示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的諸如圖IA的系統(tǒng)的磁化區(qū)的另一放大剖視 圖；圖IF示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的另一稀有細胞分離系統(tǒng)；圖2A示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的諸如圖IA的分離系統(tǒng)的外部描述；圖2B示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的諸如圖IA的具有方便處理樣品的機構的分離系統(tǒng)的外部描述。
具體實施例方式下列描述涉及本發(fā)明實施例的一個或多個非限制實例。本發(fā)明不受所述實施例或附圖的限制，且可以按不同方式或配置或變更進行實踐。本文所用的術語不應被理解為起限制作用，除非另有規(guī)定。本文所用的非限制節(jié)標題僅是為了方便，不應被理解為限制本發(fā)明的范圍。通用術語術語‘大約’，‘接近’，‘大致’及‘幾乎’表示相對于所引用的術語或實施例或操作或本發(fā)明的范圍無不良后果或影響的各個關系或尺度或數(shù)量或數(shù)目或程度。術語‘垂直’，‘水平’，‘平行’，‘相對’，‘直線’及其他角度和幾何關系表示近似但卻具有功能性和/或實用性的各個關系。術語‘優(yōu)選的’，‘最優(yōu)地’，‘典型的’，‘示例地’或‘可選地’不限制本發(fā)明或其實
施例的范圍。術語‘基本的’，‘可觀的’(或其同義詞)表示針對上下文的尺度或范圍或數(shù)量或程度，包含大部分或大多數(shù)所引用的實體，或相對于所引用的實體或針對所引用的主題至少適度或更多或更大或更有效或更重要的范圍。術語‘可忽略的’和‘輕微的’(或其同義詞)表示足夠小的各個關系或尺度或數(shù)量或數(shù)目或程度，以相對于所引用的術語或對本發(fā)明的范圍產(chǎn)生實際后果。術語‘可’表示包括或不包括和/或使用或不使用和/或實現(xiàn)或不實現(xiàn)和/或發(fā)生或不發(fā)生的選擇或影響，而該選擇構成了本發(fā)明的一些實施例或其后果的至少一部分，無需限制本發(fā)明的范圍。術語‘包括’，‘包含’，‘具有’及其詞形變化及同根詞表示‘包括但不限于’。當列舉一系列值時，僅是為了便利或簡潔，包括所有可能的子范圍以及該范圍邊界內或周圍的單個數(shù)值。任何數(shù)值，除非另有規(guī)定，否則還包括實際近似值，且整數(shù)值不排除分數(shù)值。子范圍值及實際近似值不應被視為專門公開的值。除非上下文另有指示，參照單數(shù)形式的對象(例如“一件事(a thing)或“這件事(the thing)”)不排除復數(shù)形式(例如“這些事”)。上下文相關術語
在本說明書和權利要求書中，下列術語及其派生詞和詞形變化是指下列各個非限制表征，除非另有規(guī)定或根據(jù)上下文變得顯而易見。磁化/磁性(細胞)一與鐵磁材料偶聯(lián)，諸如，與磁珠偶聯(lián)。靶細胞一通常是用于與其他細胞(例如用于檢查或診斷的細胞)分離或集中的特定類型，或具有與其他細胞明顯不同的特征(諸如選擇性交互親和力以與某些抗體或其他化合物或其他粒子耦合)的細胞。在特定實施例中，鮮明特征是選擇性親和力，以便與磁珠偶聯(lián)或結合，形成磁性靶細胞。分離一使靶細胞與周圍散裝液體隔離或收集積累靶細胞，其中，例如，散裝液體是細胞乳液的流體混合物或懸浮物或其組合，也指相對于周圍散裝液體或所提供的細胞樣品濃縮或富集靶細胞(獲得類似于沉淀或離心分離的沉淀)。去除一針對分離，從散裝液體去除靶細胞(獲得類似于沉淀或離心分離的上清 液)。高定性(分離、去除)一高純度，分離基本上不包括其他細胞的靶細胞，或包括微量的其他細胞(諸如大約5%或大約1%或更少)的分離細胞，反之去除。高定量(分離、去除)一高回收率，分離樣品中幾乎所有的靶細胞，或大量的靶細胞，諸如，大約95%或大約99%或更多，或分離細胞，反之去除。磁珠一順磁亞微米粒子，諸如，直徑或橫截面在納米級范圍內(例如20_100nm)的微珠或微球，適應選擇性親和力，以便與靶細胞偶聯(lián)或結合。稀有細胞一具有特定特征且在微生物源或其他環(huán)境中極為少見(“低豐度”)的細胞，諸如，在各個源或環(huán)境中相對于其他細胞來說每毫升大約或小于10個細胞(例如每毫升大約I個細胞)或小于Ippm(例如lppb)。例如，胎兒有核紅細胞(本文也稱為NRBC，F(xiàn)NRBC)或干細胞。磁化/磁性(細胞)一與鐵磁材料偶聯(lián)，諸如，與磁珠偶聯(lián)。細胞-生物細胞，還包括生物和其他粒子或化合物的組合，可選地，是諸如磁珠的非生物源，并包括，例如，血細胞、微生物及其部分，或生物源(諸如孢子或花粉)的其他粒子，但不排除非生物源的粒子。(細胞的)初級樣品一包括從細胞源(例如血液樣品,污染的水或空氣樣品)采集的細胞的樣品體積，諸如，利用離心機、試劑或抗體可能或可選進行物理、化學、生物濃縮。(細胞的)樣品一包括從細胞源(例如血液樣品，污染的水或空氣樣品)采集的細胞的樣品體積，可能或可選進行化學和/或生物和/或物理處理和/或改變(例如冷卻、離心、稀釋、與磁珠偶聯(lián))。相當一部分一顯著的相對量，諸如，所引用實體的25%至80%之間或更高?！畃pm’，‘ppb’ 一分別為百萬分之幾(10_6)，十億分之幾(10_9)。應注意，每當本文描述附著或粘附在管壁上的細胞，或達到該效果的類似術語時，不一定是指細胞直接附著在管壁上，而是還可以通過細胞鏈或細胞群等連接至或鏈接至或間接附著在管壁上。概沭下面對實踐本發(fā)明的非限制概述進行介紹。本概述概括了本發(fā)明實施例的示例性實踐，為變形和/或替換和/或擴充實施例提供了建設性基礎，隨后對這些實施例中的一些進行描述。圖IA示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的使稀有細胞與其他細胞分離的系統(tǒng)100A。通常，系統(tǒng)100A包括在分離裝置122中形成的磁化區(qū)124，包括磁性稀有細胞及其他非磁性細胞的樣品混合物的流體在管道110中從樣品混合物源106穿過(流過)該磁化區(qū)并排出到收集容器108。在下列討論中，除非另有規(guī)定或根據(jù)上下文變得顯而易見，術語‘靶細胞’是指‘磁性靶細胞’。樣品容器102盛放有包括生命維持流體中的磁性稀有靶細胞的樣品細胞，載體容器(或庫)104盛放有用于在分離系統(tǒng)100A中攜帶樣品的載液(以下也稱為‘載體’)。在一些實施例中，通常是分離活細胞時，所述載體是生命維持流體，諸如生理鹽水，可選地，包括添加劑，諸如抗凝成分。所述樣品和載體分別通過泵112和114獨立輸送至進行混合的中間容器106 (也 稱為‘混合物容器’)。具有獨立控制的泵，允許調節(jié)樣品與載體的比例，以便于對靶細胞進行充分或理想的分離，通常與系統(tǒng)100A的其他參數(shù)(例如磁化區(qū)的數(shù)量和磁場強度)有關。通過管段142從混合物容器106饋送樣品和載體的流體混合物(以下簡稱‘混合物’)，進一步經(jīng)由示意性地示為144的連接件而送入管道110。通常，用括號134表示的元件一般是豎直的，如箭頭154所示。為進一步參考，圖IB示意性地示出了系統(tǒng)IOA的分離裝置122的透視圖(與所示的橫截面A-A和用箭頭158表示的上表面一起示出)，圖IC示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的分離裝置122的截面A-A視圖，其中圖1D-1E示意性地示出了磁化區(qū)124的兩個示例性變體的截面圖A-A。
來自混合物容器106的混合物被提供到設置在一個或多個分離裝置122大致水平上表面上的大致水平定向的管道110中，如平面坐標152所示。分離裝置122包括分別具有內芯126a和外芯126b的電磁體，以及纏繞在內芯126a上的線圈128，構成磁化區(qū)124a及124b，其中，示意性地用箭頭160u及160d表示磁場方向，同樣如圖IC中的各個磁場方向160所示。從混合物容器106送入管道110的混合物在管道110中被泵116驅動(推進)，該泵對流速進行調節(jié)，該調解與重力無關且與從樣品容器102及載體容器104流入混合物容 器106無關。當混合物穿過磁化區(qū)124時，形成由電磁體產(chǎn)生的磁場，以使磁化靶細胞吸引到管道110壁上，并使靶細胞與壁上的其余混合物分離并濃縮，同時阻止非靶細胞附著在壁上。當混合物流過管道110且靶細胞粘附在管道110壁上時，去除混合物(基本上沒有稀有靶細胞)經(jīng)由與示意性地示為148的連接件連接的管段146排入收集容器108。通常，括號136表不的兀件一般是豎直定向的，如箭頭156所不。一旦完成分離并且將去除混合物排到容器108中，則停止電磁體產(chǎn)生磁場，從而減少磁化靶細胞被吸引到管道，將靶細胞清洗(沖洗)到另一個收集容器，諸如另一容器108中。在一些實施例中，停止磁場還包括，使電磁體消磁，以便消除仍然可能拉動所分離的靶細胞并將該細胞粘附到管道110壁上的剩磁，例如，通過在電磁體中施加暫時衰減的交流電，從而有助于分離細胞從管壁上脫離下來。為了提高分離靶細胞的產(chǎn)量(定量性地增加分離或回收)，在一些實施例中，除消磁之外，還采取一項或多項措施來促使靶細胞從管道110壁上脫離下來。例如，使推動靶細胞的一個或多個氣泡流動，和/或利用一個或多個壓電元件等使管道振動，和/或至少在磁化區(qū)124周圍向管道施加超聲波，或突然改變流速以導致液體沖擊。與應用脫離促進裝置同時和/或先后地，可選設置或調節(jié)由載體或來自另一個容器的其他流體清洗掉的靶細胞，以及清洗液的成分(例如粘度)和/或流速，以便清洗掉幾乎所有的分離靶細胞。應注意，在各種實施例中，任何數(shù)量的分離裝置122可以用于系統(tǒng)100A的實施例，包括單個裝置，如阻斷/連續(xù)指示138所示。分離系統(tǒng)變型 圖IF示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的另一稀有細胞分離系統(tǒng)IOOB0系統(tǒng)100B與系統(tǒng)100A類似，不同之處在于，系統(tǒng)100B中使用不同設計的分離裝置182代替系統(tǒng)100A的分離裝置122。分離裝置182包括電磁體，該電磁體包括鐵芯186，鐵芯186周圍纏繞有線圈188a和188b，在磁化區(qū)184 (諸如184a及184b)周圍分別產(chǎn)生用箭頭160p及160q表示的磁場的。任意數(shù)量的分離裝置182可以用于系統(tǒng)100B的實施例，包括單個裝置，如阻斷/連續(xù)指示138所示。圖2A-2B示意性地示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的諸如分離系統(tǒng)100A的外部描述200。所示的部分與針對圖1A-1C所述的系統(tǒng)100A的那些部分相同或類似。系統(tǒng)200通常由一個或多個處理器或計算機進行控制，該處理器或計算機根據(jù)在計算機可讀介質上存儲的且通過觸摸面板204和/或鼠標和/或鍵盤和/或任何其他人機接口設備(如諸如專用鍵盤或遙控器)等處理的一個或多個程序進行操作。在一些實施例中，收集容器(諸如108)安裝在一個機構(諸如轉盤(表示為202))上，根據(jù)系統(tǒng)的操作程序，使合適的容器移至或轉到引流管(排出管)110所在位置。例如，在分離過程中，設置用于收集去除混合物的容器，便于引流，在收集靶細胞的過程中，在引流管處設置另一個容器。由于在受控環(huán)境下(諸如在無菌室或通風柜中)通常使用分離系統(tǒng)(諸如系統(tǒng)200)，如果樣品容器102 (或其安裝元件)固定設置在高處(相對于系統(tǒng)的其余部分，諸如磁化區(qū)124的水平)，則進入以安裝或拆除樣品容器102或填充樣品或向樣品添加成分，在某些情況下是受限制的，或不合適的。在一些實施例中，實現(xiàn)一種方便訪問樣品容器102的機構。圖2B進一步示出了根據(jù)本發(fā)明的示例性實施例的方便處理樣品容器102的機構206。該機構206被構造為平行四邊形，其中，一邊204固定安裝在系統(tǒng)200的框架上，另一邊可以在上位和下位之間移動，后者被描述為覆蓋層，向上的方向由箭頭208表示?？蛇x地，可以使用其他機構，包括方便訪問系統(tǒng)(諸如系統(tǒng)200)的其他部分的機構。設備/變化一般來說，系統(tǒng)100AU00B及200 (分別在圖1A、1F及2A-2B中)有著如上所述的共同特征，一般在下列說明中提到，不限制地，也與系統(tǒng)100 (也稱‘系統(tǒng)’)一樣。圖1A-1F及2A-2B也在下列說明中提到。
電磁體和系統(tǒng)100A和100B中的磁化區(qū)124和184的構造，以及所述電磁體產(chǎn)生的磁場(例如，螺旋分布)的形狀、方向及強度，以及磁化區(qū)的數(shù)量經(jīng)配置、確定或調整，以實現(xiàn)管壁上稀有靶細胞的有效分離，每個磁化區(qū)可選具有不同磁場形狀和/或強度。磁化區(qū)的場通量影響磁化細胞的分離，同時阻止非靶(及非磁化)細胞附著在管壁上，導致稀有細胞聚集在大約95%至大約99%或以上，諸如98%，幾乎沒有非靶細胞或其量可忽略。在一些實施例中，通過阻止或延遲非靶細胞在流體混合物中向管壁流動，或可選通過考慮載體或混合物的性能(諸如粘度或彈性)，來阻止非靶細胞。在一些實施例中，利用添加劑等對載體(或此物質的混合物)的組成進行設置，選擇或調整，同時仍然允許磁化靶細胞在磁場的拉動下向管壁移動。例如，通過鐵芯(例如126或186)的形狀和結構(例如結構、材料)、線圈(例如128 或188)的形狀和繞組、線圈中的電流強度(可選包括電流的時間變化)及設置管道(例如管道110)的構造(凹槽、夾具)中的一種或多種，對磁化區(qū)的磁通量形狀和強度進行配置。在一些實施例中，為了實現(xiàn)如上所述的分離，電磁體的配置使得在每個磁化區(qū)中，將流動混合物中大量的磁化稀有細胞(例如50%或以上)吸引到具有微量的非靶細胞或幾乎沒有非靶細胞的管壁上。在一些實施例中，根據(jù)設計規(guī)則和/或專業(yè)技術設計并構建電磁體，并通過檢查分離的有效性，例如利用技術方法(例如細胞計數(shù)法或MACS)比較稀有細胞在樣品和單獨收集中的濃縮或分布來確定是否改性。隨后，調節(jié)或修整或調整所述電磁體或磁化區(qū)，以便提高該目標(例如，分離濃縮95%及以上)的結果。應注意，從混合物容器106至收集容器108的路徑基本上為連續(xù)導管或管道，其中，管道諸如110及管段，諸如142或146，并且連接件144和148的直徑或橫截面相同或不同。在一些實施例中，管道110的橫截面可以隨其長度改變，從而改變流速，可選地，使磁化區(qū)相關的直徑或橫截面適于促使靶細胞粘附到管壁上和/或防止非靶細胞粘附到管道110壁上或靶細胞上，和/或防止可能阻礙混合物流的非靶細胞凝結。在一些實施例中，至少磁化區(qū)124或184周圍的管道110的內徑大約為或大于2mm,以獲得足夠流速,實現(xiàn)快速分離。144和148表示的連接件是諸如彎管或膝狀管的管段，通常為管道110中的彎頭(例如，參見圖2A-2B)，并將大致豎直的管段142和146連接至大致水平的管道110。可選地或可替換地，所述分離系統(tǒng)被構造成使得從混合物容器106至收集容器108的管道或導管的管段可以處于其他方位，在大致水平的大方向(例如，樣品容器102和混合物容器106大致一樣高)與大致垂直的大方向之間，或具有任何其他變化。通常，所述管道(諸如110或142或146)及連接件144和148由生物相容性材料制成，或涂覆有生物相容性材料，以保存活細胞，諸如，硅膠管。所述管道通常是柔軟可彎曲的管道并且彈性可壓縮(例如，彈性壓縮)。推進泵116可以設置在混合物容器106和收集容器108之間的路徑上，諸如，在第一分離裝置(諸如122或182)之前或在最后一個分離裝置之后的任何實用段上。在一些實施例中，可以使用任意數(shù)量的分離裝置或磁化區(qū)或電磁體，如阻斷/連續(xù)指示138所示,還指的是,少量的電磁體或裝置或區(qū)域,可選地,只有一個元件，以及短管?？蛇x地，多個泵(諸如泵116)通常是同步的，可以用來使混合物在管道110內流動。在一些實施例中，泵112、114及116是保持細胞活力和/或提供調節(jié)流速的任意栗，諸如，螺動栗。應注意，雖然分離裝置122或182分別包括兩個磁化區(qū)124，但裝置122或182或其他裝置可以設計成具有一個或兩個以上的磁化區(qū)，可選地，該磁化區(qū)具有不同結構和所產(chǎn)生的磁場。在一些實施例中，樣品容器102是一次性容器，容量大約為50ml，只用于一次分離，而在一些實施例中，載體容器104是更大的瓶子，或是為多次分離提供載液的其他容器。在一些實施例中，管道110 (或實際上是包括管道110和管段142和146及連接件144和148的連續(xù)管道)是一次性管道，只用于一次分離，并由硅膠管I. 98*3. 18制成。通常，收集容器與試管類似并且是一次性的。在細胞活力不是強制性的或樣品是非生命粒子的情況下，流體(諸如載體或清洗液)不一定是維持生命的流體，且所述管道不一定生物相容，允許成分和組分具有更多的選擇，用于特定性能(諸如粘度、彈性或流態(tài))。 磁化區(qū)所述電磁體被設計來提供并聚集磁化區(qū)的磁通量，以便通過避免可能對細胞或設備產(chǎn)生不利影響的過度或多余的電力消耗，利用功率效率進行有效分離。例如，過度散熱可能會損壞細胞或使細胞凝結，或改變載體的粘度，或使電磁體變形。保持電力消耗基本上為最少值或標稱值，同時提供用于分離的足夠通量，也可以避免冷卻機構，從而提供一種簡單、緊湊、可靠的設備。此外，為了實現(xiàn)快速而高質量的分離，所述系統(tǒng)配置為，促使混合物以提供快速分離同時避免損害細胞的足夠高的速率(例如大約2ml/min)，流過具有足夠大內徑或橫截面(例如，大約2mm)的管道，如果速率不夠低或所述管道不夠窄(例如大約Imm或以下)，則可能會損害細胞，導致流動流體中存在力，諸如，可能會對細胞產(chǎn)生不利影響(諸如細胞凝結)的剪切力。圖ID示意性地示出了分離裝置(諸如裝置122)的磁化區(qū)124p (諸如區(qū)域124)的放大剖視圖，其中，一段管道示意性地示出了管道110的布置。磁化區(qū)124p被形成為由間隙隔開的大致平行的平坦表面(磁場的方向可以與如圖IC中的磁化區(qū)124a和124b所示的方向相反)，用于將一段管道110設置在箭頭160表示的磁場通量中。在一些實施例中，該間隙大約為3_或以上，允許放置足夠寬的管道110，便于快速分離。圖IE示意性地示出了分離裝置(諸如裝置122)的磁化區(qū)124q (諸如區(qū)域124)的放大剖視圖，其中，一段管道示意性地示出了管道110的布置。磁化區(qū)124q被形成為大致相對的圓形表面，用于進一步集中磁通量(諸如，相對于磁化區(qū)124p)，基本上無需外加動力。該圓形表面由間隙隔開(磁場的方向可以與如圖IC中的磁化區(qū)124a和124b所不的方向相反)，用于將一段管道110設置在箭頭160表示的磁場通量中。在一些實施例中，該間隙允許放置外徑大約為3mm的足夠寬的管道110，便于快速分離。下列表I根據(jù)電流提供了在磁化區(qū)124產(chǎn)生并集中磁場通量的效率以及磁化區(qū)124q的圓形表面相對于磁化區(qū)124p的平坦表面的更高效率的實例。電磁體線圈(例如，分離裝置124的線圈)由2000個I. Imm厚的鋼絲繞組制成，產(chǎn)生9. IQ的電阻。所描述和所列舉的值為相當接近的近似值。
權利要求
1.一種磁性分離系統(tǒng)，被構造成以定性定量的高產(chǎn)率使磁化細胞與非磁化細胞流體混合物分離，同時保持細胞的活力，所述磁性分離系統(tǒng)包括 (a)多個電磁體，被構造成生成圍繞多個區(qū)域且足以吸引所述混合物中的大部分磁化細胞的磁場通量；以及 (b)推進泵，以確定的和受控的流速在圍繞所述區(qū)域設置的管道內驅動所述混合物，從而通過所生成的磁通量將大部分的磁化細胞從所述混合物分離到管壁上，同時阻止其他細胞附著在所述管壁上。
2.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，保持細胞的活力包括產(chǎn)生所述磁場，同時避免對細胞的活力不利的散熱。
3.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)配置為，使稀有細胞與細胞流體混合物分離，所述細胞流體混合物具有的稀有細胞的豐度相對于其余細胞較低。
4.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，進一步包括 Ca)混合物容器，用于制備細胞流體混合物，以供應至所述管道； (b)樣品容器，用于盛放細胞樣品； (C)載體容器，用于盛放載液； (d)泵，用于獨立于所述推進泵而驅動所述細胞樣品和所述載液進入所述混合物容器。
5.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述管道圍繞所述區(qū)域而基本水平設置。
6.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，多個所述區(qū)域圍繞基本水平的平面設置，以便圍繞所述區(qū)域基本水平地設置所述管道。
7.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述管道圍繞所述區(qū)域基本豎直設置。
8.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述多個區(qū)域圍繞基本豎直平面設置，以圍繞所述區(qū)域基本水平地設置所述管道。
9.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，配置電磁體，以圍繞兩個區(qū)域生成磁通量。
10.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述管道圍繞多個連續(xù)區(qū)域接續(xù)地設置，每個區(qū)域配置為，連續(xù)地將殘留在所述流動混合物中的大部分磁化稀有細胞吸引到所述管壁上，同時阻止其他細胞附著在所述管壁上。
11.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，進一步包括用于促使分離的磁化細胞脫離所述管壁的至少一個機構。
12.根據(jù)權利要求11所述的系統(tǒng)，其中，所述機構包括，使所述電磁體和相應的區(qū)域消磁。
13.根據(jù)權利要求11所述的系統(tǒng)，其中，所述機構包括，使流體中的氣泡在所述管道內流動的設備。
14.根據(jù)權利要求11所述的系統(tǒng)，其中，所述機構包括使所述管道振動的設備。
15.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化細胞的至少50%的磁化細胞分離。
16.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化細胞的至少60%的磁化細胞分離。
17.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化細胞的至少70%的磁化細胞分離。
18.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化細胞的至少80%的磁化細胞分離。
19.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，使得提供包括初始存在于所述混合物中的磁化細胞的至少90%或更高的磁化細胞分離。
20.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，濃縮從所述混合物中回收的分離細胞的60%以上的磁化細胞。
21.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，濃縮從所述混合物中回收的分離細胞的70%以上的磁化細胞。
22.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，濃縮從所述混合物中回收的分離細胞的80%以上的磁化細胞。
23.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，濃縮從所述混合物中回收的分離細胞的90%以上的磁化細胞。
24.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，濃縮從所述混合物中回收的分離細胞的95%以上的磁化細胞。
25.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)被構造成，濃縮從所述混合物中回收的分離細胞的大約98%的磁化細胞。
26.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述流體混合物適于阻止非磁化細胞朝所述管壁移動，同時允許磁化細胞在圍繞所述區(qū)域的磁場通量的拉動下移動。
27.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述載液適于保持所述細胞的活力。
28.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述管道是生物相容的。
29.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述泵為蠕動泵。
30.根據(jù)權利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述磁通量為I特斯拉水平。
31.一種以定性定量的高產(chǎn)率使磁化細胞與細胞流體混合物分離且同時保持細胞的活力的方法，包括 (a)提供包括磁化細胞的細胞樣品；以及 (b)使載液中的細胞樣品的混合物在圍繞具有磁通量的磁化區(qū)設置的管道內流動，所述磁通量由電磁體生成，同時避免對所述細胞的活力不利的散熱，且足以從所述混合物中吸引大部分磁化細胞到所述管壁上，同時阻止其他細胞附著在所述管壁上，從而分離所述管壁上的磁化細胞。
32.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中，所述磁化細胞是豐度相對于所述混合物中的其余細胞較低的稀有細胞。
33.根據(jù)權利要求31所述的方法，進一步包括，終止所述磁通量并沖洗所述管道內的分離的磁化細胞。
34.根據(jù)權利要求33所述的方法，進一步包括，同時地或提前地啟動用于促使分離的磁化細胞脫離所述管壁的機構。
35.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中，所述機構包括使所述電磁體和相應的區(qū)域消磁。
36.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中，所述機構包括使流體中的氣泡在所述管道內流動的設備。
37.根據(jù)權利要求34所述的方法，其中，所述機構包括使所述管道振動的設備。
38.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中，磁化區(qū)域包括多個區(qū)域。
39.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中，區(qū)域包括多個連續(xù)區(qū)域，所述管道接續(xù)地設置在所述區(qū)域上，且每個區(qū)域配置為，連續(xù)地將殘留在所述流動混合物中的大部分磁化細胞吸引到所述管壁上，同時阻止其他細胞附著在所述管壁上。
全文摘要
一種配置為以定性定量的高產(chǎn)率使磁化細胞與細胞混合物分離的磁性分離系統(tǒng)，包括至少一個電磁體，被構造成生成圍繞多個分離區(qū)且足以吸引混合物中的大部分磁化細胞的磁場通量；和泵，用于以受控流速驅動細胞混合物通過設置在所述區(qū)域內的管道，從而使大部分磁化細胞與混合物分離。所述系統(tǒng)特別適用于如下情形；從稀有細胞的豐度相對于其余細胞較低的細胞流體混合物獲得稀有細胞，且同時保持細胞活力。
文檔編號C12M1/00GK102762712SQ201180006892
公開日2012年10月31日 申請日期2011年1月20日 優(yōu)先權日2010年1月21日
發(fā)明者科弗·克萊因, 阿哈龍·拉米什 申請人:百賽普有限公司