專利名稱：針對(duì)梭菌的具有新酶活性的酶的制作方法
針對(duì)梭菌的具有新酶活性的酶本發(fā)明涉及具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列的多肽，及其變體或片段。本 發(fā)明還涉及編碼所述多肽的核酸。本發(fā)明還涉及所述多肽或其片段作為治療或診斷物質(zhì)的 用途以及用于食物和飼料的污染的用途。梭菌(Clostridium)是一類異質(zhì)性(heterogenic)的細(xì)菌，包括超過(guò)150種 已得到翔實(shí)描述的(validly described)物種。有幾種梭菌能夠產(chǎn)生毒素，其中一些 是已知的最強(qiáng)的自然毒素。肉毒中毒(botulism)、破傷風(fēng)(tetanus)、腸源性毒血癥
(enterotoxemic infection) if ^ $α ^ ^ (necrotizing soft tissue infection)是由該屬細(xì)菌造成的人類疾病的突出實(shí)例。除了對(duì)農(nóng)場(chǎng)和家養(yǎng)的動(dòng)物具有不良 影響外，一些梭菌可導(dǎo)致奶酪熟化過(guò)程中產(chǎn)生缺陷，影響乳加工業(yè)。產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是革蘭氏陽(yáng)性、厭氧、產(chǎn)孢子的細(xì)菌， 廣泛分布于土壤、沉積物、食物和人及動(dòng)物的胃腸道中。人和家畜中有很大一系列疾病與產(chǎn) 氣莢膜梭菌相關(guān)，包括食物中毒、氣性壞疽(梭菌性肌壞死(clostridial myonecrosis)), 壞死性腸炎(enteritis necroticans)和非食物傳播的胃腸道感染。產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)菌噬 菌體編碼細(xì)胞內(nèi)溶素，其導(dǎo)致其宿主細(xì)胞釋放病毒粒體，可能可以用于針對(duì)這些病原菌的 特異性檢測(cè)和控制。該物種產(chǎn)生至少12種胞外毒素。其中一些被認(rèn)為是主要的致死性毒素。根據(jù)其 產(chǎn)生毒素α、β、ε和t的能力，菌株可分為A-E五個(gè)類型。編碼產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素(CPE)的α cpe基因可位于質(zhì)粒上，也可位于染色體上。 致食物中毒性的A型菌株攜帶cpe的染色體變體，而非致食物中毒性的A型菌株則由質(zhì)粒 編碼它。將α cpe攜帶在質(zhì)粒上的菌株似乎是導(dǎo)致CPE相關(guān)的胃腸疾病——它是非食物傳 播的胃腸道感染——的原因。產(chǎn)生β毒素的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌可導(dǎo)致另一種不相關(guān)的，并且很少報(bào)道的疾病， 通常稱作“pigbel”(在新幾內(nèi)亞發(fā)生)或“Darmbrand”(火腸病(“fire-bowels”))(二戰(zhàn)之 后一段時(shí)期內(nèi)在德國(guó)出現(xiàn)的疾病)。這種節(jié)段壞死性腸炎綜合征(segmental necrotizing enteritis syndrome)影響小腸，其相關(guān)的死亡率為35-40%。A型致食物中毒性產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株可見(jiàn)于土壤、水、食物、塵埃、香料和人及動(dòng)物 的腸道。這些菌株已經(jīng)以IO3 to 104CFU/g的水平見(jiàn)于幾乎所有土壤樣品，而B(niǎo)、C、D和E型 菌株并不存在于土壤中，而是專性的寄生物，常常見(jiàn)于家畜。對(duì)熱敏感的A型CPE是食物介導(dǎo)的病癥的原因。其分子量為35kDa，等電點(diǎn)為4. 3。 CPE的產(chǎn)生與孢子形成的晚期密切相關(guān)，且該毒素與內(nèi)生孢子在宿主細(xì)胞裂解時(shí)一同釋出。 促進(jìn)細(xì)胞形成孢子的條件亦可促進(jìn)CPE的產(chǎn)生。氣性壞疽是一種侵襲性的(aggressive)壞死性軟組織感染，大約80%的氣性 壞疽是由產(chǎn)氣莢膜梭菌造成的。該疾病定義為對(duì)健康的活肌肉(之前未受創(chuàng)傷或缺血) 的急性侵襲。產(chǎn)氣莢膜梭菌A型α毒素是導(dǎo)致該病發(fā)病的因素，產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞溶素 (perfringolysin)O(0毒素)也是該病的致病因素，但較前者為次要。在大多數(shù)情況下，創(chuàng) 傷性氣性壞疽在破壞血液供應(yīng)的深穿透?jìng)蟀l(fā)生。產(chǎn)氣莢膜梭菌的組織毒性可能導(dǎo)致廣泛的傷害，且如果不加以治療，其可發(fā)展為全身性休克、多器官衰竭和死亡。產(chǎn)氣莢膜梭菌還導(dǎo)致多種獸類疾病，影響農(nóng)場(chǎng)和家養(yǎng)動(dòng)物。該細(xì)菌可能是羊羔 (lambs)和綿羊(sheep)、牛犢(calves)和牛(cattle)、山羊、豬、馬駒(fouls)和成年馬、 家雞、某些籠養(yǎng)的野生鳥(niǎo)類物種及兔的數(shù)種腸疾病的致病原。產(chǎn)氣莢膜梭菌在動(dòng)物腸道中的存在可導(dǎo)致例如壞死性腸炎、食物中毒和生長(zhǎng)遲 緩。特別地，產(chǎn)氣莢膜梭菌在家禽(特別是焙烤用小雞)腸道中的存在與多種病狀有聯(lián)系， 如腸創(chuàng)傷(gut lesion)和壞死性腸炎，且可導(dǎo)致家禽生長(zhǎng)的顯著減緩。此外，人們推測(cè)抗 生素出于促進(jìn)生長(zhǎng)和預(yù)防疾病的目的在動(dòng)物飼料中的廣泛使用導(dǎo)致了對(duì)一系列治療用抗 微生物劑(如四環(huán)素、桿菌肽、紅霉素或頭孢菌素)的獲得抗性。腹瀉伴隨腹部劇烈疼痛是食物傳播的感染的最常見(jiàn)臨床癥狀。有時(shí)會(huì)發(fā)生 惡心，較少有發(fā)熱和嘔吐，而罕有死亡，但在虛弱的(debilitated)或醫(yī)療機(jī)構(gòu)收容的 (institutionalized)人，尤其可影響老年人。在攝食之后的潛伏期(incubation time)為 6- 小時(shí)。也報(bào)道了一些在攝食后僅2小時(shí)就出現(xiàn)癥狀的案例。推測(cè)預(yù)先形成的毒素或食 用(consumption)已經(jīng)形成孢子的細(xì)胞可導(dǎo)致在攝食后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)癥狀。正常情況下， 該病癥的持續(xù)時(shí)間較短，癥狀在一日以內(nèi)消失。年老或虛弱者有時(shí)需要更長(zhǎng)時(shí)間來(lái)康復(fù)。在過(guò)高溫度儲(chǔ)藏的肉或肉制品為產(chǎn)氣莢膜梭菌食物中毒的最常見(jiàn)來(lái)源。烹制不足 (insufficient cooking)也是很多爆發(fā)的原因。海鮮、奶制品、水果和蔬菜有時(shí)也介導(dǎo)產(chǎn)氣 莢膜梭菌食物中毒，但全部爆發(fā)的大約75%是由肉或肉制品導(dǎo)致的。肉類的產(chǎn)氣莢膜梭菌 污染直接來(lái)源于被屠宰的動(dòng)物或來(lái)源于后續(xù)的來(lái)自容器、塵埃或操作者的污染。推測(cè)食物 介導(dǎo)的產(chǎn)生腸毒素的產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染劑量非常之高。引起人體腹瀉癥狀似乎需要大約 108個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)菌孢子能夠在烹制溫度下存活，而且在加熱過(guò)程之后與之競(jìng)爭(zhēng)的菌群被 消除。在食物冷卻至能夠發(fā)生孢子萌發(fā)(spore germination)和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的溫度時(shí)， 它們能夠迅速分裂。絕大多數(shù)爆發(fā)發(fā)生在餐館和共餐(catering)中。僅有3%記錄在案的 產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)食物中毒發(fā)生在私人家庭中，但是考慮到該疾病病程相對(duì)較為溫和，認(rèn) 為未報(bào)道的病例數(shù)的推定數(shù)會(huì)更高。極少有爆發(fā)牽涉到商業(yè)加工的食物；HatheWay，1990， Clin. Microbiol. Rev. 3/1,66-98 ；Rood & Cole,1991，Microbiol. Rev. 55/4,621-648 ； Songer,1996，Clin.Microbiol. Rev. 9/2，216-234。使用細(xì)胞內(nèi)溶素診斷和殺滅食物中的污染細(xì)菌最早公開(kāi)于GB 2，255，651。最早在 體內(nèi)使用小鼠模型系統(tǒng)的治療性和預(yù)防性應(yīng)用由Nelson & Fischetti描述Q001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98^4107-4112 ；Loeffler et al，2001，Science Μ，2170-2172)。對(duì) 于使用噬菌體的水解酶控制病原菌的綜述見(jiàn)于Fischetti，2006，BMC Oral Health 6, 16-19。最早來(lái)自產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)菌噬菌體的細(xì)胞溶素(lysine)，即phi3626，公開(kāi)于WO 03/066845。然而，對(duì)于作為針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的新抗微生物劑的物質(zhì)，以及新的產(chǎn)氣莢膜梭 菌診斷方法仍有極大需求。權(quán)利要求中公開(kāi)的主題解決了該問(wèn)題。為了說(shuō)明本發(fā)明的一些方面，列出了下述附圖，其并非意為以任何方式限制本發(fā)明。

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明細(xì)胞溶素plyS9的氨基酸序列(SEQ ID NO :1)。
圖2顯示根據(jù)本發(fā)明編碼細(xì)胞溶素plyS9的核苷酸序列(SEQ ID NO 2)。圖3是經(jīng)考馬斯染色的SDS-PAGE，顯示對(duì)plyS9表達(dá)和純化的分析結(jié)果。泳道1 和11為由其左側(cè)數(shù)字所示的分子量標(biāo)記。泳道2、3、4和5為分別在0、1、2和4小時(shí)后所 需蛋白質(zhì)的表達(dá)。泳道6、7、8和9分別為在純化過(guò)程中加載于柱的粗提取物、流過(guò)物、洗滌 級(jí)分和洗脫物。泳道10為在500mM NaCl和50%甘油存在下純化并濃縮的蛋白質(zhì)。右側(cè)的 箭頭標(biāo)示純化的plyS9的位置。圖4是在優(yōu)化條件(6 μ g plyS9 ；檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH 6. 5，含300mM氯 化鈉)下plyS9針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌底物細(xì)胞的溶胞曲線(lysis curve)的圖示?！癆”表示 0D_，而“B”表示時(shí)間[s]。將曲線對(duì)起始0D_= 1標(biāo)準(zhǔn)化。正方形代表對(duì)照，三角形代表 plyS9溶胞曲線。圖5. plyS9的相對(duì)酶活性(A)依賴于pH(B)和緩沖物質(zhì)(黑條為檸檬酸/磷酸緩 沖液而白條為Tris/磷酸緩沖液)的圖示。緩沖液組成為25mM檸檬酸鹽或Tris，25mM磷 酸，120mM NaCl ；蛋白質(zhì)濃度為 0. 5 μ g plyS9。圖6.plyS9的酶比活性(A)依賴于氯化鈉濃度(B)的圖像表示。緩沖液組成為 20mM MOPS pH 7. 0和多種濃度的NaCl [mM]；蛋白質(zhì)濃度為0. 5 μ g plyS9。圖7. 二價(jià)金屬離子對(duì)plyS9活性的影響(20mM MOPS緩沖液pH 7. 0,300mM NaCl ； 0.5yg plyS9)的圖示?！唉　贝硐鄬?duì)酶活性，“0”意為不含任何金屬例子。點(diǎn)填充的條代 表IOmM的金屬離子濃度，線填充的條代表ImM的金屬離子濃度。圖8為plyS9和CBD區(qū)域特定長(zhǎng)度變體的概略表示，數(shù)字代表SEQ ID NO=I中所
示的氨基酸序列中的氨基酸殘基。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞內(nèi)溶素”(endolysin)指適于水解細(xì)菌細(xì)胞壁的酶。來(lái)自 感染革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)菌噬菌體的細(xì)胞內(nèi)溶素呈現(xiàn)模塊化的構(gòu)造。大多數(shù)情況下，N-端域 為酶活性域(enzymatically active domain，EAD)，C_端域，其命名為細(xì)胞壁結(jié)合域(cell wall binding domain, CBD)，負(fù)責(zé)底物識(shí)別。兩個(gè)域由一段短的接頭肽連接。細(xì)胞內(nèi)溶素 包含至少一個(gè)選自下組內(nèi)肽酶的EAD =N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶、N-乙酰基-胞 壁酰胺酶和N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“域”指細(xì)胞內(nèi)溶素的被賦予特定功能的亞基，且也可與結(jié) 構(gòu)域一致(coincide with) 0優(yōu)先用術(shù)語(yǔ)“域”來(lái)描述EAD和CBD域之間的拮抗作用 (antagoni sm)，前者由多于一個(gè)的模塊組成。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“CBD”指細(xì)胞內(nèi)溶素的細(xì)胞壁結(jié)合域，其通常存在于該蛋白質(zhì) 的C-端。CBD域不具有水解細(xì)胞壁方面的酶活性，但通?？山閷?dǎo)細(xì)胞內(nèi)溶素與細(xì)菌細(xì)胞壁 的結(jié)合。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“EAD”指細(xì)胞內(nèi)溶素的酶活性域，其負(fù)責(zé)水解細(xì)菌肽聚糖。其包 含至少一種選自下組的細(xì)胞內(nèi)溶素的酶活性N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶、N-乙 酰-胞壁酰胺酶和N-乙酰-氨基葡萄糖苷酶。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包含SEQ ID NO :1序列的多肽，以及其變體。所述多肽及 其變體被視為根據(jù)本發(fā)明的多肽。所有這些均具有下述共同特征，即具有細(xì)胞內(nèi)溶素活性， 并因此能夠溶解產(chǎn)氣莢膜梭菌。所述對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的特異性可通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方 法加以測(cè)試，例如，通過(guò)將所述多肽添加至包含一種或多種所述產(chǎn)氣莢膜梭菌的樣品，并確定在添加所述多肽之后其濁度的變化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽描述于 SEQ ID NO 1。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽的變體顯示相對(duì)于SEQ ID NO 1的一 個(gè)或多個(gè)取代。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽的片段。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)plyS9 的特定C-端片段可結(jié)合產(chǎn)氣莢膜梭菌。因此，本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案涉及plyS9的 CBD0 plyS9優(yōu)選的片段包含根據(jù)SEQ ID NO :1所述的氨基酸序列的氨基酸殘基170-342、 181-342、192-342或203-342。更優(yōu)選的是plyS9的從170-203的范圍內(nèi)的氨基酸殘基起 始，到氨基酸殘基342結(jié)束的片段，其中氨基酸殘基的位置參照SEQ ID NO :1。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，plyS9的變體包含附加的標(biāo)志物部分(marker moiety)，如生物素，或標(biāo)簽，如HA—標(biāo)簽、His-標(biāo)簽、Strep-標(biāo)簽、Myc-標(biāo)簽、GST-標(biāo)簽、 JS-標(biāo)簽或其他本領(lǐng)域已知的標(biāo)簽。應(yīng)理解上述說(shuō)明的plyS9變體不可以視為嚴(yán)格區(qū)分的實(shí)施方案，而是可以組合 的。舉例而言，根據(jù)本發(fā)明的plyS9變體可包含一種或多種如上所述的氨基酸殘基取代，以 及JS-標(biāo)簽，只要這樣的重組的細(xì)胞內(nèi)溶素仍對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有特異性即可。本領(lǐng)域技 術(shù)人員會(huì)容易地理解所述變體中何者適合其目的，而且總是可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法測(cè)試 這些變體針對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的活性，例如通過(guò)測(cè)定其細(xì)胞溶解活性對(duì)含產(chǎn)氣莢膜梭菌溶液 的光密度(optical density)的作用。JS-標(biāo)簽來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)草酰乙酸脫羧酶α亞 基的生物素受體域，并包含共同序列MKM(K可以是生物素化的)，使得所述多肽可在體內(nèi)在 生物素連接酶(biotin ligase)的作用下生物素化。JS-標(biāo)簽是肺炎克雷伯氏菌草酰乙酸 脫羧酶全α亞基的大小減小而成的片段。JS-標(biāo)簽合適的最小序列包含66個(gè)氨基酸殘基， 如SEQ ID Ν0:14所示。然而，該66氨基酸殘基長(zhǎng)的JS-標(biāo)簽的衍生物也是合適的，包括與 SEQ ID而14至少80、90、95或98%同源的序列。優(yōu)選地，所述衍生物長(zhǎng)度最多可至80個(gè) 氨基酸殘基，且與SEQ ID NO :14在66個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列段內(nèi)至少有80、90、95或 98%同源。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及利用根據(jù)本發(fā)明的多肽、其變體或片段在食物、醫(yī)學(xué)或 獸醫(yī)樣品(例如，死動(dòng)物的組織，以及動(dòng)物飼料和人類食物)中檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法。所述多肽或其變體可用于在測(cè)定法中在檢測(cè)前溶解產(chǎn)氣莢膜梭菌。一些測(cè)定法的 共同特征是需要從所述細(xì)菌細(xì)胞釋出核酸(DNA或RNA)或生物化學(xué)組分(例如，ATP或胞 內(nèi)酶活性)以對(duì)其加以確定。然而，現(xiàn)有技術(shù)所提供的核酸分子分離具有顯著的不利之處，而使用根據(jù)本發(fā)明 的多肽或變體可以克服這些不利之處。優(yōu)選地，所述多肽或其變體在核酸檢測(cè)測(cè)定法(如PCR)或其他檢測(cè)測(cè)定法過(guò)程中 或之前使用。例如，在核酸分子檢測(cè)方法(如PCR)過(guò)程中或之前使用根據(jù)本發(fā)明的多肽或 其變體迅速地溶解產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)胞，由此釋出基因組DNA或RNA。一旦所述細(xì)胞被溶解， 就無(wú)需分離和/或純化DNA或RNA以供擴(kuò)增反應(yīng)。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，所述酶活性域被替換成作為標(biāo)志物的多肽。例如，多肽 PlyS9的細(xì)胞壁結(jié)合域或其片段被偶合于標(biāo)志物部分，如生物素、Str印-Tag、熒光蛋白(如
6綠色熒光蛋白)或其他本領(lǐng)域已知的標(biāo)志物。所述偶合于標(biāo)志物部分的CBD可以在迅速檢 測(cè)(例如在食物中)產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法中使用。因此，本發(fā)明還提供了使用根據(jù)本發(fā)明的多肽、或其變體或CBD檢測(cè)樣品中的梭 菌，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含編碼本發(fā)明的多肽及其變體和片段的序列的核酸 分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到，有許多方式來(lái)構(gòu)建編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽及其變體或片 段的核酸分子，例如通過(guò)考慮簡(jiǎn)并的遺傳密碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員在得知了本領(lǐng)域所述的多 肽及其變體或片段的氨基酸序列的基礎(chǔ)上能夠選取最適于其目的的符合要求的核苷酸序 列，例如其密碼子用法已經(jīng)過(guò)調(diào)適而符合其期望的表達(dá)宿主的密碼子用法的序列。包含編 碼本發(fā)明的多肽及其變體或片段的序列的核酸分子被視為本發(fā)明的核酸分子，所述序列被 視為本發(fā)明的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼根據(jù)本發(fā)明如SEQ ID NO 1所示的多 肽。優(yōu)選地，所述核酸分子包含SEQ ID NO :2所示的核酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼根據(jù)本發(fā)明如SEQ ID NO :10-13所示 的片段。優(yōu)選地，所述核酸分子包含編碼SEQ ID NO :11所示的多肽片段的核酸序列。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明核苷酸序列的載體。優(yōu)選地，所述載體提供 本發(fā)明所述多肽及其變體或片段在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。可以僅由于生物工程學(xué)上的 原因來(lái)選擇宿主細(xì)胞，例如，產(chǎn)率、溶解性、成本等，但也可從醫(yī)療的角度來(lái)選擇，例如，非病 原性的細(xì)菌或酵母、人類細(xì)胞，如果所述細(xì)胞將被施用給受試者的話。所述載體可提供根據(jù) 本發(fā)明所述多肽的組成型或誘導(dǎo)型表達(dá)。除了本文中提及的具體核苷酸和氨基酸序列以及可從所述核苷酸序列衍生的氨 基酸序列之外，本發(fā)明還涵蓋其變體、同源物和衍生物。在此，術(shù)語(yǔ)“同源性”可等同于“同一性”。在本文語(yǔ)境下，同源序列被視為包含可 為75%、85%或90%相同，優(yōu)選地至少95%或98%相同的氨基酸序列和核苷酸序列。具體 地說(shuō)，通常應(yīng)參照那些已知對(duì)活性不可或缺的序列區(qū)域來(lái)考慮同源性。盡管同源性也可以 參照相似性(即，具有類似化學(xué)性質(zhì)和/或功能的氨基酸殘基)來(lái)考慮，在本發(fā)明的語(yǔ)境下 優(yōu)選用序列同一性來(lái)表述同源性。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述變體、同源物或衍生物為這樣的氨基酸序列，其與SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列至少75 %、85 %或90 %相同，優(yōu)選地為至少95 %或98 %相同。在一個(gè)優(yōu)選的方面，所述變體、同源物或衍生物為這樣的核苷酸序列，其與SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列至少75%、85%或90%相同，優(yōu)選地為至少95%或98%相同。在另一個(gè)方面，所述變體、同源物或衍生物為這樣的氨基酸序列，其與SEQ ID NO 10-13所示的氨基酸序列的細(xì)胞壁結(jié)合域至少75%、85%或90 %相同，優(yōu)選地為至少95% 或98%相同。優(yōu)選地，所述衍生物包含示于SEQ ID NO :11的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的多肽或其變體的藥物。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本 發(fā)明的多肽或其變體或片段的藥物組合物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在治療或預(yù)防受試者中梭菌感染的方法，特別是治療 或預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌或酪丁酸梭菌(C. tyrobutyricum)引起的感染的方法中使用以上 提及的多肽或其變體或片段。所述受試者可為人類受試者或動(dòng)物，特別是用于牲畜飼養(yǎng)
7(livestock farming)和/或奶業(yè)畜牧(dairy farming)的動(dòng)物，如豬、牛、綿羊、馬、家禽、 山羊、籠養(yǎng)野生鳥(niǎo)類和兔。所述治療方法涵蓋將足夠量的本發(fā)明所述的多肽給藥于感染部 位或需要預(yù)防性處理以防止感染的部位。具體而言，所述治療方法可用于治療或預(yù)防梭菌(特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌)引起的 對(duì)軟組織和胃腸道的感染。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽用于治療或預(yù)防肌壞死，特別是 供治療或預(yù)防梭菌性肌壞死(氣性壞疽)、壞死性腸炎，特別是用于治療或預(yù)防由產(chǎn)氣莢膜 梭菌造成的壞死性腸炎(“Pig-bel”或“Darmbrand”)、胃腸道感染，特別是用于治療或預(yù) 防由產(chǎn)氣莢膜梭菌造成的嬰兒的壞死性小腸結(jié)腸炎、腸毒素誘發(fā)的腹瀉或食物傳播的疾病 的方法。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽用于在多種動(dòng)物中治療或預(yù)防梭 菌，優(yōu)選產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的方法，特別是治療或預(yù)防綿羊、山羊、牛犢、牛、馬和其他動(dòng)物 物種中的腸源性毒血癥的方法。具體而言，本申請(qǐng)的多肽適用于治療或預(yù)防由梭菌特別是 由產(chǎn)氣莢膜梭菌造成的羔羊痢疾和腎髓樣病或家禽壞死性腸炎的方法。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在醫(yī)學(xué)治療中使用本發(fā)明的多肽或其變體，如果 待治療或預(yù)防的感染是由抗藥性或多重抗藥性梭菌屬菌株特別是產(chǎn)氣莢膜梭菌造成的。此 外，可以在治療方法中使用本發(fā)明的多肽或其變體，將其與常規(guī)抗菌劑(如抗生素或其他 細(xì)胞內(nèi)溶素)聯(lián)合給藥。在根據(jù)本發(fā)明的治療或預(yù)防方法中使用的給藥劑量和途徑取決于具體的疾病和/ 或待治療的感染位置。給藥途徑可例如在具體實(shí)施方案中為經(jīng)口、局部、腸胃外、靜脈內(nèi)、直 腸或任何其他給藥途徑。對(duì)于將本發(fā)明的多肽給藥于感染部位或有感染危險(xiǎn)的部位，可以將本發(fā)明的多肽 以一定的方式配制而保護(hù)所述多肽不受環(huán)境因素如蛋白酶、氧化作用或免疫應(yīng)答的影響。因此，可將本發(fā)明的多肽配制為膠囊、糖錠劑(dragee)、丸劑、栓劑、可注射的溶液 或其他任何醫(yī)學(xué)上合理的蓋侖制劑。在一些實(shí)施方案中，這些蓋侖制劑可包含合適的載體、 穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、緩沖劑或其他合適的試劑。舉例而言，對(duì)于局部應(yīng)用，本發(fā)明的多肽可通過(guò)洗劑或硬膏劑的方式來(lái)給藥。對(duì)于腸道的治療，舉例而言在壞死性小腸結(jié)腸炎或腸毒素誘發(fā)的腹瀉中，可考慮 栓劑制劑?；蛘?，可考慮經(jīng)口給藥。在此情況下，在本發(fā)明的多肽在達(dá)到感染部位之前必須 保護(hù)其不受嚴(yán)酷的消化道環(huán)境的影響。這可通過(guò)例如使用細(xì)菌作為載體來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述細(xì)菌 能夠耐受胃中的消化起始步驟而存活，隨后將本發(fā)明的多肽分泌至腸環(huán)境中。所有的醫(yī)療應(yīng)用均依賴于本發(fā)明的多肽在遇到產(chǎn)氣莢膜梭菌時(shí)特異性地并即時(shí) 地將其溶解的作用。該作用可降低病原菌和細(xì)菌負(fù)荷，同時(shí)釋放(relieve)免疫系統(tǒng)，從而 對(duì)受治療的受試者的健康狀態(tài)產(chǎn)生即時(shí)的效應(yīng)。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員所面臨的主要任務(wù) 是就相應(yīng)的待治療疾病精確配制本發(fā)明的多肽。為此目的，通?？墒褂眠@些應(yīng)用中的常規(guī) 藥物的同樣的蓋侖制劑。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，上面提及的多肽或變體是藥物組合物的組分，所述藥物 組合物任選地包含載體物質(zhì)。在又一個(gè)方面，所述多肽或變體是化妝品或消毒劑組合物的一部分。如上所述，幾種梭菌屬物種可對(duì)患者身體暴露于環(huán)境的部分(如皮膚)造成刺激。為了預(yù)防上述刺激或 為了消除所述梭菌屬病原菌的表現(xiàn)(manifestations)，可使用專用的(special)化妝品制 備物，其包含足夠量的本發(fā)明多肽以溶解既存的或新棲(freshly settling)的梭菌。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的多肽及其變體作為抗微生物劑在食物 中、食品加工設(shè)備上、食品加工工廠中、與食物相接觸的表面上(如架子)和食品儲(chǔ)藏區(qū)域 以及其他一切梭菌可潛在地感染食物材料的場(chǎng)合的用途。所述多肽可單獨(dú)使用或與其他抗 微生物劑(如抗生素)結(jié)合使用。此外，所述多肽可在動(dòng)物飼料中單獨(dú)使用或與其他抗微 生物劑結(jié)合使用，以供預(yù)防疾病，例如在家禽或生豬飼養(yǎng)中。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的多肽用作藥物、藥物組合物、化妝品、抗微 生物劑等。
實(shí)施例所有的克隆方法使用根據(jù) Sambrook 等(Molecular cloning. A laboratory manual ；2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。突變禾口 缺失亦使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)引入。實(shí)施例1 :phiS9細(xì)胞內(nèi)溶素和CBD的克降和測(cè)序使用現(xiàn)有技術(shù)純化產(chǎn)氣莢膜梭菌細(xì)菌噬菌體phiS9的基因組DNA，并用標(biāo)準(zhǔn)PCR條 件擴(kuò)增plyS9基因以及CBD片段。對(duì)于擴(kuò)增所述phiS9細(xì)胞內(nèi)溶素，使用序列為5’-CTATCAGGATCCATGCAAAGTAGAAAC AATAATAATTTAAAAG-3，(SEQ ID NO 3)的引物 plyS9_f 和序列為 5，-CTATCAGTCGACTTATATT TTCTTAACAAATTCAGCATTAAC-3，(SEQ ID NO 4)的引物 ply_S9_r。plyS9_f 將 BamHl 限制性 位點(diǎn)和起始密碼子，plyS9-i 將MlI限制性位點(diǎn)和終止密碼子引入所述序列。將經(jīng)擴(kuò)增的 基因通過(guò)所述BamHl和Mil限制性位點(diǎn)克隆入pQE質(zhì)粒Oliagen，包含6x His標(biāo)記的序 列)。對(duì)于擴(kuò)增所述CBD片段，使用下述正向引物序列為5’-ATCAGAGCTCTCAAATAATTTT ACTTTAGACAATGC-3，(SEQ ID NO :5)的 CBD_S9A-f、序列為 5，_ATCAGAGCTCGATATGMTGAGTTCA CTAATGG-3，(SEQ ID NO :6)的引物CBD_S9B-f、序列為 5，_ATCAGAGCTCGATTCATGGGTTGGATTCC AATATTC-3，(SEQ ID NO :7)的 CBD_S9C-f 和序列為 5，_ATCAGAGCTCGATTCATGGGTTGGATTCCAAT ATTC-3' (SEQ ID NO :8)的CBD_S9D_f。所有變體的擴(kuò)增均使用反向引物ply_S9CBD_r(SEQ ID NO :9)，其序列為 5，-ATCAGTCGACTTATATTTTCTTAACAAATTCAGC-3，并可引入 MlI 限制性位點(diǎn) 和終止密碼子。所有正向引物均引入McI限制性位點(diǎn)和起始密碼子。將經(jīng)擴(kuò)增的基因通過(guò) 所述 Mel 和 Mil 限制性位點(diǎn)克隆入質(zhì)粒 pHGFP ( Lossner 等，2002，Mo 1. Microbiο 1. 44/2， 335-；349)，后者包含克隆入pQE30的BamHHacI位點(diǎn)的gfp_mut2，產(chǎn)生6xHis標(biāo)記的GFP。 為了驗(yàn)證所需要的序列，對(duì)所有得到的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例2 在大腸桿菌(E. coli)中表達(dá)plyS9和CBD片段以及純化重組蛋白在大腸桿菌XL-I Blue MRF’中表達(dá)plyS9和CBD片段。在表達(dá)plyS9時(shí)，共表達(dá)質(zhì) 粒pACYC-IRLlO，其提供tRNAAl:g、tRNAIle和tRNA^的tRNA基因。為了使所述菌株生長(zhǎng)較佳， 使用的抗生素濃度僅為50μ g/ml的氨芐青霉素、15μ g/ml的四環(huán)素和5μ g/ml的氯霉素。 表達(dá)實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行取5ml過(guò)夜培養(yǎng)物接種至含有上述抗生素的250ml LB-PE培養(yǎng)基(15g/1胰蛋白胨，8g/l酵母提取物，5g/l NaCl, pH 7. 8)并在IOOOml燒瓶中在37°C (plyS9)或 30°C (CBD片段)通氣振蕩。當(dāng)600nm光密度(OD6J為0. 6時(shí)，用ImM IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物， 并繼續(xù)培育4小時(shí)以任其產(chǎn)生蛋白質(zhì)。在誘導(dǎo)前，以及誘導(dǎo)后1、2和4小時(shí)取樣以供SDS PAGE分析。在4小時(shí)后，通過(guò)離心收獲細(xì)胞(Beckmann J2-21，用JA-10轉(zhuǎn)子，7000rpm，20分 鐘，I(TC)；將每250ml生長(zhǎng)培養(yǎng)基的離心沉淀懸于8ml緩沖液A (50mM Na-P pH 8. 0，5mM咪 唑，0.1%Tween 20,500mM NaCl)。將細(xì)胞通過(guò)兩次通過(guò) French Pressure Cell Press (SLM Aminco,1260PSI, inset :20k)來(lái)使細(xì)胞破裂，在此之前進(jìn)行一輪_20°C的凍融來(lái)提高細(xì)胞 破裂的效率。對(duì)含有所需蛋白質(zhì)的上清液進(jìn)行離心(Sigma 1301，用轉(zhuǎn)子19776，20000g， 40分鐘，IO0C )和過(guò)濾(孔大小0. 2 μ m)來(lái)去除細(xì)胞碎片。將粗提取物儲(chǔ)藏于冰上以供進(jìn) 一步處理。plyS和CBD片段的純化使用用緩沖液A平衡的裝有Iml Ni-NTA超流(superflow) 樹(shù)脂(Qiagen)的Micro Bio-Spin色譜柱(Biorad)進(jìn)行。在粗提取物穿過(guò)之后，用緩沖 液 A(5 個(gè)柱體積)和 10%緩沖液 B(50mM Na-P pH 8. 0，250mM 咪唑，0. 1% Tween 20,500mM NaCl)和90%緩沖液A (3柱體積)的混合物洗柱。使用100%緩沖液B O柱體積)從柱上 洗脫蛋白質(zhì)。從粗提取物、用10%緩沖液B的洗滌步驟的流過(guò)物、及洗脫物取樣進(jìn)行SDS PAGE分析。通過(guò)在4°C在輕柔的攪拌和Ix緩沖液交換下透析(Spectra/Por，Spectrumlabs, MWCO :6000-8000)2小時(shí)來(lái)去除鹽和咪唑。通過(guò)透析降低鹽濃度導(dǎo)致蛋白質(zhì)的大量損失，因 此最后使用高鹽透析緩沖液(50mM Na-P pH 8.0,0. 1 % Tween 20,500mM NaCl)來(lái)僅去除咪 唑。在透析后，對(duì)樣品進(jìn)行過(guò)濾滅菌(0.2μπι孔徑)，并通過(guò)離心(Sigma3K30，用19777轉(zhuǎn) 子，8000g，4°C，在來(lái)自Vivascience的Vivaspin 4ml濃縮管中進(jìn)行)來(lái)濃縮。將經(jīng)純化 的蛋白質(zhì)在50%甘油中儲(chǔ)藏于-20°C。通過(guò)在添加酶10分鐘之內(nèi)每15秒測(cè)定細(xì)胞懸液的0D_(Libra S22光度計(jì)， Biochrom)來(lái)測(cè)定plyS9針對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的溶解活性。將6μ g純化的plyS9置于半微米 (half-micro)比色杯底部，然后用底物細(xì)胞懸液填充至Iml總體積。陰性對(duì)照進(jìn)行相同的 步驟，但使用高鹽透析緩沖液和甘油的滅菌的50 50混合物替代純化的plyS9溶液。將底物細(xì)胞在5-10ml合適的培養(yǎng)基中培育至推定為晚對(duì)數(shù)期或平臺(tái)期。將產(chǎn)氣 莢膜梭菌菌株在厭氧條件下在液體TYG培養(yǎng)基(30g/l胰蛋白胨，20g/l酵母提取物，5g/l 葡萄糖，0.5g/l L-半胱氨酸，pH 7.2)中在37°C培育大約4小時(shí)。酪丁酸梭菌菌株以相同 方式處理。將所有其他革蘭氏陽(yáng)性菌在有氧條件下37°C在TB培養(yǎng)基胰蛋白月示, lg/Ι葡萄糖，5g/l NaCl，0.005硫胺素HCl pH 7.4)生長(zhǎng)直至觀察到渾濁。需要高CO2氣氛 的菌株的培育(雞胚雙歧桿菌(Bifidobacterium gallinarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides))使用(SNb ο χ (02發(fā)生器在氣密的 室中用來(lái)自Biolife 的培養(yǎng)液來(lái)進(jìn)行。通過(guò)離心收獲細(xì)胞，重懸于PBS緩沖液(50mM Na-P pH 8. 0,120mM NaCl)，并以20 μ 1等分試樣儲(chǔ)藏于-80°C。就在準(zhǔn)備所述測(cè)定法之前，將所 述等分試樣融解并用25mM檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液(pH 6. 5,120mM NaCl)稀釋。該步驟 是必需的，因?yàn)樵诒蟽?chǔ)藏高濃度的活產(chǎn)氣莢膜梭菌會(huì)導(dǎo)致自溶增強(qiáng)，并因此使得細(xì)胞懸 液在15分鐘之后的粘度增加，從而導(dǎo)致溶解測(cè)定的再現(xiàn)性低。
細(xì)胞內(nèi)名字素plyS9針對(duì)測(cè)試的所有M個(gè)產(chǎn)氣莢膜梭菌均顯示溶解活性。表 1
權(quán)利要求
1.一種多肽，其具有如SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列或其片段。
2.權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述片段具有結(jié)合產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)細(xì)胞壁的生物活性。
3.權(quán)利要求1或2所述的多肽，其中所述片段包含從根據(jù)SEQID NO :1所示氨基酸序 列的氨基酸殘基170-203范圍內(nèi)的氨基酸殘基起、至所述氨基酸序列的氨基酸殘基342止 的氨基酸殘基。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的多肽，其如SEQID NO :10-13所示。
5.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽，其中所述多肽包含生物素殘基、HA-標(biāo)簽、His-標(biāo) 簽、Strep-標(biāo)簽、Myc-標(biāo)簽、Js-標(biāo)簽或GST-標(biāo)簽。
6.一種核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多肽的核苷酸序列。
7.一種載體，其包含權(quán)利要求6所述的核酸。
8.一種宿主細(xì)胞，其由權(quán)利要求6所述的核酸分子或權(quán)利要求7所述的的載體轉(zhuǎn)化。
9.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多肽。
10.權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述組合物是藥物組合物，且還包含藥學(xué)上可接受 的稀釋劑、賦形劑或載體。
11.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多肽，其用作人或動(dòng)物藥用物質(zhì)或診斷物質(zhì)。
12.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多肽，其用于治療、預(yù)防或診斷與病原性梭菌 (Clostridium)菌種，優(yōu)選與產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)的病癥、疾病或病狀。
13.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多肽在處理、預(yù)防或診斷食物、食品加工設(shè)備、食品加 工工廠或與食物相接觸的表面的梭菌污染中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列的多肽，其變體或片段。本發(fā)明還涉及編碼所述多肽的核酸。本發(fā)明還涉及使用所述多肽或其片段作為治療或診斷物質(zhì)以及用于食物或飼料污染的用途。
文檔編號(hào)C07K14/01GK102076708SQ200980125481
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月7日
發(fā)明者弗里茨·艾肯塞赫, 馬丁·萊斯納 申請(qǐng)人:海格羅斯投資有限責(zé)任公司