專利名稱：：微生物中酶活性的誘導(dǎo)和穩(wěn)定的制作方法微生物中酶活性的誘導(dǎo)和穩(wěn)定背景微生物和它們的酶已經(jīng)在多種產(chǎn)品的制備中用作生物催化劑。酵母在糖發(fā)酵成醇中的作用是立即可想到的例子。近年來，在通常認(rèn)為不適合使用酶的商業(yè)活動(dòng)中使用微生物及其酶的興趣正日益增長(zhǎng)。一個(gè)例子是在工業(yè)過程，尤其在廢棄產(chǎn)物的處理中使用微生物。穩(wěn)定性，作為實(shí)用生物催化劑的關(guān)鍵要素，已經(jīng)成為在多種商業(yè)應(yīng)用中使用腈水合酶和/或酰胺酶的明顯障礙。盡管固定劑和化學(xué)穩(wěn)定劑是用于改善酶穩(wěn)定性的認(rèn)可手段，但是目前的固定和穩(wěn)定技術(shù)仍需要進(jìn)一步發(fā)展。概述本發(fā)明提供了用于誘導(dǎo)和穩(wěn)定酶活性的方法。任選地，酶處于能夠產(chǎn)生所述酶的微生物中。在一些實(shí)施方案中，酶可以是腈水合酶、酰胺酶或天冬酰胺酶I。提供的是包含具有受誘導(dǎo)和/或穩(wěn)定的活性的酶或微生物的組合物。還提供的是通過使植物或植物部分暴露于具有受誘導(dǎo)和/或穩(wěn)定的活性的酶或微生物而延遲植物發(fā)育過程的方法。一個(gè)或多個(gè)方面的細(xì)節(jié)在下文附圖和描述中闡述。其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將從本描述和附圖及從權(quán)利要求書中顯而易見。附圖簡(jiǎn)述圖I顯示了說明通過在藻酸鈣中固定對(duì)腈水合酶活性所提供的穩(wěn)定作用的圖。圖2顯示了說明通過在聚丙烯酰胺中固定對(duì)腈水合酶活性所提供的穩(wěn)定作用的圖。圖3顯示這樣的圖，其說明通過在硬化的聚乙烯亞胺交聯(lián)的藻酸鈣或聚丙烯酰胺中固定對(duì)腈水合酶活性所提供的穩(wěn)定作用。圖4顯示了說明通過戊二醛交聯(lián)固定對(duì)腈水合酶活性所提供的穩(wěn)定作用的圖。圖5顯示了說明在用天冬酰胺誘導(dǎo)的紅球菌(Rhodococcussp.)DAP96253細(xì)胞中的天冬酰胺酶I活性的圖。圖6顯示了在55°C于紅球菌DAP96253細(xì)胞中對(duì)腈水合酶活性的穩(wěn)定作用，其中所述的DAP96253細(xì)胞在補(bǔ)充有葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精的YEMEA上培育并且用鈷和脲誘導(dǎo)。圖7顯示了在55°C于紅球菌DAP96253細(xì)胞中對(duì)腈水合酶活性的穩(wěn)定作用，其中所述DAP96253細(xì)胞在補(bǔ)充有葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精的YEMEA上培育；用鈷和脲誘導(dǎo)并且用海藻糖穩(wěn)定。詳述如本文中所用，除非上下文另外清楚地說明，否則單數(shù)形式“一個(gè)(a)”、“一種(an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)稱謂。在整個(gè)說明書中，詞語(yǔ)“包含”或其語(yǔ)法變型，將理解為表明包括所述要素、整數(shù)或步驟或者所述要素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其它要素、整數(shù)或步驟或任何其它要素、整數(shù)或步驟的組。本發(fā)明提供的是通過使用包含海藻糖和任選的含酰胺氨基酸的培養(yǎng)基和組合物誘導(dǎo)和穩(wěn)定微生物中酶活性的方法。通常，產(chǎn)生腈水合酶的微生物用于誘導(dǎo)眾多有用酶的產(chǎn)生。例如，本發(fā)明提供的是用于在產(chǎn)生腈水合酶的微生物中誘導(dǎo)選自腈水合酶活性、酰胺酶活性、天冬酰胺酶I活性及其組合的酶活性的方法，包括在包含海藻糖和任選的一種或多種含酰胺氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物。還提供的是用于改善多種酶如腈水合酶、天冬酰胺酶I和酰胺酶的穩(wěn)定的方法。例如，提供的是用于穩(wěn)定酶或能夠產(chǎn)生所述酶的微生物中所需活性的方法，所述方法包括將所述酶或能夠產(chǎn)生所述酶的微生物與包含海藻糖和一種或多種含酰胺氨基酸的組合物接觸，其中所述酶選自腈水合酶、酰胺酶和天冬酰胺酶I。提供的是隨時(shí)間推移可以維持商業(yè)有用水平的酶活性的生物脫毒催化劑(尤其摻入酶，如腈水合酶和酰胺酶)。生物脫毒催化劑尤其具有以下特征如本文所述，該生物催化劑的酶活性可以由其環(huán)境誘導(dǎo)并穩(wěn)定。本發(fā)明中公開的方法可以用來誘導(dǎo)具有在實(shí)用生物脫毒催化劑中有用的水平和穩(wěn)定性的酶活性。所述方法還以這樣的能力為特征從包括(但不限于)革蘭氏陽(yáng)性微生物的微生物中誘導(dǎo)更高水平的天冬酰胺酶I的能力和改善這種天冬酰胺酶I活性的穩(wěn)定性的能力。如本文所用，酶活性通常指酶在某過程(如一種化合物轉(zhuǎn)化成另一個(gè)化合物)中充當(dāng)催化劑的能力。同樣，本文中所指的所需活性可以包括由一種或多種微生物活性表達(dá)的一種或多種酶的活性。具體地說，腈水合酶催化腈(或羥腈)水解成相應(yīng)的酰胺(或羥酸)。酰胺酶催化酰胺水解成相應(yīng)的酸或羥酸。類似地，天冬酰胺酶(如天冬酰胺酶I)催化天冬酰胺水解成天冬氨酸?；钚钥梢园疵抠|(zhì)量酶或細(xì)胞(一般基于細(xì)胞的干重，例如單位/mgcdw)“單位”來提及?！皢挝弧蓖ǔＶ冈谙薅ǖ囊唤M條件下，作為時(shí)間的函數(shù)，將特定含量的化合物轉(zhuǎn)化成不同化合物的能力。任選地，一個(gè)“單位”的腈水合酶活性可以指在PH7.0和30°C的溫度下每分鐘每毫克細(xì)胞(干重)將IUmol丙烯腈轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)酰胺的能力。類似地，一個(gè)“單位”的酰胺酶活性可以指在PH7.0和30°C的溫度下每分鐘每毫克細(xì)胞(干重)將IUmol丙烯酰胺轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)酸的能力。此外，一個(gè)“單位”的天冬酰胺酶I活性可以指在PH7.0和30°C的溫度下每分鐘每毫克細(xì)胞(干重)將IUmol天冬酰胺轉(zhuǎn)化成其相應(yīng)酸的能力。所述方法是特別有利的，在于微生物的誘導(dǎo)和穩(wěn)定可以在不需要向環(huán)境中導(dǎo)入危害性腈類如丙烯腈的情況下完成。先前，認(rèn)為某些微生物中特定酶活性的誘導(dǎo)要求添加化學(xué)誘導(dǎo)物。例如，在玫瑰紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)和綠針假單胞菌(Pseudomonaschloroaphis)中誘導(dǎo)腈水合酶活性時(shí),通常需要至補(bǔ)充危害性化學(xué)品，如乙腈、丙烯腈、丙烯酰胺等。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生腈水合酶的微生物中的高酶活性可以通過使用非危害性培養(yǎng)基添加物如海藻糖和任選的含酰胺氨基酸及其衍生物而誘導(dǎo)并穩(wěn)定。任選地，天冬酰胺、谷氨酰胺或其組合可以用作誘導(dǎo)物，同時(shí)完全排除危害性化學(xué)品如乙腈、丙烯腈、丙烯酰胺等。因此，提供的是用于產(chǎn)生商業(yè)有用的酶和微生物及它們?cè)谄渌椒ㄖ械挠猛?如用于廢物流脫毒)的更安全方法。誘導(dǎo)并穩(wěn)定微生物中酶活性的更安全方法在美國(guó)專利No.7，531，343和美國(guó)專利No.7，531，344中描述，所述專利通過引用的方式并入本文。優(yōu)選地，使用如本文所述的改良培養(yǎng)基、固定和穩(wěn)定技術(shù)，所公開的方法提供了眾多酶和能夠產(chǎn)生所述酶的微生物的產(chǎn)生和穩(wěn)定性的顯著增加。例如，可以通過使用包含海藻糖和任選的含酰胺氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基增加誘導(dǎo)和穩(wěn)定。用于本發(fā)明所提供的方法中的產(chǎn)生腈水合酶的微生物包括但不限于選自假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、諾卡氏菌屬(Nocardia)及其組合的細(xì)菌。任選地，產(chǎn)生腈水合酶的微生物來自紅球菌屬。任選地，來自紅球菌屬的微生物是玫瑰紅紅球菌DAP96622、紅球菌DAP96523或其組合。示例性生物包括但不限于綠針假單胞菌(Pseudomonaschloroaphis)(ATCC43051)(革蘭氏陽(yáng)性)、綠針假單胞菌(ATCC13985)(革蘭氏陽(yáng)性)、紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)(ATCC47072)(革蘭氏陽(yáng)性)和酮戍二酸短桿菌(Brevibacteriumketoglutamicum)(ATCC21533)(革蘭氏陽(yáng)性)。諾卡氏菌和假諾卡氏菌種類的例子已經(jīng)在歐洲專利No.375091；Collins和KnowlesJ.Gen.Microbiol.129711-718(1983)；HarperBiochem.J.165:309-319(1977)；HarperInt.J.Biochem.17677-683(1985);Linton和KnowlesJGen.Microbiol.132:1493-1501(1986)JPYamaki等人，J.Ferm.andBioeng.83:474-477(1997)中描述。提供的是用于培育微生物、尤其產(chǎn)生腈水合酶的微生物的方法、用于誘導(dǎo)微生物中所需酶活性的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括在包含海藻糖和任選的一種或多種含酰胺氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生腈水合酶的微生物。任選地，公開了用于使用補(bǔ)充有海藻糖和任選的含酰胺氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基誘導(dǎo)腈脫毒活性的方法，所述培養(yǎng)基優(yōu)選地包含天冬酰胺、谷氨酰胺或其組合。更具體地，所述方法包括在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物并任選地收集培養(yǎng)的微生物或由微生物產(chǎn)生的酶。公開的方法特別用于誘導(dǎo)所需的酶活性。多種類型的微生物(包括本文所述的那些)能夠產(chǎn)生具有多種活性的多種酶。如本領(lǐng)域中通常理解，微生物培育中所誘導(dǎo)的酶活性類型可以根據(jù)所用的微生物菌株、所用的培育方法和隨生長(zhǎng)培養(yǎng)基一起使用的補(bǔ)充物而變動(dòng)。本發(fā)明中公開的方法和組合物允許通過使用海藻糖和任選的含酰胺氨基酸或其衍生物誘導(dǎo)多種酶活性。任選地，公開的方法和組合物允許誘導(dǎo)選自腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶I的一種或多種酶。在一些實(shí)施方案中，公開的方法和組合物允許同時(shí)誘導(dǎo)腈水合酶和酰胺酶。這用于例如工業(yè)應(yīng)用，如處理含腈廢物流。該處理要求將腈轉(zhuǎn)化成酰胺的第一處理和將酰胺轉(zhuǎn)化成酸的第二處理。同時(shí)產(chǎn)生腈水合酶和酰胺酶的能力將不再需要分別制備所述酶并且允許進(jìn)行單一處理步驟。在提供的方法中，酶的誘導(dǎo)和穩(wěn)定以在不使用危害性腈類的情況下實(shí)現(xiàn)。多種類型的酶活性如腈水合酶活性的誘導(dǎo)在傳統(tǒng)上包括補(bǔ)充腈類如乙腈、丙烯腈、琥珀腈等。另夕卜，如果需要多重誘導(dǎo)(即，誘導(dǎo)單一酶的活性以降解兩個(gè)或更多個(gè)類型的腈類)，則通常需要包含兩個(gè)或更多個(gè)類型的危害性腈類。源自使用海藻糖和/或一種或多種含酰胺氨基酸或其衍生物作為酶誘導(dǎo)物和穩(wěn)定劑的所公開方法不再需要危害性化學(xué)品來促進(jìn)單一或多重酶誘導(dǎo)。尤其，本發(fā)明中的方法是有益的原因在于，通過在培養(yǎng)基或混合物中使用海藻糖和/或一種或多種含酰胺氨基酸或其衍生物，多重誘導(dǎo)和穩(wěn)定是可能的。因此，公開的方法特別用于制備具有用于降解多種含腈化合物的活性的酶或微生物。另外，所述方法提供了使多種腈類或酰胺如具有單個(gè)C=N部分的腈類、二腈類(具有兩個(gè)C=N部分的化合物)或具有多個(gè)腈基部分的化合物(例如，丙烯醛羥腈)脫毒的能力。此類酶或微生物在本文中稱作被多重誘導(dǎo)。盡管公開的方法消除了需要危害性化學(xué)品以誘導(dǎo)酶活性，但是不排除其他此類誘導(dǎo)物的使用。例如，一種或多種腈類可以用來輔助特性活性形成。補(bǔ)充有琥珀腈和鈷的培養(yǎng)基可用于酶(包括例如腈水合酶、酰胺酶和天冬酰胺酶I)的誘導(dǎo)。然而，腈類的使用不是誘導(dǎo)酶活性必需的。盡管使用腈類和其他危害性化學(xué)品當(dāng)然不是優(yōu)選的，然而任選地，此類使用是可能的。任選地，所述方法和組合物尤其以下述能力為特征誘導(dǎo)比使用先前已知方法時(shí)可能達(dá)到的活性更大的所需活性。使用本發(fā)明提供的方法，受誘導(dǎo)的產(chǎn)生腈水合酶的微生物具有的酶活性大于或等于在包含含腈化合物的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)時(shí)同一種酶的活性。例如，受誘導(dǎo)的產(chǎn)生腈水合酶的微生物具有的酶活性比在包含含腈化合物的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)時(shí)同一種酶的活性大至少5%。任選地，產(chǎn)生的腈水合酶活性比通過用含腈化合物誘導(dǎo)在相同微生物中產(chǎn)生的活性大至少10%、至少12%或至少15%。、酶處理廢水的商業(yè)用途以及多種酶的其他商業(yè)用途通常受到誘導(dǎo)的活性不穩(wěn)定限制。例如，新鮮細(xì)胞一般將在25°C的溫度在24小時(shí)內(nèi)喪失它們初始活性的至少50%。因此，當(dāng)細(xì)胞欲用作催化劑時(shí)，細(xì)胞必須在需要時(shí)產(chǎn)生并且不能為將來使用而貯存。腈水合酶活性可以通過添加含腈化合物來穩(wěn)定；然而，這又不得不使用不希望的危害性化學(xué)品。所公開的方法和組合物解決這個(gè)問題。例如，具有經(jīng)誘導(dǎo)的腈水合酶活性的細(xì)胞可以在不需要危害性化學(xué)品的情況下穩(wěn)定，從而細(xì)胞具有有效酶活性持續(xù)至多到一年的時(shí)間段。因此，所公開的方法和組合物使酶或能夠產(chǎn)生此類酶的微生物穩(wěn)定，從而將酶的活性充分延長(zhǎng)超過有用活性的常見時(shí)間段。因此，提供的是用于穩(wěn)定酶或能夠產(chǎn)生所述酶的微生物中所述活性的方法。此類方法包括使酶或能夠產(chǎn)生所述酶的微生物與海藻糖和任選的一種或多種含酰胺氨基酸接觸。海藻糖和含酰胺氨基酸或其衍生物可以例如在培養(yǎng)該微生物時(shí)添加至所述微生物，或可以添加至包含所述微生物或酶的混合物。任選地，將該酶或能夠產(chǎn)生所述酶的微生物的所需活性穩(wěn)定，從而所需活性在25°C的溫度至少30天的時(shí)間后維持在由該酶或能夠產(chǎn)生該酶的微生物所表現(xiàn)的初始活性的至少約50%水平?？梢酝ㄟ^固定方法如附加、包封和交聯(lián)法實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步穩(wěn)定，從而延長(zhǎng)在其間可以使用酶活性的時(shí)間。因此，所述方法還包括至少部分地固定該微生物。穩(wěn)定作用可以通過固定酶或產(chǎn)生該酶的微生物來提供。例如，從微生物收獲的酶或受誘導(dǎo)的微生物本身可以被固定至基質(zhì)，作為穩(wěn)定受誘導(dǎo)活性的手段。任選地，產(chǎn)生腈水合酶的微生物是至少部分固定的。任選地，酶或微生物至少部分地包封于基質(zhì)內(nèi)或位于其表面上。這允許以這樣的方式提供具有誘導(dǎo)活性的固定化材料(例如，催化劑)，從而促進(jìn)該催化劑與預(yù)期物質(zhì)的反應(yīng)和所述產(chǎn)物的回收，同時(shí)使催化劑留在反應(yīng)介質(zhì)中并且保持反應(yīng)性模式。可以使用通常用于附加酶或微生物的任何基質(zhì)。任選地，該基質(zhì)包括藻酸或其鹽。藻酸是具有分別以((1-4)-連接的P-D-甘露糖醛酸(M)和其C-5差向異構(gòu)體a-L-古洛糖醛酸(G)殘基的均聚嵌段的線性共聚物，所述均聚嵌段以不同順序或嵌段共價(jià)地連接在一起。所述單體可以出現(xiàn)在連續(xù)G殘基(G嵌段)、連續(xù)M殘基(M嵌段)、交替M和G殘基(MG嵌段)的均聚嵌段中或者無(wú)規(guī)組織的嵌段中。任選地，藻酸鈣用為基質(zhì)。藻酸鈣可以例如是交聯(lián)的，如與聚乙烯亞胺交聯(lián)，以形成硬化的藻酸鈣基質(zhì)。此類固定技術(shù)的進(jìn)一步描述可以在Bucke,“CellImmobilizationinCalciumAlginate,MethodsinEnzymology,第135卷，B部分(K.Mosbach編著)，第175-189頁(yè)(1987)中找到，所述文獻(xiàn)通過引用方式并入本文。在圖I中說明并且在以下實(shí)施例2中進(jìn)一步描述使用聚乙烯亞胺交聯(lián)的藻酸鈣的固定的穩(wěn)定作用。任選地，該基質(zhì)包含酰胺聚合物?？梢允褂冒粋€(gè)或多個(gè)酰胺基團(tuán)的任何聚合物。任選地，該基質(zhì)包含聚丙烯酰胺聚合物。在圖2中說明并且在以下實(shí)施例3中進(jìn)一步描述使用聚丙烯酰胺的固定的穩(wěn)定作用。穩(wěn)定可以進(jìn)一步通過交聯(lián)實(shí)現(xiàn)。例如，可以將誘導(dǎo)的微生物化學(xué)地交聯(lián)以形成細(xì)胞的凝集體。任選地，誘導(dǎo)的微生物使用戊二醛交聯(lián)。例如，微生物可以懸浮在去離子水和戊二醛的混合物中；隨后添加聚乙烯亞胺直到實(shí)現(xiàn)最大絮凝。交聯(lián)的微生物(一般為許多細(xì)胞形成的顆粒形式)可通過簡(jiǎn)單的過濾進(jìn)行收獲。在Lopez-Gallego等人，J.Biotechnol.119=70-75(2005)中提供對(duì)此類技術(shù)的進(jìn)一步描述，所述文獻(xiàn)通過引用方式并入本文。戊二醛交聯(lián)的穩(wěn)定作用在圖4中說明并且在實(shí)施例5中進(jìn)一步描述。任選地，所述微生物可以包囊化而不允許保持經(jīng)典的布朗運(yùn)動(dòng)。這種包囊促進(jìn)所述微生物的收集、保持和再使用，并且通常包括將所述微生物附加至基質(zhì)。這種附加也可以如上文所述，促進(jìn)所述微生物的穩(wěn)定，或者可以僅促進(jìn)便捷處置誘導(dǎo)的微生物或酶。所述微生物可通過通常認(rèn)可的用于固定微生物的任何方法，如吸附法、靜電鍵合法和共價(jià)結(jié)合法等固定。通常，所述微生物固定在有助于從混合物或溶液(如脫毒反應(yīng)混合物)中回收所述微生物的固相支持物。合適的固相支持物包括、但不限于顆粒狀活性炭、混合料、木材或木制品(例如，紙、木屑、木塊、破碎的墊料或樹)、金屬或金屬氧化物顆粒(例如氧化鋁、釕、氧化鐵)、離子交換樹脂、DEAE纖維素、DEAE-SEPHADEX聚合物、陶瓷珠、交聯(lián)的聚丙烯酰胺珠、方塊(cube)、金屬小球或其他凝膠形式、藻酸鹽珠子、K-角叉菜膠方塊，以及由于固有磁性而能從水溶液中回收的固體顆粒。催化劑的形狀是可變的(原因在于所述顆粒狀實(shí)體的所需動(dòng)力學(xué)性質(zhì)與影響催化劑活性的體積/表面積關(guān)系相結(jié)合)。任選地，誘導(dǎo)的微生物固定在已經(jīng)用聚乙烯亞胺交聯(lián)的藻酸鹽珠內(nèi)或固定在聚丙烯酰胺聚合物中。另外，提供的是可以在所公開的方法中使用的以及用于產(chǎn)生多種裝置如生物濾池的組合物。任選地，所述組合物包含(a)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其包含海藻糖和任選的一種或多種含酰胺氨基酸或其衍生物；(b)—種或多種酶微生物；和(c)一種或多種酶。任選地，所述酶選自腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶I及其組合。任選地，一種或多種微生物包括選自假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、諾卡氏菌(Nocardia)、假單胞菌(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、短桿菌屬(Brevibacterium)及其組合中的細(xì)菌。例如，所述微生物來自紅球菌屬。任選地，來自紅球菌屬的微生物是玫瑰紅紅球菌DAP96622、紅球菌DAP96523或其組合。任選地，所述微生物是至少部分固定的。如本文所述，提供的組合物和方法包括使用海藻糖。海藻糖在所提供方法中使用的組合物或培養(yǎng)基中的濃度可以是至少I克/升(g/L)。任選地，海藻糖的濃度在lg/L至50g/L或lg/L至10g/L的范圍內(nèi)。任選地，海藻糖在培養(yǎng)基中的濃度是至少4g/L。任選地，在所提供方法中使用的組合物和培養(yǎng)基還包含一種或多種含酰胺氨基酸或其衍生物。含酰胺氨基酸可以例如選自天冬酰胺、谷氨酰胺、其衍生物或其組合。例如，含酰胺氨基酸可以包括天然形式的天冬酰胺、無(wú)水天冬酰胺、天冬酰胺一水合物、天然形式的谷氨酰胺、無(wú)水谷氨酰胺和/或谷氨酰胺一水合物，每種均為L(zhǎng)-異構(gòu)體或D-異構(gòu)體形式。含酰胺氨基酸或其衍生物在培養(yǎng)基中的濃度可以根據(jù)所需的最終培養(yǎng)結(jié)果變動(dòng)。例如，培養(yǎng)可以為產(chǎn)生具有特定酶活性的微生物的目的而實(shí)施。任選地，培養(yǎng)可以為形成特定酶并從培養(yǎng)的微生物收集特定酶的目的而實(shí)施。任選地，培養(yǎng)可以為形成并收集具有相同或不同活性和功能的多種酶的目的而實(shí)施。添加至生長(zhǎng)培養(yǎng)基或混合物的含酰胺氨基酸或其衍生物的量通?？梢曰谂囵B(yǎng)基或混合物的總重量是多達(dá)每百萬(wàn)份10，000(ppm)(S卩，以重量計(jì)1%)。然而，本發(fā)明方法是特別有益的，在于酶活性可以通過添加甚至更少的量來誘導(dǎo)。任選地，一種或多種含酰胺氨基酸是以至少50ppm的濃度存在。通過其他例子，含酰胺氨基酸或其衍生物的濃度在50ppm至5，OOOppm、IOOppm至3，000ppm>200ppm至2，000ppm>250ppm至1500ppm、500ppm至1250ppm或500ppm至IOOOppm的范圍內(nèi)。任選地，將海藻糖和含酰胺氨基酸或其衍生物添加至營(yíng)養(yǎng)完整培養(yǎng)基。合適的營(yíng)養(yǎng)完整培養(yǎng)基通常是可以為微生物供應(yīng)其生長(zhǎng)所要求的必需養(yǎng)分的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，所述必需養(yǎng)分最少包括碳源和/或氮源。一個(gè)具體例子是市售可得的R2A瓊脂培養(yǎng)基，其一般由瓊月旨、酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、葡萄糖、可溶性淀粉、丙酮酸鈉、磷酸氫二鉀和硫酸鎂組成。營(yíng)養(yǎng)完整液體培養(yǎng)基的另一個(gè)例子酵母提取物麥芽提取物瓊脂(YEMEA)，其由葡萄糖、麥芽提取物和酵母提取物(但是特別排除瓊脂)組成。本領(lǐng)域已知的任何營(yíng)養(yǎng)完整培養(yǎng)基可以用于所公開的方法，以上培養(yǎng)基僅出于示例目的而描述。可以在本文所述的組合物中包括此類營(yíng)養(yǎng)完整培養(yǎng)基。任選地，公開的組合物和培養(yǎng)基可以含有其他添加物。一般，其他補(bǔ)充物或養(yǎng)分是用于輔助細(xì)胞生長(zhǎng)更多的、更多細(xì)胞質(zhì)量或加速生長(zhǎng)的那些。例如，組合物和培養(yǎng)基可以包含除營(yíng)養(yǎng)完整培養(yǎng)基中已經(jīng)存在的任何碳水化合物源之外的碳水化合物源。如上文所述,大部分培養(yǎng)基一般含有某個(gè)含量的碳水化合物(例如,葡萄糖)；然而，可能有用是包含額外的碳水化合物源。提供的過量碳水化合物的類型可以取決于所需的培養(yǎng)結(jié)果。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)添加糖如麥芽糖或麥芽糊精提供改進(jìn)的天冬酰胺酶I誘導(dǎo)和改進(jìn)的腈水合酶穩(wěn)定性。任選地，組合物和培養(yǎng)基還包含鈷。鈷或其鹽可以添加至所述混合物或培養(yǎng)基。例如，添加鈷(例如，氯化鈷)至培養(yǎng)基可以對(duì)于增加由培養(yǎng)的微生物產(chǎn)生的酶的量特別有用。鈷或其鹽可以例如添加至培養(yǎng)基，從而鈷濃度是多達(dá)IOOppm的量。鈷可以例如以5ppm至lOOppm、IOppm至75ppm、IOppm至50ppm、或IOppm至25ppm的濃度存在。任選地，組合物和培養(yǎng)基還包含脲。脲或其鹽可以添加至所述混合物或培養(yǎng)基。脲或其鹽可以例如添加至培養(yǎng)基，從而脲濃度處于直至IOg/的量。脲可以例如以5g/L至100g/L、10g/L至75g/L、10g/L至50g/L或10g/L至25g/L的濃度存在。任選地，脲以7.5g/L的濃度存在。所述組合物和培養(yǎng)基也可以包括其他組分。例如，其他合適的培養(yǎng)基組分可以包括商用添加物，如棉籽蛋白、麥芽糖、麥芽糊精和其他商業(yè)糖。任選地，培養(yǎng)基還包含麥芽糖或麥芽糊精。麥芽糖或麥芽糊精，例如，可以添加至培養(yǎng)基以使麥芽糖或麥芽糊精濃度是至少lg/L。任選地，麥芽糖或麥芽糊精可以按的濃度存在。任選地，所述組合物和培養(yǎng)基不含任何含腈化合物。在培養(yǎng)基中先前需要腈化合物以誘導(dǎo)針對(duì)兩種或更多種腈化合物的酶活性。本文所述的組合物通過使用完全安全的海藻糖和/或含酰胺氨基酸或其衍生物實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)；因此，培養(yǎng)基可以不含有任何含腈化合物?？梢耘嘤喾N微生物以用于所提供的方法和組合物中。通常，如本文所述，可以使用能夠產(chǎn)生酶活性的任何微生物。任選地，所述微生物能夠產(chǎn)生腈水合酶。如本文所用，產(chǎn)生腈水合酶的微生物意指盡管通常認(rèn)為能夠產(chǎn)生腈水合酶，但還能夠產(chǎn)生一種或多種其他酶的微生物。另外，大多數(shù)微生物能夠產(chǎn)生多種酶，此類產(chǎn)生經(jīng)常由微生物的環(huán)境決定。因此，盡管用于本文中的微生物可以作為產(chǎn)生腈水合酶的微生物公開,然而此類語(yǔ)言僅指此類微生物產(chǎn)生腈水合酶的已知能力并且不限制該微生物僅產(chǎn)生腈水合酶。相反，產(chǎn)生腈水合酶的微生物是能夠產(chǎn)生至少腈水合酶(即，能夠產(chǎn)生腈水合酶或腈水合酶以及一種或多種其他酶)的微生物。眾多產(chǎn)生腈水合酶的微生物是本領(lǐng)域已知的。例如，屬于諾卡氏菌屬[見日本專利申請(qǐng)No.54-129190]、紅球菌屬[見日本專利申請(qǐng)No.2-470]、根瘤菌屬(Rhizobium)[見曰本專利申請(qǐng)No.5-236977]、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)[曰本專利申請(qǐng)No.5-30982]、氣單胞菌屬(Aeromonas)[日本專利申請(qǐng)No.5-30983]、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)[日本專利申請(qǐng)No.8-154691]、芽孢桿菌屬(Bacillus)[日本專利申請(qǐng)No.8-187092]、假諾卡氏菌屬[日本專利申請(qǐng)No.8-56684]和假單胞菌屬的細(xì)菌是可以使用的產(chǎn)生腈水合酶的微生物的非限制性例子。任選地，產(chǎn)生腈水合酶的微生物包括來自紅球菌屬的細(xì)菌。另外，微生物的具體例子包括，但不限于，諾卡氏菌物種(Nocardiasp.)、紅球菌(Rhodococcussp.)、玫瑰紅紅球菌、克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、氣單胞菌Aeromonassp.)、弗氏朽1樣酸桿菌(Citrobacterfreundii)、發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、黃黃色桿菌(Xanthobacterflavas)、流黑歐文氏菌(ErwinianigrifIuens)、腸桿菌(Enterobactersp.)、鏈霉菌(Streptomycessp.)、根瘤菌(rhizobiumsp.)、百脈根根瘤菌(Rhizobiumloti)、豌豆根瘤菌(Rhizobiumlegminosarum)、根瘤菌屬(Rhizobiummerioti)、高里假絲酵母(Candidaguilliermondii)、成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亞種(Klebsiellapneumoniaesubsp.pneumoniae)、放身寸形土壤桿菌(Agrobacteriumradiobacter)、史密氏芽抱桿菌(Bacillussmithii)、嗜熱假諾卡氏菌屬(Pseudonocardiathermophila)、綠針假單胞菌、紅色假單胞菌(Pseudomonaserythropolis)、酮戍二酸短桿菌、紅串紅球菌和嗜熱假諾卡氏菌。任選地，使用的微生物可以例如包括紅球菌DAP96253和DAP96255和玫瑰紅紅球菌DAP96622及其組合。任選地，所述微生物也可以包括轉(zhuǎn)化體。具體而言，轉(zhuǎn)化體可以是其中插入和表達(dá)從已知包括這種基因的微生物中克隆的腈水合酶基因的任何宿主。例如，美國(guó)專利No.5，807，730描述了大腸桿菌作為階-10822細(xì)菌菌株(FERMBP-5785)的宿主的用途。當(dāng)然，其他類型基因修飾的細(xì)菌可以在本發(fā)明中使用，只要所述細(xì)菌能夠產(chǎn)生如本文所述的一種或多種酶。給定的屬內(nèi)全部種類不都顯示相同類型的酶活性和/或生產(chǎn)。因此，可能具有這樣的屬，所述屬已知包括能夠顯示所需活性的菌株，但是具有通常不顯示出所需活性的一個(gè)或多個(gè)種類。因此，宿主微生物可以包括不具體知道具有所需活性，但是來自下述屬的細(xì)菌菌株，其中所述屬已知具有能夠產(chǎn)生所需活性的特定菌株。此類菌株可以具有轉(zhuǎn)移至其中的用以引起所需活性的一個(gè)或多個(gè)基因。此類菌株的非限制性例子包括馬紅球菌(Rhodococcusequi)和球狀紅球菌(Rhododoccusgloberulus)PffDl微生物可以選自已知來源或可以包含新分離的微生物。任選地，可以通過在海藻糖和/或一種或多種含酰胺氨基酸或其衍生物存在下培養(yǎng)菌株，分離微生物并且將其鑒定為有用的微生物菌株?；诒景l(fā)明的多重誘導(dǎo)后使腈類混合物或腈與酰胺化合物的混合物或酰胺混合物脫毒成為相應(yīng)的酰胺和/或酸的能力，微生物可以從已知的來源分離或選出或獲得或可以從未來來源中篩選。確定微生物是否有用的測(cè)定法是本領(lǐng)域已知的。例如，可以通過檢測(cè)游離氨確定腈水合酶或酰胺酶活性的存在。見Fawcett和Scott,“ARapidandPreciseMethodfortheDeterminationofUrea(用于測(cè)定服的快速和精確方法)”J.Clin.Pathol.13:156-9(1960)，所述文獻(xiàn)通過引用方式并入本文。可以為實(shí)現(xiàn)最佳生物量培養(yǎng)和收獲微生物。在某些例子中，如在瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí)，微生物可以培養(yǎng)至少24小時(shí)時(shí)間，但是通常少于六天。在發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，微生物優(yōu)選地在極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)I小時(shí)至48小時(shí)，I小時(shí)至20小時(shí)或16小時(shí)至23小時(shí)時(shí)間。如果需要更多的生物量，微生物可以在發(fā)酵罐中培養(yǎng)更長(zhǎng)時(shí)間。在培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束時(shí)，一般例如通過刮取、離心、過濾或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他方法收集和濃縮培養(yǎng)的微生物。微生物可以在其他指明的條件下培養(yǎng)。例如，培養(yǎng)優(yōu)選地在3.0和11.0之間，更優(yōu)選地在6.0和8.0之間的pH上實(shí)施。進(jìn)行培養(yǎng)的溫度優(yōu)選地在4°C和55°C之間，更優(yōu)選地在15°C和37°C之間。此外，溶解氧張力優(yōu)先在0.1%和100%之間，優(yōu)選地在4%和80%之間和更優(yōu)選地在4%和30%之間。溶解氧張力可以進(jìn)行監(jiān)測(cè)并且通過以環(huán)境空氣、純氧、過氧化物和任選釋放氧的其他組合物的形式供應(yīng)氧而維持于所需范圍內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明中公開的方法還可能將微生物培育和酶活性誘導(dǎo)的步驟分開。例如，可以在不包含對(duì)誘導(dǎo)酶活性必需的補(bǔ)充的第一培養(yǎng)基上培育一種或多種微生物。這種第一培養(yǎng)基可以稱作微生物的生長(zhǎng)期培養(yǎng)基。在第二期(即，誘導(dǎo)期)中，培養(yǎng)的微生物可以轉(zhuǎn)移至包含包含對(duì)誘導(dǎo)酶活性必需的補(bǔ)充的第二培養(yǎng)基。如本文所述，這種第二培養(yǎng)基將優(yōu)先地包含海藻糖和/或一種或多種含酰胺氨基酸或其衍生物。類似地，誘導(dǎo)補(bǔ)充物可以在培養(yǎng)所需微生物期間的任何時(shí)間添加。例如，培養(yǎng)基可以在開始培養(yǎng)微生物之前補(bǔ)充海藻糖和/或含酰胺氨基酸或其衍生物?；蛘撸⑸锟梢栽谂囵B(yǎng)基上培育預(yù)定量的時(shí)間以生長(zhǎng)所述微生物，并且可以一個(gè)或多個(gè)預(yù)定時(shí)間添加海藻糖和/或含酰胺氨基酸或其衍生物以在微生物中誘導(dǎo)所需的活性。另外，可以將海藻糖和/或含酰胺氨基酸或其衍生物添加至生長(zhǎng)培養(yǎng)基(或至包含事先培育的微生物的獨(dú)立混合物)以在微生物的生長(zhǎng)完成后在微生物中誘導(dǎo)所需的活性。提供的是通過將腈類轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酰胺或酸而使腈類混合物脫毒的方法。任選地，所述方法包括施加降解腈的微生物的培養(yǎng)物至腈類混合物和用海藻糖和/或含有酰胺的氨基酸或其衍生物的混合物多重誘導(dǎo)所述微生物持續(xù)足夠量的時(shí)間以將腈類轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酰胺?？蛇x擇地，所述方法包括施加多重誘導(dǎo)的微生物至腈類混合物持續(xù)足夠量的時(shí)間以將腈類轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酰胺。當(dāng)所述微生物施加至廢物流時(shí)，微生物可以是生長(zhǎng)(活躍分裂)或靜息(非活躍地分裂)的。當(dāng)所述方法需要施加活躍生長(zhǎng)的微生物的培養(yǎng)物時(shí)，施加條件優(yōu)選地支持或維持細(xì)菌生長(zhǎng)。當(dāng)所述方法需要施加非活躍分裂的微生物的培養(yǎng)物時(shí)，施加條件優(yōu)選地支持酶活性。任選地，所公開的方法和組合物可以用來處理具有廢物的生產(chǎn)廠的廢物流，所述廢物一般含有高濃度的腈、羥腈或易受酶降解的其他化學(xué)品。例如，提供的是使來自腈基生產(chǎn)廠的廢水流中腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物脫毒的方法。另外，本發(fā)明可以用于處理丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)生產(chǎn)中的廢物流，其中丙烯腈用于ABS的生產(chǎn)中。另外，提供可生物濾器，所述生物濾器可以用于使流出物如空氣、蒸氣、氣溶膠和水或水溶液中的腈化合物的混合物、腈和酰胺化合物的混合物和酰胺化合物的混合物脫毒。例如，如果揮發(fā)性腈化合物存在，揮發(fā)物可以從存在這些揮發(fā)物的固體或水溶液中剝離，并且應(yīng)當(dāng)以使揮發(fā)物截獲于生物濾器中的方式實(shí)施各個(gè)步驟。一旦截獲，所述揮發(fā)物可以如本文所述，用純培養(yǎng)物微生物提取物脫毒。還提供試劑盒，所述試劑盒包含微生物的培養(yǎng)物，所述微生物已經(jīng)被多重誘導(dǎo)并且能夠使腈化合物的混合物、腈和酰胺化合物的混合物和酰胺化合物的混合物脫毒。所述微生物可以是活躍分裂的或者凍干的，并且可以直接添加至含有腈和/或酰胺化合物的水溶液中。任選地，試劑盒包含受誘導(dǎo)的凍干樣品。微生物也可以如本文所述固定到固相支持物上。其他試劑盒組分可包括，例如，本文所述的用于誘導(dǎo)所述微生物的多種誘導(dǎo)補(bǔ)充物的混合物，以及其他試劑盒組件，如小瓶、包裝組件等，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。還提供的是延遲植物發(fā)育過程的方法，所述方法包括使植物或植物部分暴露于一種或多種酶或產(chǎn)生所述酶的微生物。任選地，用來延遲植物發(fā)育過程的微生物用如本文所述的誘導(dǎo)劑和/或穩(wěn)定劑(包括例如海藻糖、含酰胺氨基酸、鈷、脲及其混合物)處理。例如，提供的是用于延遲植物發(fā)育過程的方法，包括使植物或植物部分暴露于一種或多種酶，其中通過在包含海藻糖和任選的一種或多種含酰胺氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種細(xì)菌，由所述細(xì)菌產(chǎn)生所述酶并且其中將所述酶以足夠延遲所述植物發(fā)育過程的量暴露于植物或植物部分。任選地，所述方法涉及延遲植物發(fā)育過程，包括使植物或植物部分暴露于選自紅球菌、綠針假單胞菌、酮戊二酸短桿菌的一種或多種細(xì)菌及其混合物。一種或多種細(xì)菌在包含海藻糖和任選的一種或多種含酰胺氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且以足夠延遲所述植物發(fā)育過程的量暴露于植物或植物部分。提供的方法可以例如用來延遲果實(shí)、蔬菜成熟或花衰老并用來增加果實(shí)、蔬菜或花的儲(chǔ)存期，從而促進(jìn)此類植物產(chǎn)品的運(yùn)輸、分銷和銷售。用于延遲植物發(fā)育過程的方法在美國(guó)公開No.2008/0236038中描述，所述專利通過引用方式并入本文。任選地，所述方法包括使植物或植物部分暴露于來自細(xì)菌的一種或多種酶或提取物。酶或提取物以足夠延遲所述植物發(fā)育過程的量暴露于植物或植物部分。例如，提供的是用于延遲植物發(fā)育過程的方法，包括使植物或植物部分暴露于一種或多種細(xì)菌的酶提取物，其中所述細(xì)菌在包含海藻糖和一種或多種含酰胺氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并且其中將所述酶提取物以足夠延遲所述植物發(fā)育過程的量暴露于植物或植物部分。如本文所用，使植物或植物部分暴露于一種或多種以上細(xì)菌包括，例如暴露于完整細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞裂解物和擁有酶活性的細(xì)菌提取物(即，“酶提取物”)。用于從細(xì)胞(包括細(xì)菌細(xì)胞)制備裂解物和酶提取物的方法是已知的。在提供的方法中使用的一種或多種細(xì)菌有時(shí)可以更常見地在本文中稱作通常“催化劑”。如本文所用、“植物”或“植物部分”廣義地定義成包括完整植物和植物的任何部分、包括但不限于果實(shí)、營(yíng)養(yǎng)體(vegetable)、花、種子、葉、堅(jiān)果、胚、花粉、胚珠、枝、種仁(kernel)、穗、穗軸、籽粒、柄、根、根尖、花藥等。植物部分可以例如是果實(shí)、蔬菜或花。任選地，植物部分是果實(shí)，更具體地躍變型果實(shí)，如下文更詳細(xì)描述。所公開的方法涉及延遲植物發(fā)育過程，如一般與增加的乙烯生物合成相關(guān)的植物發(fā)育過程?！爸参锇l(fā)育過程”是意指植物或植物部分的任何生長(zhǎng)或發(fā)育過程，包括但不限于果實(shí)成熟、營(yíng)養(yǎng)體成熟、花衰老、葉脫落、種子萌發(fā)等。任選地，植物發(fā)育過程是果實(shí)或營(yíng)養(yǎng)體成熟、花衰老或葉脫落，更具體地果實(shí)或營(yíng)養(yǎng)體成熟。如本文定義，“延遲植物發(fā)育過程”及其語(yǔ)法變體，指任何減慢、中斷、抑制或阻抑植物或植物部分的目的植物發(fā)育過程或一般與特定植物發(fā)育過程相關(guān)的表型或基因型變化。例如，當(dāng)植物發(fā)育過程是果實(shí)成熟時(shí)，果實(shí)成熟的延遲可以包括抑制如上文所述，通常與成熟過程相關(guān)的變化(例如，顏色變化，果皮(即，子房壁)軟化、含糖量增加、風(fēng)味變化、果實(shí)總體降解和顧客對(duì)果實(shí)的需求度最終下降。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，果實(shí)成熟出現(xiàn)所要求的時(shí)間的長(zhǎng)度將根據(jù)例如果實(shí)的類型和所用的特定儲(chǔ)存條件(例如，溫度、濕度、通氣量等)變動(dòng)。因此，“延遲果實(shí)成熟”可以構(gòu)成延遲I至90天，特別是I至30天，更特別地是5至30天。用于評(píng)估植物發(fā)育過程(如果實(shí)成熟、營(yíng)養(yǎng)體成熟、花衰老和葉脫落延遲)延遲的方法完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的日常能力范圍內(nèi)，可以基于例如與未處理的植物或植物部分中的植物發(fā)育過程比較。任選地，因所公開的方法引起的植物發(fā)育過程延遲可以相對(duì)于未處理的植物或植物部分或相對(duì)于已經(jīng)用已知遲滯植物發(fā)育過程的一種或多種化學(xué)物質(zhì)處理過的植物或植物部分進(jìn)行評(píng)估。例如，因所提供的方法引起的果實(shí)成熟延遲可以與未處理的果實(shí)或已經(jīng)用抗成熟劑(如本文所述的那些)處理過的果實(shí)的果實(shí)成熟時(shí)間比較?！N或多種細(xì)菌以足夠延遲所述植物發(fā)育過程的量暴露于植物或植物部分?！笆怪参锘蛑参锊糠直┞队凇币环N或多種細(xì)菌包括用于提供細(xì)菌至所述植物或植物部分的任何方法。間接暴露方法包括，例如，將細(xì)菌或細(xì)菌混合物總體上靠近植物或植物部分安置(即，間接暴露)。任選地，可以將細(xì)菌通過更靠近或直接接觸而暴露于植物或植物部分。另夕卜，如本文定義，一種或多種本發(fā)明細(xì)菌的“足夠”量將取決于多種因素，包括但不限于，在所述方法中所用的具體細(xì)菌、細(xì)菌暴露于植物或植物部分的形式(例如，作為完整細(xì)菌細(xì)胞、細(xì)胞裂解物或酶提取物，如上文所述)、細(xì)菌借以暴露于植物或植物部分的手段和暴露的時(shí)間長(zhǎng)度。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過例行實(shí)驗(yàn)確定對(duì)于延遲植物發(fā)育過程必需的一種或多種細(xì)菌的“足夠”量。通過暴露于合適的誘導(dǎo)劑或用其處理，將一種或多種細(xì)菌“誘導(dǎo)”以顯示出所需的特征(例如，延遲植物發(fā)育過程(如果實(shí)成熟)的能力)。誘導(dǎo)劑包括但不限于海藻糖、天冬酰胺、谷氨酰胺、鈷、脲或其任何混合物。任選地，將細(xì)菌暴露于誘導(dǎo)劑天冬酰胺或用其處理，更具體地是包含海藻糖、天冬酰胺、鈷和脲的誘導(dǎo)劑混合物。誘導(dǎo)劑可以在培養(yǎng)所需細(xì)胞期間的任何時(shí)間添加。盡管不意圖受限于特定的機(jī)理，然而“誘導(dǎo)”細(xì)菌可以導(dǎo)致如上文所述的一種或多種酶如腈水合酶、酰胺酶和/或天冬酰胺酶的產(chǎn)生(或增加的產(chǎn)生)，并且這些酶中一種或多種酶的誘導(dǎo)可以在延遲目的植物發(fā)育過程中發(fā)揮作用。“腈水合酶”、“酰胺酶”和“天冬酰胺酶”包含在來自多種生物的細(xì)胞中存在的酶家族，所述生物包括，但不限于細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物。此類酶是熟知的，并且每類酶擁有識(shí)別的酶活性。提供的是延遲植物發(fā)育過程的方法，包括使植物或植物部分暴露選自腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶或其混合物中的一種或多種酶，其中將所述一種或多種酶以足夠延遲所述植物發(fā)育過程的量或酶活性水平暴露于植物或植物部分。例如，產(chǎn)生、受誘導(dǎo)以產(chǎn)生或經(jīng)基因修飾以產(chǎn)生一種或多種上述酶(即，腈水合酶、酰胺酶和/或天冬酰胺酶)的完整細(xì)胞可以用于延遲植物發(fā)育過程的方法中?？蛇x擇地，腈水合酶、酰胺酶和/或天冬酰胺酶可以從任何上述細(xì)胞中分離、純化或半純化并且以更為分離的形式暴露于植物或植物部分。見例如，Goda等人，JBiolChem.276:23480-5(2001)；Nagasawa等人，Eur.J.Biochem.267138-144(2000)；Soong等人，Appl.Environ.Microbiol.661947-52(2000);Kato等人，Eur.J.Biochem.263:662-70(1999)，所述文獻(xiàn)全部通過引用的方式整體并入本文。任選地，單一細(xì)胞類型可以能夠產(chǎn)生(或經(jīng)誘導(dǎo)或基因修飾以產(chǎn)生)多于一種酶。此類細(xì)胞適用于所公開的方法中。所公開的方法可以用來延遲任何植物或植物部分的植物發(fā)育過程。任選地，所述方法是涉及延遲成熟，并且植物部分是(躍變型或非躍變型)果實(shí)，營(yíng)養(yǎng)體或經(jīng)歷成熟的其他植物部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到“躍變型果實(shí)”在果實(shí)成熟期間顯示出乙烯產(chǎn)生驟增，而通常認(rèn)為“非躍變型果實(shí)”在成熟過程期間不經(jīng)歷乙烯生物合成的明顯增力口。示例性果實(shí)、營(yíng)養(yǎng)體和其他植物產(chǎn)物包括但不限于蘋果、杏、biriba、面包果、番荔枝(cherimoya)、斐濟(jì)果(feijoa)、無(wú)花果、番石槽、木菠蘿、稱猴桃、香蕉、桃、鱷梨、蘋果、哈密瓜、芒果、甜瓜、油桃、柿子、美果欖(sapote)、刺果番蒸枝(soursop)、橄欖、木瓜、西番蓮、梨、李子、西紅柿、燈籠椒、藍(lán)莓、可可、caju、黃瓜、柚子、檸檬、酸橙、辣椒、櫻桃、柑桔、葡萄、菠蘿、草莓、西瓜、樹番爺(tamarillo)和堅(jiān)果。任選地，所述方法涉及延遲花衰老、萎蔫、落葉或花瓣閉合。可以在此使用任何花。示例性花包括但不限于玫瑰、康乃馨、蘭花、半枝蓮、錦葵和秋海棠。切花，更特別地，商業(yè)上重要的切花如玫瑰和康乃馨，是特別有意義的。任選地，本發(fā)明中使用對(duì)乙烯敏感的花。乙烯敏感型花包括但不限于來自六出花屬(Alstroemeria)、銀蓮花屬(Aneomone)、花燭屬(Anthurium)、金魚草屬(Antirrhinum)、紫斃屬(Aster)、落新婦屬(Astilbe)、卡特蘭屬(Cattleya)、蘭屬(Cymbidium)、大麗花屬(Dahlia)、石斛屬(Dendrobium)、石竹屬(Dianthus)、洋桔梗屬(Eustoma)、香雪蘭屬(Freesia)、大丁草屬(Gerbera)、石頭花屬(Gypsophila)、鳶尾屬(Iris)、山黧豆屬(Lathyrus)、百合屬(Lilium)、補(bǔ)血草屬(Limonium)、尼潤(rùn)屬(Nerine)、薔薇屬(Rosa)、丁香屬(Syringa)、郁金香屬(Tulipa)和百日菊屬(Zinnia)的花。代表性的乙烯敏感型花還也包括石蒜科(Amarylidaceae)、蔥科(Alliaceae)、鈴蘭科(Convallariaceae)、菅草科(Hemerocallidaceae)、風(fēng)信子科(Hyacinthaceae)、百合科(Liliaceae)、蘭科(Orchidaceae)、番杏科(Aizoaceae)、仙人掌科(Cactaceae)、結(jié)?？?Campanulaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、景天科(Crassulaceae)、龍膽科(Gentianaceae)、錦奏科(Malvaceae)、白花丹科(Plumbaginaceae)、馬齒覓科(Portulacaceae)、爺科(Solanaceae)、龍舌蘭科(Agavacaea)、獨(dú)尾草科(Asphodelaceae)、天門冬科(Asparagaceae)、秋海棠科(Begoniaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、川續(xù)斷科(Dipsacaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、柳葉菜科(Onagraceae)、虎耳草科(Saxifragaceae)和馬鞭草科(Verbenaceae)的那些。見例如，VanDoorn,AnnalsofBotany89:375-383(2002)；VanDoorn,AnnalsofBotany89:689-693(2002)；和Elgar,“CutFlowersandFoliage-CoolingRequirementsandTemperatureManagement(切花和葉-冷卻要求和溫度管理)”于hortnet.co.nz/pubIications/hortfacts/hf305004.htm(1998)(2007年3月20日最近登錄)，所述文獻(xiàn)全部通過引用的方式整體并入本文。本文中還公開了用于延遲葉脫落的方法。對(duì)于調(diào)節(jié)植物發(fā)育過程如成熟、衰老和脫落的方法，顯著的商業(yè)意義存在于植物、果實(shí)、蔬菜和花卉產(chǎn)業(yè)中。技術(shù)人員將進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明中公開的任何方法可以與用于延遲植物發(fā)育過程、尤其通常與增加的乙烯生物合成相關(guān)的那些過程(例如，果實(shí)/營(yíng)養(yǎng)體成熟、花衰老和葉脫落)的其他已知方法組合。另外，如上文所述，在植物或植物部分被病原生物侵襲期間也觀察到增加的乙烯產(chǎn)生。因此，所述方法可以進(jìn)一步用于改善植物對(duì)病原體的應(yīng)答。通常，可以在本文使用能夠產(chǎn)生或受誘導(dǎo)以產(chǎn)生腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶或其任何組合的任何細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。腈水合酶、酰胺酶和/或天冬酰胺酶可以在來自特定生物的細(xì)胞(例如，細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞)中組成型地產(chǎn)生或，可選擇地，細(xì)胞可以產(chǎn)生所需的酶或僅在用合適的誘導(dǎo)劑“誘導(dǎo)”后產(chǎn)生酶?！敖M成型”意指本發(fā)明的至少一種酶在特定的細(xì)胞類型中連續(xù)地產(chǎn)生或表達(dá)。然而，如上文所述，其他細(xì)胞類型可能需要“誘導(dǎo)”以便以延遲目的植物發(fā)育過程的足夠量或酶活性水平表達(dá)腈水合酶、酰胺酶和/或天冬酰胺酶。即，本發(fā)明的酶可以僅在暴露于合適誘導(dǎo)劑或用其處理后產(chǎn)生(或以足夠的水平產(chǎn)生)。此類誘導(dǎo)劑是已知并且如上概述。例如，一種或多種細(xì)菌用誘導(dǎo)劑如天冬酰胺、谷氨酰胺、鈷、脲或其任何混合物、更具體地用天冬酰胺、鈷和脲的混合物處理。另外，如通過引用方式整體并入的題為“InductionandStabilizationofEnzymaticActivityinMicroorganisms(微生物中酶活性的誘導(dǎo)和穩(wěn)定)”的美國(guó)專利No.7，531，343和7，531，344中公開，天冬酰胺酶I活性可以在補(bǔ)充有含酰胺氨基酸或其衍生物的培養(yǎng)基中的玫瑰紅紅球菌DAP96622(革蘭氏陽(yáng)性)或紅球菌DAP96253(革蘭氏陽(yáng)性)內(nèi)誘導(dǎo)出來。使用含酰胺氨基酸或其衍生物，也可以優(yōu)選地誘導(dǎo)紅球菌屬的其他菌株以顯示天冬酰胺酶I酶活性。在所公開的方法中也使用綠針假單胞菌(P.chloroaphis)(ATCC保藏號(hào)43051),其在天冬酰胺存在下產(chǎn)生天冬酰胺酶I活性，和酮戊二酸短桿菌(B.kletoglutamicum)(ATCC保藏號(hào)21533)，一種也已經(jīng)證實(shí)產(chǎn)生天冬酰胺酶活性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。表達(dá)腈水合酶，酰胺酶和/或天冬酰胺酶的真菌細(xì)胞(如來自鐮刀菌屬(Fusarium)的那些)、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞也可以在本文中作為完整細(xì)胞或作為從其中分離一種或多種上述酶的來源使用。來自多種生物的幾種腈水合酶、酰胺酶和天冬酰胺酶的核苷酸序列和氨基酸序列公開于可公共獲得的序列數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)。本領(lǐng)域已知的代表性腈水合酶和脂族酰胺酶的非限制性列表在表I和表2中并且在序列表中描述。表I和表2中提到的“蛋白質(zhì)評(píng)分”提供基于質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)鑒定分離的蛋白質(zhì)的置信區(qū)間百分比(置信區(qū)間％)的概述。表I:代表性腈水合酶的氨基酸序列信息權(quán)利要求1.一種用于在產(chǎn)生腈水合酶的微生物中誘導(dǎo)選自腈水合酶活性、酰胺酶活性、天冬酰胺酶I活性及其組合的酶活性的方法，包括在包含海藻糖和一種或多種含酰胺氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物。2.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物包括選自紅球菌(Rhodococcus)屬、短桿菌(Brevibacterium)屬、假單胞菌(Pseudomonas)屬、假諾卡氏菌(Pseudonocardia)屬、諾卡氏菌(Nocardia)屬及其組合的細(xì)菌。3.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述酶活性包括腈水合酶活性。4.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物包括來自紅球菌屬的細(xì)菌。5.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物包括選自玫瑰紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)DAP96622、紅球菌DAP96253及其組合的細(xì)菌。6.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述海藻糖以至少4克/升培養(yǎng)基的濃度存在。7.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述海藻糖以至少I克/升培養(yǎng)基至10克/升培養(yǎng)基的濃度存在。8.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸選自天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬酰胺衍生物、谷氨酰胺衍生物及其組合。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述含酰胺氨基酸包括天冬酰胺和天冬酰胺衍生物，并且其中所述天冬酰胺和天冬酰胺衍生物包括天然形式的天冬酰胺、無(wú)水天冬酰胺、天冬酰胺一水合物以及其L-異構(gòu)體及D-異構(gòu)體。10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述含酰胺氨基酸包括谷氨酰胺和谷氨酰胺衍生物，并且其中所述谷氨酰胺和谷氨酰胺衍生物包括天然形式的谷氨酰胺、無(wú)水谷氨酰胺、谷氨酰胺一水合物以及其L-異構(gòu)體及D-異構(gòu)體。11.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸包括天冬酰胺。12.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸以至少50ppm的濃度存在。13.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸以200ppm至2000ppm的濃度存在。14.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸以每百萬(wàn)50份(ppm)至5000ppm的濃度存在。15.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述培養(yǎng)基不含有任何含腈化合物。16.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述受誘導(dǎo)的產(chǎn)生腈水合酶的微生物具有的酶活性大于或等于在包含含腈化合物的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)時(shí)同一種酶的活性。17.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述受誘導(dǎo)的產(chǎn)生腈水合酶的微生物具有的酶活性比在包含含腈化合物的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)時(shí)同一種酶的活性大至少5%。18.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含鈷。19.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含脲。20.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含麥芽糖或麥芽糊精。21.如權(quán)利要求I所述的方法，其中所述產(chǎn)生腈水合酶的微生物是至少部分固定的。22.一種用于穩(wěn)定酶或能夠產(chǎn)生所述酶的微生物中所需活性的方法，所述方法包括使所述酶或能夠產(chǎn)生所述酶的微生物與包含海藻糖和一種或多種含酰胺氨基酸的組合物接觸，其中所述酶選自腈水合酶、酰胺酶和天冬酰胺酶I。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述海藻糖以至少4克/升的濃度存在。24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述海藻糖以至少I克/升至10克/升的濃度存在。25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸以至少50ppm的濃度存在。26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸以至少50ppm至5000ppm的濃度存在。27.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸以200ppm至2000ppm的濃度存在。28.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述含酰胺氨基酸選自天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬酰胺衍生物、谷氨酰胺衍生物及其組合。29.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述含酰胺氨基酸包括天冬酰胺和天冬酰胺衍生物，并且其中所述天冬酰胺和天冬酰胺衍生物包括天然形式的天冬酰胺、無(wú)水天冬酰胺、天冬酰胺一水合物以及其L-異構(gòu)體及D-異構(gòu)體。30.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述含酰胺氨基酸包括谷氨酰胺和谷氨酰胺衍生物，并且其中所述谷氨酰胺和谷氨酰胺衍生物包括天然形式的谷氨酰胺、無(wú)水谷氨酰胺、谷氨酰胺一水合物以及其L-異構(gòu)體及D-異構(gòu)體。31.如權(quán)利要求22所述的方法，其中使所述酶或所述能夠產(chǎn)生所述酶的微生物的所述所需活性穩(wěn)定，從而所述所需活性在25°C的溫度至少30天的時(shí)間后維持在由所述酶或所述能夠產(chǎn)生所述酶的微生物所表現(xiàn)的初始活性的至少50%的水平。32.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述微生物包括選自紅球菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬、假諾卡氏菌屬、諾卡氏菌屬及其組合中的細(xì)菌。33.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述微生物包括選自玫瑰紅紅球菌DAP96622、紅球菌DAP96253及其組合的細(xì)菌。34.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述組合物不含有任何含腈化合物。35.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述組合物還包含鈷、脲、麥芽糖、麥芽糊精及其組合。36.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述微生物是至少部分固定的。37.一種組合物，包含(a)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，其包含海藻糖和一種或多種含酰胺氨基酸；(b)一種或多種能夠產(chǎn)生一種或多種酶的微生物,所述酶選自腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶I及其組合；和(C)選自腈水合酶、酰胺酶、天冬酰胺酶I及其組合的一種或多種酶。38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述一種或多種微生物包括選自紅球菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬、假諾卡氏菌屬、諾卡氏菌屬及其組合中的細(xì)菌。39.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述海藻糖以至少4克/升培養(yǎng)基的濃度存在。40.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述海藻糖以至少I克/升培養(yǎng)基至10克/升培養(yǎng)基的濃度存在。41.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸選自天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬酰胺衍生物、谷氨酰胺衍生物及其組合。42.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述含酰胺氨基酸包括天冬酰胺和天冬酰胺衍生物，并且其中所述天冬酰胺和天冬酰胺衍生物包括天然形式的天冬酰胺、無(wú)水天冬酰胺、天冬酰胺一水合物以及其L-異構(gòu)體及D-異構(gòu)體。43.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述含酰胺氨基酸包括谷氨酰胺和谷氨酰胺衍生物，并且其中所述谷氨酰胺和谷氨酰胺衍生物包括天然形式的谷氨酰胺、無(wú)水谷氨酰胺、谷氨酰胺一水合物以及其L-異構(gòu)體及D-異構(gòu)體。44.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸包括天冬酰胺。45.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸以至少50ppm的濃度存在。46.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述一種或多種含酰胺氨基酸以200ppm至2000ppm的濃度存在。47.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述一種或多種微生物包括選自紅球菌屬的細(xì)菌。48.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述一種或多種微生物包括選自玫瑰紅紅球菌、紅球菌DAP96253、酮戍二酸短桿菌(Brevibacteriumketoglutaricum)及其組合的細(xì)菌。49.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述一種或多種微生物是至少部分固定的。50.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述培養(yǎng)基還包含鈷。51.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述培養(yǎng)基還包含脲。52.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述培養(yǎng)基不含有任何含腈化合物。53.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述培養(yǎng)基還包含麥芽糖或麥芽糊精。54.一種用于延遲植物發(fā)育過程的方法，包括使植物或植物部分暴露于一種或多種酶，其中所述酶通過在包含海藻糖和一種或多種含酰胺氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種或多種細(xì)菌而由所述細(xì)菌產(chǎn)生，并且其中使所述酶以足夠延遲所述植物發(fā)育過程的量暴露于所述植物或植物部分。55.—種用于延遲植物發(fā)育過程的方法,包括使植物或植物部分暴露于一種或多種細(xì)菌的酶提取物，其中所述細(xì)菌在包含海藻糖和一種或多種含酰胺氨基酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且其中使所述酶提取物以足夠延遲所述植物發(fā)育過程的量暴露于所述植物或植物部分。全文摘要本文提供的是用于誘導(dǎo)和穩(wěn)定酶活性的方法。任選地，酶處于能夠產(chǎn)生所述酶的微生物中。在一些實(shí)施方案中，所述酶可以是腈水合酶、酰胺酶或天冬酰胺酶I。提供的是包含具有受誘導(dǎo)和/或穩(wěn)定的活性的酶或微生物的組合物。還提供的是通過使植物或植物部分暴露于具有受誘導(dǎo)和/或穩(wěn)定的活性的酶或微生物而延遲植物發(fā)育過程的方法。文檔編號(hào)C12N9/14GK102770535SQ201180006968公開日2012年11月7日申請(qǐng)日期2011年1月24日優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日發(fā)明者T·A·圖克,喬治·E·皮爾斯申請(qǐng)人:佐治亞州立大學(xué)研究基金會(huì)