專利名稱：靶序列的擴增方法、多態(tài)性檢測方法以及其中使用的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有顯示目標多態(tài)性的靶位點的靶序列的擴增方法、多態(tài)性檢測方法以及其中使用的試劑。
背景技術(shù)：
疾病的預防和治療中，在廣泛進行以單核苷酸多態(tài)性(SNP)為代表的基因突變的檢測。例如，發(fā)現(xiàn)癌細胞的基因出現(xiàn)了很多突變，已知它們與細胞的癌變有關(guān)。因此，認為通過細胞中的基因突變的檢測可以確認癌變的可能性和發(fā)展程度等，這在治療中是非常有用的信息。另外，也報告了癌細胞中的顯示耐藥性的基因突變。通過檢測這種突變，能夠判斷藥劑對患者的有效性，因此能夠更適當?shù)剡M行治療。例如，慢性骨髓性白血病(CML)中廣泛使用著抗癌劑伊馬替尼的藥物治療，但是認為bcr-abl基因上的突變(例如、T315I)對耐藥性有影響。這樣，由于檢測基因突變在臨床領(lǐng)域中的早期發(fā)現(xiàn)和治療中是有用的，因此要求高可靠性?；蛲蛔兊臋z測方法一般已知ASP(等位基因特異引物)_PCR(聚合酶鏈式反應) 法(專利文獻1)、Tm(熔解溫度)分析法(非專利文獻1)。上述ASP-PCR法是如下方法 使用與含有靶位點的序列互補并且在3’區(qū)域具有與上述靶位點的堿基互補的堿基的引物作為引物進行PCR，通過擴增含有上述靶位點的靶序列，來判斷突變。例如，在使用將上述靶位點設(shè)定為突變型堿基的突變型引物作為上述引物的情況下，如果確認擴增則判斷為“突變”，如果不能確認擴增則判斷為“正常”。另外，在使用將靶位點設(shè)定為正常型堿基的正常型引物作為上述引物時，如果確認擴增，則判斷為“正?！?，如果不能確認擴增則判斷為“突變”。上述Tm分析，例如，首先在擴增基因中的含有上述靶位點的靶序列之后，使得到的擴增產(chǎn)物和能夠與含有上述靶位點的序列雜交的探針形成雜交體(雙鏈核酸)。對該雜交體實施加熱處理，通過吸光度等信號測定來檢測伴隨溫度上升的雜交體向單鏈核酸(熔解) 的解離，確定Tm值。然后，基于該Tm值判斷突變。雜交體中的兩條單鏈核酸的互補性越高則Tm值越高，互補性越低則Tm值越低。因此，例如，如果使用將上述靶位點設(shè)定為突變型堿基(X)的突變型探針作為上述探針，則能夠如下所述地判斷突變。首先，預先對上述靶位點為突變型堿基的靶序列與上述突變型探針的雜交體，預先求出Tm值(評價標準Tm值)。 另一方面，如前文所述，基于由基因擴增的擴增產(chǎn)物和上述突變型探針來確定Tm值(測定 Tm值)。然后，比較該評價標準Tm值和測定Tm值。其結(jié)果，如果測定Tm值與評價標準Tm 值相同，則判斷為上述擴增產(chǎn)物的靶序列和上述探針為完全匹配，即上述靶位點為突變型堿基(X)，突變存在。另一方面，上述測定Tm值低于上述評價標準Tm值，則由于上述擴增產(chǎn)物的靶序列與上述探針為錯配，因此判斷為上述靶位點為正常型堿基(Y)，不存在突變。但是，上述ASP-PCR法雖然靈敏度優(yōu)異，但存在缺乏特異性的問題。例如，在使用上述突變型引物時，有雖然上述靶位點不存在突變，但是確認了擴增，判斷為假陽性的顧慮。另外，上述ASP-PCR法中，在一個反應體系中，僅能使用上述突變型引物和上述正常型引物中任一者。因此，為了確認靶位點為突變型還是正常型，需要對使用上述突變型引物的反應體系和使用上述正常型引物的反應體系總共兩種反應體系，進行PCR。由于如此使用兩種反應體系，因此需要花費操作功夫和時間以及成本。另一方面，上述Tm分析法由于特異性優(yōu)異，因此可以避免假陽性的問題，另外，在一個反應體系中，能夠判斷上述靶位點是正常型還是突變型。但是，上述Tm分析法存在靈敏度不充分的問題。尤其是，如前文所述，在檢測癌細胞的基因突變的情況下，從患者采集的樣品中混合存在有目標基因突變的細胞和正常細胞。因此，例如，要求對于含有大量的正?；蚝蜕倭康耐蛔兓虻纳镌嚇?，也能夠準確地檢測突變的有無?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1 專利第觀53864號公報非專利文獻非專利文獻1 =AnalyticalBiochemistry, Vol. 290，p. 89-97 (2001)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題因此，本發(fā)明的發(fā)明人確立了使用正常型引物、突變型引物以及探針的、新的多態(tài)性檢測方法。上述正常型引物為擴增靶位點為正常型堿基的正常型靶序列的引物，上述突變型引物為擴增靶位點為突變型堿基的突變型靶序列的引物，上述探針為能夠與含有上述靶位點的序列雜交的探針。具體而言，在含有上述正常型引物和上述突變型引物的一個反應體系中，對模板核酸進行擴增反應，再使用上述探針進行Tm分析，檢測多態(tài)性。通過該方法，由于使用上述正常型引物和上述突變型引物兩者，因此，能夠分別特異性擴增上述正常型靶序列和上述突變型靶序列兩者。并且，由于進行使用了上述探針的Tm分析，因此能夠在一個反應體系中，檢測正常型和突變型。另外，在僅存在正常型的模板核酸的情況下，比起上述突變型引物，上述正常型引物優(yōu)先與上述正常型的模板核酸退火，因此，上述突變型引物的退火而造成的錯誤擴增被抑制。因此，在使用了上述探針的多態(tài)性的檢測中，能夠防止突變型的假陽性。如此，通過該方法，能夠在一個反應體系中，以優(yōu)異的可靠性判斷靶位點為正常型、突變型還是兩者均含有。但是，進行進一步研究的結(jié)果，明確了根據(jù)條件不同，擴增反應后的Tm分析中，存在產(chǎn)生假陽性的顧慮。具體而言，例如在將血液等生物試樣未精制而直接供擴增使用時，在擴增反應中存在比起通常而言更大量的聚合酶時，引物的退火溫度低于通常時等條件。在這樣的條件的情況下，上述突變型引物與上述正常型靶序列退火，突變型靶序列被擴增，其結(jié)果，有可能顯示突變型的假陽性。因此，本發(fā)明的目的在于，例如提供能夠抑制引物的錯誤退火而引起的擴增的擴增方法，由此能夠抑制假陽性的多態(tài)性檢測方法以及其中使用的試劑。解決問題的手段為了達到上述目的，本發(fā)明的靶序列的擴增方法的特征在于，所述方法包括在含有下述引物(Xl)和下述引物(X2)的反應體系中，擴增模板核酸中的靶序列的擴增步驟，上述靶序列為含有顯示多態(tài)性的靶位點的序列，上述靶位點的堿基(X)為第1 堿基(xl)或第2堿基(x2)，
引物(Xl)為如下引物具有序列(Al，)和序列(El)，上述序列(Al’ )為與上述模板核酸中的部分序列(Al)互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(Al)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第1堿基(xl)互補的堿基(χΓ )，上述序列(El)為與和上述模板核酸中的上述部分序列(Al)的3’末端鄰接的部分序列(Bi)非互補的序列，結(jié)合在上述序列(Al’ )的5’末端，引物(Χ2)為如下引物具有序列(Α2’)，上述序列(Α2’ )為與上述模板核酸中的部分序列(Α2)互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(Α2)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第2堿基(χ2)互補的堿基(χ2’)。本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法的特征在于，利用上述本發(fā)明的擴增方法擴增含有模板核酸中的靶位點的靶序列的步驟，以及利用能夠與上述靶序列雜交的探針檢測上述靶序列中的上述靶位點的多態(tài)性的步驟。本發(fā)明的擴增試劑用于上述本發(fā)明的擴增方法中使用，其特征在于，模板核酸中的靶序列為含有顯示多態(tài)性的靶位點的序列，上述靶位點的堿基(χ)為第1堿基(xl)或第 2堿基(χ2)，含有下述引物(Xl)和下述引物(Χ2)。本發(fā)明的檢測試劑在上述本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法中使用，其特征在于，含有上述本發(fā)明的擴增試劑以及能夠與含有模板核酸中的靶位點的靶序列雜交的探針。發(fā)明效果通過本發(fā)明例如能夠防止引物的錯誤退火。因而，結(jié)果能夠抑制假陽性，進行可靠性優(yōu)異地進行多態(tài)性檢測。因此，可以說本發(fā)明例如在通過基因多態(tài)性檢測而進行治療和診斷的近年臨床領(lǐng)域中，是極其有用的。


圖1是示出本發(fā)明的引物的示例的概略圖。圖2是示出本發(fā)明的引物的退火以及其延伸鏈的示例的概略圖。圖3是示出本發(fā)明的引物的退火以及其延伸鏈的示例的概略圖。圖4是示出引物的退火以及其延伸鏈的示例的概略圖。圖5是示出比較例1-1和本發(fā)明的實施例1-1中的Tm分析的結(jié)果的圖。圖6是示出本發(fā)明的實施例1-2中的Tm分析的結(jié)果的圖。
具體實施例方式本發(fā)明人進行銳意研究后，獲得了關(guān)于假陽性的原因的見解。以下使用圖4進行說明。圖4是示出正常型引物和突變型引物的退火以及其延伸鏈的示意圖。正常型模板核酸的靶位點是正常型堿基，上述正常型引物包括與具有正常型模板核酸中的正常型堿基的部分序列互補的序列。突變型模板核酸的靶位點為突變型堿基，上述突變型引物包括與具有突變型模板核酸的突變型堿基的部分序列互補的序列。在圖4中，將上述正常型引物能夠和上述突變型引物退火的鏈作為順鏈，用(+)表示。上述正常型引物、上述突變型引物以及來自這些引物的延伸鏈作為逆鏈。圖4中，上述正常型引物和上述突變型引物是用于延伸逆鏈的逆方向引物。圖4中，白圈表示正常型堿基、黑圈表示突變型堿基(以下相同)。作為逆方向引物，在使用上述正常型引物和上述突變型引物的情況下，例如基于以下的理由，存在產(chǎn)生假陽性的可能性。模板核酸僅為上述正常型模板核酸(+)的情況下， 通常，上述正常型引物比上述突變型引物更容易與上述正常型模板核酸(+)退火(圖4A)。 因此，從上述正常型引物生成正常型延伸鏈(_)作為逆鏈，并且，從順方向引物生成正常型延伸鏈(+)作為順鏈(圖4B)。但是對于上述正常型延伸鏈(+)，上述突變型引物的錯配僅對于靶位點的一個堿基。因此，如圖4C所示，對于上述正常型延伸鏈(+)，不僅僅上述正常型引物，還存在上述突變型引物退火的可能性(雖然是低概率)(圖4C中的*1)。如此，當上述突變型引物退火時，如圖4D所示，雖然不存在突變型模板核酸，但是除上述正常型延伸鏈(+)之外，還生成靶位點取代成突變型堿基的突變型延伸鏈(+)(圖4D中的巧)。然后，如圖4E所示，對于上述突變型延伸鏈(+)，由于比起上述正常型引物，突變型引物更容易退火，因此反復進行突變型延伸鏈(+)的擴增(圖4E中的。此外，前述的突變型引物對正常型延伸鏈(+)的錯誤對火在擴增反應任何循環(huán)中都會產(chǎn)生。因此，對于正常型延伸鏈(+)，新產(chǎn)生了突變型引物的退火(圖4E中的、)。如此，由于突變型引物對正常型延伸鏈的退火，而引起生成突變型延伸鏈，結(jié)果存在后面的Tm分析中顯示假陽性的量的突變型延伸鏈生成的顧慮。因此，本發(fā)明人為了防止作為假陽性的原因的引物的錯誤退火，而完成了本發(fā)明。本發(fā)明中，在模板核酸中，將目標多態(tài)性發(fā)生的位點稱作“靶位點”，將含有上述靶位點的序列稱為“靶序列”。以下，在上述靶位點為突變型堿基Umt)的情況下，將上述模板核酸稱為“突變型模板”，將上述靶序列稱為“突變型靶序列”，將上述基因稱為“突變型基因”。在上述靶位點為正常型堿基(Xwt)的情況下，將上述模板核酸也稱為“正常型模板”，將上述靶序列也稱為“正常型靶序列”，將上述基因也稱為“正常型基因”。“正常型”例如也可稱作“野生型”。本發(fā)明中，將擴增反應開始前反應體系中包含的核酸稱作“模板核酸”，在上述擴增開始之后，在含有上述模板核酸的上述反應體系中，將由擴增反應生成的核酸稱作“擴增產(chǎn)物或者延伸鏈”。本發(fā)明中，模板核酸可以是單鏈，也可以是雙鏈。在上述模板核酸為雙鏈的情況下，構(gòu)成雙鏈的兩條單鏈中，任何一條只要是上述引物(Xi)和上述引物m能夠退火的鏈即可。本發(fā)明中，為了方便起見，將上述引物(Xi)和上述引物腦能夠退火的鏈稱為“順鏈或⑴鏈”，將其方向稱為“順方向”，將上述順鏈的互補鏈稱為“逆鏈或者㈠鏈”，將其方向稱為“逆方向”。另外，將與上述順鏈退火延伸上述逆鏈的引物，例如，上述引物(Xi)和上述引物(X》等稱為“逆方向引物”，將與上述逆鏈退火延伸上述順鏈的引物，例如后述的引物(Yi)等稱作“順方向引物”。此外，還是為了方便起見，例如將上述引物(Xi)和上述引物 (X2)能夠退火的鏈稱為“逆鏈”。另外，在本發(fā)明中，為了方便起見，在說明中使用了上述順鏈(+)和上述逆鏈(-)的術(shù)語，但是例如在基因的情況下，一者為正義鏈，一者為反義鏈。本發(fā)明中，堿基序列的末端為5’末端或3’末端，分別表示堿基序列的5’側(cè)或者 3’側(cè)的最端部的堿基。另外，5’區(qū)域為從堿基序列的5’末端起數(shù)個堿基的區(qū)域，3’區(qū)域為堿基序列的3’末端起數(shù)個堿基的區(qū)域。上述數(shù)個堿基無特別限制，例如為從末端起1個堿基 10個堿基、1 4個堿基、1 3個堿基、1 2個堿基。本發(fā)明中，從堿基序列的末端起第Z位的堿基(Z為正整數(shù))按照以末端堿基為第1位的順序，例如從末端起第1位的堿基表示末端的堿基，從末端起第2位的堿基表示末端堿基的相鄰堿基。<擴增方法>本發(fā)明的靶序列的擴增方法，如前文所述，其特征在于，在含有上述引物(Xl)和上述引物擬、的反應體系中，擴增模板核酸中的靶序列的擴增步驟，上述靶序列為含有顯示多態(tài)性的靶位點的序列，上述靶位點的堿基(X)為第1堿基(xl)或第2堿基(x2)。上述引物(Xl)具有序列(Al，)和序列(El)。上述序列(Al，)為與上述模板核酸中的部分序列(Al)互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(Al)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第1堿基(xl)互補的堿基(xl’)。上述序列(El)為與和上述模板核酸中的上述部分序列(Al)的3’末端鄰接的部分序列(Bi)非互補的序列，結(jié)合在上述序列(Al’ )的 5，末端。上述序列(El)例如也稱作附加序列。上述引物(X2)具有序列(A2，)。上述序列(A2’ )為與上述模板核酸中的部分序列m互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(A2)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第2堿基(x2)互補的堿基(x2’)。在設(shè)定上述引物 (Xl)和、\1、時，上述靶位點表示在上述模板核酸中顯示多態(tài)性的相同位點的意思。上述模板核酸的上述靶位點的堿基(χ)無特別限制，只要是目標的靶位點中的多態(tài)性的堿基即可，例如可以是正常型堿基(Xwt)和突變型堿基Umt)。以下，將上述靶位點的堿基(X)為正常型堿基(Xwt)的引物稱為“正常型引物”，將為突變型堿基Umt)的引物稱為“突變型引物”。上述第1堿基(xl)為正常型堿基(Xwt)、上述第2堿基(U)為突變型堿基(Xfflt)的情況下，將上述引物(Xl)稱為正常型引物(Xlwt),將上述引物(X2)稱為突變型引物(X2mt)。在上述第1堿基(xl)為突變型堿基(Xmt)、上述第2堿基(U)為正常型堿基 (xwt)的情況下，將上述引物(Xl)稱為突變型引物(Xlmt),將上述引物(X2)稱為正常型引物 (X2wt)。以下使用圖1和圖2，說明利用本發(fā)明能夠防止前述那樣的引物的錯誤退火的理由。另外，作為本發(fā)明的示例，將第1堿基(xl)設(shè)定為正常型堿基(Xwt)，將引物(Xl)設(shè)定為正常型引物(Xlwt),將第2堿基(U)設(shè)定為突變型堿基(xmt)，將引物、\1、設(shè)定為突變型引物(X2mt)，來進行說明。其條件和圖示的結(jié)構(gòu)只是示例而已，本發(fā)明不限于此。另外，本發(fā)明不限于以下理由。圖IA是示出正常型模板(例如正常型基因)和上述正常型引物(Xlwt)的關(guān)系的示意圖，圖IB是示出突變型模板(例如突變型基因)和上述突變型引物(X2mt)的關(guān)系的示意圖。上述正常型模板的靶位點的堿基(χ)為正常型堿基(Xwt)，上述突變型模板的靶位點的堿基(χ)為突變型堿基Umt)。圖2是示出上述正常型引物(Xlwt)和突變型引物(X2mt)的退火以及其延伸鏈的示意圖。圖1和圖2以正常型引物(Xlwt)和突變型引物(X2mt)能夠退火的鏈為順鏈，用(+)表示，將正常型引物(Xlwt)和突變型引物(X2mt)以及來自上述各引物的延伸鏈稱為逆鏈(以下相同)。圖2中，白圈表示正常型堿基，黑圈表示突變型堿基(以下相同)。首先說明正常型引物(Xlwt)的結(jié)構(gòu)。如圖IA所示，預先將正常型模板(+)的序列中5’區(qū)域具有靶位點的正常型堿基(Xwt)的序列確定為部分序列(Al)，將和上述部分序列 (Al)的3’末端鄰接的序列確定為部分序列(Bi)。與此相對，正常型引物(Xlwt)為具有與上述部分序列(Al)互補的序列(Al’)和與上述部分序列(Bi)非互補的序列(El)的結(jié)構(gòu)。上述部分序列(El)結(jié)合在上述序列(Al’ )的5’末端。正常型引物(Xlwt)中，與正常型堿基(Xwt)對應的互補的堿基(xwt’ )位于序列(Al’ )的3’區(qū)域。接著，說明突變型引物(X^lt)的結(jié)構(gòu)。如圖IB所示，預先將突變型模板⑴的序列中、5’區(qū)域具有靶位點的突變型堿基Ocmt)的序列確定為部分序列(A2)。與此相對，突變型引物(X2mt)為具有與部分序列(A2)互補的序列(A2，)的結(jié)構(gòu)。突變型引物(X2mt)中， 與突變型堿基(Xmt)對應的互補的堿基Umt’ )位于序列(A2’ )的3’區(qū)域。圖1所示的其它結(jié)構(gòu)稍后敘述。接著，說明正常型引物(Xlwt)和突變型引物(X2mt)的退火以及其延伸鏈。在模板核酸僅為正常型模板(+)的情況下，正常型引物(Xlwt)比突變型引物(X2mt)更容易與正常型模板(+)退火(圖2A)。由退火的正常型引物(Xlwt)生成靶位點為正常型的正常型延伸鏈(_)。這里，正常型引物(Xlwt)在5’區(qū)域具有與模板非互補的附加序列(El)。因此，正常型延伸鏈㈠為在5’區(qū)域具有附加序列(El)的序列。接著，基于該正常型延伸鏈(_)， 利用順方向引物生成與正常型延伸鏈(_)互補的正常型延伸鏈(+)(圖2B)。該正常型延伸鏈⑴與正常型延伸鏈㈠互補，因此在3’區(qū)域具有與上述附加序列(El)互補的序列 (ΕΓ )。因此，如圖2C所示，正常型引物(Xlwt)以比起突變型引物(X2mt)更優(yōu)異的親和性與上述正常型延伸鏈(+)退火。這是因為突變型引物(X2mt)具有相對靶位點(Xwt)的錯配并且沒有相對于上述序列(El’ )的互補序列(El)，正常型探針(Xlwt)與靶位點(Xwt)匹配并且具有相對于上述序列(El’ )的互補序列(El)。如此，由于正常型引物(Xlwt)具有上述附加序列(El)，順鏈的正常型延伸鏈(+)中必然含有上述序列(ΕΓ )。因此，優(yōu)先產(chǎn)生正常型引物(Xlwt)對正常型延伸鏈(+)的退火，突變型引物(X2mt)的退火被充分抑制。因此，通過本發(fā)明，例如能夠防止由于突變型引物錯誤退火而引起的擴增，由此能夠充分抑制多態(tài)性檢測中的假陽性。這里，作為示例將第1堿基(xl)設(shè)定為正常型堿基(Xwt)，將第2 堿基(x2)設(shè)定為突變型堿基(Xmt)，并說明了，但是如后所述，并不限于此。本發(fā)明如前文所述，由于上述引物(Xl)具有上述附加序列(El)，能夠抑制含有不存在的多態(tài)性堿基的靶序列錯誤擴增。因此，優(yōu)選將希望防止作為假陽性的原因的錯誤擴增的多態(tài)性堿基設(shè)定為上述第2堿基(U)。并且，優(yōu)選將不是假陽性的原因的另一多態(tài)性堿基作為上述第1堿基(xl)。上述靶位點的堿基(χ)如前文所述，例如有正常型堿基(Xwt) 和突變型堿基(Xmt)。這種情況下，第1堿基(xl)和第2堿基(U)中的任何可以是正常型堿基(Xwt)，任何可以是突變型堿基(xmt)。在臨床領(lǐng)域中，如前文所述，基因一般在顯示多態(tài)性的靶位點具有正常型堿基。因此，判斷是否存在具有突變型堿基的基因是非常重要的。 因此，在僅存在正常型基因的情況下，一旦突變型靶序列的擴增被確認，則成為存在突變型基因，導致假陽性的結(jié)果。因此，本發(fā)明中，例如，優(yōu)選防止含有突變型堿基的突變型靶序列的錯誤擴增。因此，優(yōu)選將上述第1堿基(xl)設(shè)為正常型堿基(Xwt)，上述引物(Xl)設(shè)為正常型引物(Xlwt),上述第2堿基(U)設(shè)為突變型堿基(Xmt)，上述引物、\1、設(shè)為突變型引物(X2mt)。另外，不限于此，例如，在靶位點處存在多個突變型堿基(Xmt)的情況下，上述模板核酸的靶位點的堿基例如可以是任何兩種突變型堿基Umt)。本發(fā)明中，上述引物(Xl)由于在其3’區(qū)域具有上述序列(Al’)，因此例如上述序列(Al’)的3’末端成了上述引物(Xl)的3’末端。另外，上述引物(X2)在其3’區(qū)域具有上述序列(A2’)，因此例如上述序列(A2’ )的3’末端成了上述引物(X2)的3’末端。
上述引物(Xl)的序列(Al’ )如前文所述，是與上述模板核酸的部分序列(Al)互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(Al)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第1堿基(xl) 互補的堿基(xl’)。另外，上述引物擬、的序列(A2’ )如前文所述，是與上述模板核酸的部分序列(A2)互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(A2)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第2堿基(x2)互補的堿基(x2’)。本發(fā)明中，“互補的堿基”例如是指，腺嘌呤和胸腺嘧啶或尿嘧啶、鳥嘌呤和胞嘧啶等那樣，在形成雙鏈核酸時，處于通過氫鍵等結(jié)合的關(guān)系的堿基。另外，在本發(fā)明中，“與部分序列互補的序列”例如表示能夠相對上述部分序列的全體退火的意思，不僅僅可以是僅由相對上述部分序列完全互補的堿基構(gòu)成的序列，而且也可以是含有一個或者多個相對于上述部分序列非互補的堿基的序列。以下，將僅由上述完全互補的堿基構(gòu)成的序列稱為“完全匹配序列或者全匹配序列”，將含有上述非互補堿基的序列稱為“錯配序列”。上述錯配序列除了與上述靶位點互補的堿基之外，例如還有與上述完全匹配序列相比，缺失、取代、附加或者插入了一個或多個堿基的序列，將這樣的堿基稱為“錯配堿基”。上述錯配堿基的個數(shù)無特別限制，只要能與上述部分序列退火即可，例如1個 30個，優(yōu)選的是1個 5個。另外，上述序列(Al’ )或者上述序列(A2’ )的堿基長中的上述錯配堿基的個數(shù)的比例無特別限制，例如為60%以下，優(yōu)選的是10%以下。其中，上述引物(Xl)的序列(Al’)優(yōu)選相對上述部分序列(Al)為完全匹配序列，上述引物(X2)的序列 (A2’)優(yōu)選相對上述部分序列m為完全匹配序列。本發(fā)明中，由上述引物(Xl)具有上述附加序列(El)，來以高可靠性實現(xiàn)對上述那樣的引物的錯誤退火的防止。其效果尤其在如下情況下有效即靶位點為第1堿基(xl)的模板核酸和靶位點為第2堿基(U)的模板核酸中，試樣中僅包含前者的情況下。另一方面，在上述試樣中不僅包含靶位點為第1堿基(xl)的模板核酸，而且含有靶位點為第2堿基(x2)的模板核酸的情況下，不僅擴增含有第1堿基(xl)的靶序列，而且擴增含有第2堿基(O的靶序列。如此，在含有靶位點為第1堿基(xl)的模板核酸和靶位點為第2堿基 (x2)的模板核酸的情況下，優(yōu)選比起含有第1堿基(xl)的靶序列，優(yōu)先擴增包含第2堿基 (x2)的靶序列。具體而言，例如，優(yōu)選比起包含正常型堿基作為上述第1堿基(xl)的靶序列，優(yōu)先擴增包含突變型堿基作為上述第2堿基(x2)的靶序列。如前文所述，由于多態(tài)性可以成為癌等疾病的指標，因此希望高靈敏度地檢測靶位點是否為正常型堿基和突變型堿基中的某種。例如，在癌癥的情況下，采集的組織片等生物試樣不僅含有癌細胞，還含有大量的正常細胞。因此，對于來源于采集的組織片中的少量癌細胞的模板核酸，希望比起來源于大量的正常細胞的模板核酸，更高效地擴增靶序列。另外，在疾病的早期階段，例如，生物試樣中，比起突變型模板核酸，含有大量的正常型模板核酸。因此，在這樣的情況下，也同樣希望高效擴增突變型的靶序列。因而，在本發(fā)明中，例如，將針對如正常型基因那樣、含有比例相對較高的模板的引物作為上述引物(Xl)，將針對突變型基因那樣、含有比例相對較低的模板的引物作為上述引物(X2)，優(yōu)選如下設(shè)定上述引物(Xl)的上述序列(Al’ )和上述引物(X2)的上述序列(A2，)。以此，能夠比起具有第1堿基(xl)的靶序列，更優(yōu)先擴增具有第2堿基(x2)的靶序列。上述引物(Xl)的上述序列(Al’ )是能夠與上述部分序列(Al)退火的區(qū)域，上述引物(X2)的上述序列(A2’ )是與上述部分序列(A2)退火的區(qū)域。本發(fā)明中，例如優(yōu)選將針對上述引物擬、中上述序列(A2’)的完全匹配序列的親和性，即，退火的容易性，設(shè)置為高于針對上述引物(Xl)中的上述序列(Al’ )的完全匹配序列的親和性。上述各引物的親和性的調(diào)節(jié)無特別限制，例如可以設(shè)定通過Tm值來進行。本發(fā)明中，例如，針對上述引物(X2)中的上述序列(A2’)的完全匹配序列的Tm值優(yōu)選較之針對上述引物(Xl)中的上述序列(Al’ )的完全匹配序列的Tm值為相對較高的值。如此，通過將上述引物(X2)中的序列(A2，)的Tm值設(shè)定為高于上述引物(Xl)中的序列(Al’)，例如， 能夠較之針對含有上述第1堿基(xl)的模板核酸和含有第1堿基(xl)的延伸鏈的、上述引物(Xl)中的序列(Al’ )的結(jié)合性，提高針對含有第2堿基(U)的模板核酸和含有第2 堿基(x2)的延伸鏈的、上述引物(X2)中的序列(A2’ )的結(jié)合性。因此，結(jié)果，能夠較之由上述引物(Xl)帶來的、含有上述第1堿基(xl)的靶序列的擴增效率，提高由上述引物(X2) 帶來的、具有上述第2堿基(x2)的靶序列的擴增效率。如此，若提高擴增效率，則例如即使是試樣中上述靶位點為第2堿基(U)的模板核酸的含量較低的情況下，也能夠充分獲得具有上述第2堿基(U)的靶序列的擴增產(chǎn)物。因此，對于上述第2堿基(U)的多態(tài)性，也能夠在Tm分析中以充分的靈敏度檢測。上述引物(Xl)中的序列(Al’ )的Tm值和上述引物(X2)中的序列(A2’ )的Tm 值之差無特別限制，例如，優(yōu)選大于0小于等于20°C，更優(yōu)選的是大于0小于等于10°C，特別優(yōu)選的是大于0小于等于5°C。上述引物(Xl)中的序列(Al，)的Tm值和上述引物(X2)中的序列(A2，)的Tm值的設(shè)定方法無特別限制。Tm值例如可以根據(jù)上述序列(Al’)和上述序列(A2’)的長度，以及上述各序列中的GC含量等來調(diào)節(jié)。在通過長度來調(diào)節(jié)的情況下，一般，長度相對越長，可以將Tm值設(shè)置得相對越高。本實施方式的情況下，例如，優(yōu)選將上述引物、\1、的上述序列 (A2’)的長度設(shè)置為長于上述引物(Xl)的上述序列(Al’)。由此，能夠?qū)⑸鲜鲆?X2)中的序列(A2’ )的Tm值設(shè)置為較之上述引物(Xl)中的序列(Al’ )的Tm值相對較高的值。 另外，在通過GC含量進行調(diào)節(jié)的情況下，例如，GC含量相對越高，可以將Tm值設(shè)置得相對越高。本實施方式的情況下，例如，優(yōu)選將上述引物(X2)中的序列(A2’ )的GC含量，設(shè)置為高于上述引物(Xl)中的序列(Al’)。另外，也可以通過上述序列(Al’ )和序列(A2’ )的長度和GC含量兩者，來調(diào)節(jié)Tm值。除此之外，例如，通過形成含有作為RNA類似物的LNA、 作為肽核酸的PNA、作為交聯(lián)核酸的BNA等的序列，例如能夠較之不含有這些的序列，將Tm 值設(shè)置得相對較高。在將上述引物(X2)的序列(A2，)設(shè)定為長于上述引物(Xl)的序列(Al，)的情況下，兩者的長度之差無特別限制，例如，大于0小于等于20堿基，優(yōu)選的是大于0小于等于10堿基，更優(yōu)選的是大于0小于等于5個堿基。另外，例如，可以使與含有上述第2堿基(x2)的部分序列(A2)退火了的上述引物 (X2)的延伸反應，較之與含有第1堿基(xl)的部分序列(Al)退火了的上述引物(Xl)的延伸反應更容易發(fā)生。由此，例如能夠較之具有第1堿基(xl)的靶序列，更優(yōu)先擴增具有第 2堿基(x2)的靶序列。來自引物的延伸反應的反應性可以調(diào)節(jié)，其方法無特別限制，例如， 可以通過公知的方法來進行。具體例例如有在上述引物擬、的5’區(qū)域附加熒光物質(zhì)和生物素等物質(zhì)的方法，或者附加附加序列的方法等。這些方法例如可以根據(jù)特開2004-337124 號公報等的記載來進行。上述引物(Xl)只要在上述序列(Al’)的3’區(qū)域具有與上述第1堿基(xl)互補的堿基(xl’ )即可，優(yōu)選的是上述序列(Al’ )中，3’末端的第1位的堿基和第2位的堿基中至少一者為相對上述第1堿基(xl)互補的堿基(xl’)，更優(yōu)選的是，在上述序列(Al’ )中 3’末端的堿基為上述堿基(xl’)。例如，將模板核酸的序列假定為“5’ -…acGtt"—3’”、 將上述第1堿基(xl)假定為大寫字母“G”。這種情況下，上述引物(Xl)可以設(shè)計為3’末端的第1位的堿基為上述第1堿基(xl = G)的互補堿基(C)的序列“5’ -…aaC-3’”。另夕卜，上述引物(Xl)例如可以設(shè)計為3’末端的第2位的堿基為上述第1堿基(xl = G)的互補堿基(C)的序列“5’ -…aaCg-3’”。前者的情況下，優(yōu)選將上述3’末端的第1位的堿基設(shè)定為與上述第1堿基(xl) 互補的堿基(xl’)，并將上述3’末端的從第2位至第5’末端的至少一個堿基相對于上述模板核酸設(shè)定為錯配堿基。其中，更優(yōu)選的是將上述3’末端的第2位和第3位中至少一個堿基設(shè)定為相對于上述模板核酸的錯配堿基，將上述3’末端的第2位的堿基設(shè)定為錯配堿基。例如，與前述同樣地，將模板核酸的序列假定為“5’ -…acGit"—3’”、將上述第1堿基 (xl)假定為大寫字母“G”。這種情況下，上述引物(Xl)可以將3’末端的第1位的堿基設(shè)計為上述第1堿基(xl = G)的互補堿基(C)、第2位的堿基設(shè)計為相對于劃線部分的堿基 (t)不是互補的堿基(a)而是錯配堿基⑴的序列“5’ -…aiC-3’”。另外，在后者的情況下，優(yōu)選將上述3’末端的第2位的堿基設(shè)為與上述第1堿基(xl)互補的堿基(xl’)，將上述3’末端的第1位、和/或者從第3位到5’末端的至少一個堿基設(shè)定為相對于上述模板核酸的錯配堿基。其中，更優(yōu)選的是將上述3’末端的第1位和第3位中至少一個堿基設(shè)定為上述錯配堿基，將上述3’末端的第3位的堿基設(shè)定為錯配堿基。例如，與前述同樣地，將模板核酸中的序列假定為“5’-…aCG^--3’”、將上述第1堿基(xl)假定為大寫字母“G”。 這種情況下，上述引物(Xl)可以將3’末端的第2位的堿基設(shè)計為第1堿基(xl = G)的互補堿基(C)、將第3位的堿基設(shè)計為相對于模板核酸的劃線部分的堿基(t)不是互補的堿基(a)而是錯配堿基⑴的序列“5’ -…aiCg-3’”。如此，通過在上述引物(Xl)中的序列 (Al’ )中加入錯配堿基，能夠進一步提高上述引物(Xl)針對含有上述第1堿基(xl)的序列的特異性。上述引物(X2)只要在上述序列(A2’ )的3’區(qū)域具有與上述第2堿基(x2)互補的堿基(x2’)即可，優(yōu)選的是，上述序列(A2’)中，3’末端的第1位的堿基和第2位的堿基中至少一者相對于上述第2堿基(U)為互補的堿基(x2’)，更優(yōu)選的是，在上述序列(A2’) 中，3’末端的堿基為上述堿基&2’)。例如，將模板核酸的序列假定為“5’一^(^ "-3’”、 將第2堿基(U)假定為大寫字母“A”。這種情況下，上述引物、\1、可以設(shè)計成3’末端的第1位的堿基為上述第2堿基(x2=A)的互補堿基⑴的序列“5’-…aaT-3’”。另外，上述引物(X2)例如可以設(shè)計為從3’末端起的第2位的堿基為上述第2堿基(x2 = Α)的互補堿基⑴的序列“5’ -"aaTg-3’”。前者的情況下，優(yōu)選將上述3’末端的第1位的堿基設(shè)為與上述第2堿基(U)互補的堿基(x2’)，并將上述3’末端的從第2位到5’末端的至少一個堿基設(shè)定為相對于上述模板核酸為錯配堿基。其中，優(yōu)選將上述3’末端的第2位和第3位中至少一個堿基設(shè)定為相對于上述模板核酸的錯配堿基，更優(yōu)選的是將上述3’末端的第2位的堿基設(shè)定為錯配堿基。例如，與前述同樣地，將模板核酸中的序列假定為“5’ -…acAit"—3’”，將上述第2堿基O^)假定為大寫字母“A”。這種情況下，上述引物、\1、可以將3’末端的第1位的堿基設(shè)計為上述第2堿基(x2 = Α)的互補堿基(T)、第2位的堿基設(shè)計為相對于模板核酸的劃線部分的堿基⑴不是互補的堿基(a)而是錯配堿基(i)的序列“5’ -…aiT-3’”。另外， 在后者的情況下，將上述3’末端的第2位的堿基設(shè)為與第2堿基(U)互補的堿基(x2’)， 并將上述3’末端的第1位、和/或從第3位到5’末端的至少一個堿基設(shè)定為相對于上述模板核酸的錯配堿基。其中，優(yōu)選將上述3’末端的第1位和第3位中至少一個堿基設(shè)定為上述錯配堿基，更優(yōu)選的是將上述3’末端的第3位的堿基設(shè)定為錯配堿基。例如，如前文所述，將模板核酸中的序列假定為“5’ -…acAit…-3’”，將上述第2堿基(U)假定為大寫字母“A”。這種情況下，上述引物(X2)可以將3’末端的第2位的堿基設(shè)計為上述第2堿基 (x2 = Α)的互補堿基(T)，將第3位的堿基設(shè)計為相對于模板核酸的劃線部分的堿基(t) 不是互補的堿基(a)而是錯配堿基(i)的序列“5’ -…aiTg-3’”。如此，通過在上述引物 (X2)中加入錯配堿基，能夠進一步提高上述引物、\1、針對含有上述第2堿基(U)的序列的上述引物(X2)的特異性。本發(fā)明中，上述引物(Xl)的附加序列(El)如前文所述，為與和上述部分序列 (Al) 3'末端鄰接的上述模板核酸的部分序列(Bi)非互補的附加序列，結(jié)合在上述序列 (Al’)的5’末端。本發(fā)明中，“與部分序列非互補的序列”例如表示相對于上述部分序列不能退火的意思(以下相同)。上述模板核酸的部分序列(Bi)和上述附加序列(El)的互補性，例如將兩者進行比對時，優(yōu)選90%以下，更優(yōu)選的是50%以下，進一步優(yōu)選的是10%以下，特別優(yōu)選的是0%、即優(yōu)選上述附加序列(El)相對于上述部分序列(Bi)完全非互補的堿基構(gòu)成的序列。上述附加序列(El)的堿基長無特別限制，例如為1 50個堿基長，優(yōu)選的是1 20個堿基長，更優(yōu)選的是1 10個堿基長。上述附加序列(El)的堿基長例如相對于上述弓丨物(Xl)的序列(Al’ )的堿基長，例如為1/50 1/1的堿基長，優(yōu)選的是1/20 1/1的堿基長，更優(yōu)選的是1/10 1/2的堿基長。本發(fā)明中，上述引物(X2)還可以具有序列(E2)。上述序列(E2)例如為與和上述模板核酸中的上述部分序列m的3’末端鄰接的部分序列(B》非互補的序列。上述序列(E2)例如可以稱為附加序列。圖IB示出上述引物(X2)的概略。圖IB是示出模板和引物(X2)的關(guān)系的示意圖。 如圖IB所示，預先將模板(+)的序列中、在5’區(qū)域具有靶位點的堿基(x2)的序列確定為部分序列(A2)，將與上述部分序列(A2)的3’末端鄰接的序列確定為部分序列(B2)。與此相對，引物(X2)為具有與部分序列(A2)互補的序列(A2’)和與部分序列(B2)非互補的序列(E2)的構(gòu)成。上述附加序列(E2)結(jié)合在上述序列(A2’ )的5’末端。弓丨物(X2)中，與靶位點的第2堿基(x2)對應的互補的堿基(x2’ )位于序列(A2’ )的3’區(qū)域。上述附加序列(E2)優(yōu)選為與上述附加序列(El)不同的序列。如此，通過使上述引物腦具有上述附加序列(E2)，例如能夠提高上述引物腦針對具有上述第2堿基(x2) 的序列的特異性，結(jié)果，能夠以更優(yōu)異的擴增效率，擴增上述靶位點為第2堿基(U)的靶序列。在上述引物(X2)具有上述附加序列(E2)的情況下，例如，成了圖3所示的擴增反應。圖3是示出使用了具有上述附加序列(El)的引物(Xl)和具有上述附加序列(E2)的引物擬、時的、上述各引物對模板核酸和延伸鏈的退火的示意圖。圖3中，作為示例，將上述引物(Xl)設(shè)定為正常型引物(Xlwt)、將上述引物(X2)設(shè)定為突變型引物(X2mt)，但是如前文所述，本發(fā)明不限于此。圖3是示出本發(fā)明中，在使用了正常型引物(Xlwt)和突變型引物(X^llt)時的上述各引物的退火狀態(tài)的示意圖。在上述試樣中含有正常型模板(+)和突變型模板(+)兩者的情況下，通常，上述正常型引物(Xlwt)容易和上述正常型模板(+)退火，上述突變型引物 (X2mt)容易和上述突變型模板(+)退火(圖3A)。退火的正常型引物(Xlwt)具有附加序列 (El)0因此，來自上述正常型引物(Xlwt)的正常型延伸鏈(_)在5’側(cè)具有上述附加序列 (El)。另一方面，退火的突變型引物(X2mt)具有附加序列(E2)。因此，來自上述引物(X2mt) 的突變型延伸鏈(_)在5’側(cè)具有上述附加序列(E》。因此，通過順方向引物，基于上述正常型延伸鏈(_)生成的互補的正常型延伸鏈(+)具有與上述附加序列(El)互補的序列 (ΕΓ )，基于上述突變型延伸鏈(-)生成的互補的突變型延伸鏈(+)具有與上述附加序列 (E2)互補的序列(E2，)(圖:3B)。另外，上述正常型引物(Xlwt)的附加序列(El)和上述突變型引物(X2fflt)的附加序列(E2)序列不同，因此具有附加序列(El)的正常型引物(Xlwt) 與正常型延伸鏈(+)特異性退火，具有附加序列(E^的突變型引物(X2mt)與突變型延伸鏈 (+)特異性退火。因此，通過正常型引物(Xlwt)以優(yōu)異的擴增效率擴增正常型延伸鏈，通過突變型引物(X2mt)以優(yōu)異的擴增效率擴增突變型延伸鏈。此時，通過將上述引物(Xl)的序列(Al，)和上述引物(X2)的序列(A2，)例如設(shè)定為前述的關(guān)系，也能夠較之引物(Xl) 而優(yōu)先進行由引物擬、進行的擴增。這里，作為示例，將第1堿基(xl)設(shè)定為正常型堿基 (Xwt)、將第2堿基(x2)設(shè)定為突變型堿基(Xmt)并進行了說明，但是，如前文所述并不限于此。上述引物(X2)的附加序列(E2)如前文所述，例如相對于上述模板核酸中的部分序列(B2)為非互補的序列。上述模板核酸中的部分序列(B2)和上述附加序列(E2)的互補性，例如，在將兩者進行比對時，優(yōu)選90 %以下，更優(yōu)選的是50 %以下，進一步優(yōu)選的是 10%以下，特別優(yōu)選的是0%，即優(yōu)選上述附加序列(E2)為僅由相對于上述部分序列(B2) 完全非互補的堿基構(gòu)成的序列。上述引物(Xl)的附加序列(El)和上述引物(X2)的附加序列(E2)，如前文所述， 例如為不同的序列。上述附加序列(El)和上述附加序列(E2)的同源性例如在將兩者進行比對時，優(yōu)選90%以下，更優(yōu)選的是50%以下，進一步優(yōu)選的是10%以下，特別優(yōu)選的是0%。上述附加序列(E2)的堿基長無特別限制，例如為1 50個堿基長，優(yōu)選的是1 20個堿基長，更優(yōu)選的是1 10個堿基長。上述附加序列(E》的堿基長例如相對于上述引物(X2)中的序列(A2，)的堿基長，例如為1/50 1/1的堿基長，優(yōu)選的是1/20 1/1 的堿基長，更優(yōu)選的是1/10 1/2的堿基長。上述附加序列(E2)例如優(yōu)選為與上述引物 (Xl)的附加序列(El)相同的堿基長。上述引物(Xl)的堿基長和上述引物(X2)的堿基長無特別制限。上述引物(Xl) 例如為10 50個堿基長，優(yōu)選的是15 45個堿基長，更優(yōu)選的是16 40個堿基長。上述引物贓例如為10 50個堿基長，優(yōu)選的是15 45個堿基長，更優(yōu)選的是16 40 個堿基長。作為具體例，上述引物(X2)例如在僅由上述序列(A2’ )構(gòu)成的情況下，例如為 10 50個堿基長，優(yōu)選的是15 40個堿基長，更優(yōu)選的是16 35個堿基長。上述引物(X2)例如在含有上述序列(A2’ )和上述附加序列(E2)的情況下，例如為10 50個堿基長，優(yōu)選的是15 40個堿基長，更優(yōu)選的是16 35個堿基長。本發(fā)明在上述擴增步驟，例如還可以與上述引物(Xl)和引物、\1、一并使用下述引物(Yi)。引物(Yl)具有較之上述模板核酸中的上述靶位點更靠近5’側(cè)的部分序列(C)的引物上述引物(Yl)的概略示于圖1C。圖IC是示出模板和引物(Yl)的關(guān)系的示意圖。 如圖IC所示，模板中，將比起上述部分序列(Al)中包含的靶位點更靠近5’側(cè)的部分序列確定為序列(C)。與此相對，上述引物(Yl)為具有上述部分序列(C)的構(gòu)成。作為順鏈(+) 的互補鏈的逆鏈㈠具有相對上述部分序列(C)的互補的序列(C’)。因此，上述引物(Yl) 在該序列(C)中，能夠與上述逆鏈㈠的序列(C’ )退火，擴增順鏈。例如相對于上述引物(Xl)和引物(X2)為延伸逆鏈的引物，上述引物(Yl)為延伸順鏈的順方向引物。因此，例如，作為順方向引物的上述引物(Yi)和作為逆方向引物的上述引物(Xl)和上述引物(X2)，分別為成對的引物。另外，上述引物(Yl)由于是與上述靶位點不同的區(qū)域退火的引物，因此例如與靶位點的堿基的種類無關(guān)，能夠擴增靶序列。上述引物(Yl)的長度，無特別限制，通常優(yōu)選為10 50個堿基，更優(yōu)選的是15 40個堿基，特別優(yōu)選的是16 35個堿基。上述引物(Yl)只要具有較之上述模板核酸中的上述靶位點更靠近5’側(cè)的部分序列(C)即可。上述引物(Yl)例如在其5’側(cè)具有附加序列。上述附加序列例如在模板中，優(yōu)選具有與上述部分序列(C)的5’側(cè)的序列不同的序列。本發(fā)明的擴增方法在上述擴增步驟中，例如還可以向上述反應體系中，添加能夠與上述模板核酸中的含有上述靶位點的序列雜交的探針。上述探針例如由具有標記物質(zhì)的標記探針。本發(fā)明中，例如，可以將單鏈核酸和雙鏈核酸中的任何作為模板核酸，來進行擴增。在后者的雙鏈核酸的情況下，例如可以以構(gòu)成該雙鏈核酸的兩條互補的單鏈分別作為模板，來進行擴增。在上述模板核酸為雙鏈核酸的情況下，例如，⑴鏈中的靶位點和㈠鏈中的靶位點分別對應。在后述的本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法中使用的上述探針例如可以是能夠與上述(+)鏈雜交的探針，也可以是能夠與上述(_)鏈雜交的探針。上述模板核酸如前文所述，可以是單鏈，也可以是雙鏈。上述模板核酸例如可以是 DNA 和總 RNA、mRNA 等 RNA 等。上述模板核酸例如可以是試樣中的核酸，也可以是上述核酸的擴增產(chǎn)物?？梢允巧镌嚇拥鹊脑嚇又邪暮怂帷Ｇ罢呃缈梢允巧镌嚇又性竞械暮怂?。后者例如從能夠提高檢測精度的角度上看優(yōu)選，上述擴增產(chǎn)物例如可以以上述試樣中的核酸為模板，通過核酸擴增法進行擴增來制備。上述擴增產(chǎn)物例如可以是以上述試樣中的DNA為模板的擴增產(chǎn)物，也可以是以由上述試樣中的RNA合成的cDNA為模板的擴增產(chǎn)物。上述試中的RNA例如可以是總RNA、mRNA等RNA，上述cDNA例如可以由上述RNA利用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄 PCR)來合成。上述擴增產(chǎn)物的長度無特別限制，例如為50 1000個堿基，優(yōu)選的是80 200個堿基。本發(fā)明中，上述擴增步驟優(yōu)選以試樣中的核酸為模板，進行擴增反應。上述試樣只要是含有作為模板的核酸的試樣即可，無特別限制，例如，可以是含有來源于生物試樣的核酸的試樣。上述生物試樣例如可以為全血、白血球細胞等血細胞、骨髓、口腔粘膜等口腔內(nèi)細胞、指甲細胞和毛發(fā)細胞等體細胞、生殖細胞、吐出的痰液、羊水、石蠟包埋組織、尿、胃液 (例如胃洗滌液)等、以及它們的懸浮液等。另外，如前文所述，可以將以來源于生物試樣的核酸為模板進行了核酸擴增法的反應液作為本發(fā)4明中的核酸試樣，將上述反應液中含有的擴增產(chǎn)物作為模板核酸。本發(fā)明如前文所述，由于不論試樣是精制的還是未精制的，都能夠抑制引物的錯誤退火，因此本發(fā)明在未精制的試樣的應用中特別優(yōu)異。如此，如果是能夠使用未精制的試樣的方法，則能夠省略用于精制的前處理，因此操作能夠變得更為簡便，也能夠降低成本。在將本發(fā)明的擴增方法應用于后述的本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法中的情況下，上述試樣無特別限制，例如，對于含有靶位點顯示突變型和正常型中的那種不清楚的核酸的試樣、含有具有突變型的核酸和具有正常型的核酸的試樣、有可能含有這些的試樣等，是非常有用的。上述DNA和RNA等核酸的來源不限制，例如，可以為各種癌細胞等細胞、病毒、線粒體等。癌變了的血液細胞等細胞中含有具有顯示突變型的核酸的細胞和具有顯示正常型的核酸的細胞，因此容易引起前述那樣的問題。因此，本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法尤其優(yōu)選應用于具有顯示突變型的核酸和顯示正常型的核酸的試樣中，例如白血病等各種癌細胞等生物試樣，作為具體例優(yōu)選應用于血液試樣和白血球細胞等。另外，本發(fā)明中，試樣的采集方法、 核酸的制備方法等無限制，可以采用目前公知的方法。上述來源于生物試樣的核酸，例如可以通過目前公知的方法來從生物試樣中分離。從全血分離基因組DNA，例如可以使用市售的基因組DNA分離試劑盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit ；GE healthcare Bio Science 公司制造)等。在本發(fā)明的擴增步驟中，同一反應體系中的擴增，例如可以是在一個反應液內(nèi)擴增靶序列。本發(fā)明的擴增方法的特征在于，在上述擴增步驟中使用前述的引物，其它步驟和條件無任何限制。上述擴增步驟中的核酸擴增法無特別限制，例如，有PCR(聚合酶鏈式反應)法、NASBA (基于核酸序列的擴增)法、TMA (轉(zhuǎn)錄介導擴增)法、SDA (鏈置換擴增)法等，其中優(yōu)選PCR法。此外，核酸擴增法的條件無特別限制，可以根據(jù)目前公知的方法來進行。上述擴增步驟中，擴增反應的反應體系(例如反應液)中的核酸試樣的添加比例無特別制限。在上述核酸試樣為生物試樣(例如，全血試樣)的情況下，上述反應體系中的上述生物試樣的添加比例的下限例如優(yōu)選0. 01體積％，更優(yōu)選的是0. 05體積％，進一步優(yōu)選的是0. 1體積％。另外，上述添加比例的上限無特別限制，例如，優(yōu)選2體積％，更優(yōu)選的是1體積％，進一步優(yōu)選的是0. 5體積％。另外，在后述的突變檢測中，例如，在進行使用了探針的光學的檢測的情況下，上述反應體系中的上述生物試樣(例如，全血試樣)的添加比例例如優(yōu)選設(shè)定為0. 1 0. 5 體積％。PCR反應中，通常為了使DNA變性(解離為單鏈DNA)而實施熱處理。利用該熱處理，試樣中包含的糖和蛋白質(zhì)等變性，會有產(chǎn)生不溶沈殿物或者渾濁等的顧慮。因此，在通過光學手法來確認有無突變的情況下，這樣的沈殿物或者渾濁的產(chǎn)生有可能對測定精度產(chǎn)生影響。但是，如果將反應體系中的上述生物試樣的添加比例設(shè)定為前述范圍，則雖然機理不明確，但是例如由于能夠充分防止由于變性而產(chǎn)生沉淀物等而造成的影響，因此能夠提高光學手法的測定精度。另外，由于也充分抑制了上述生物試樣中的雜質(zhì)對PCR的干擾，因此能夠進一步提高擴增效率。因此，通過將全血試樣等生物試樣的添加比例設(shè)定為前述范圍，例如能夠排出用于防止沉淀物或者渾濁的產(chǎn)生或者除去沉淀物或者渾濁的上述試樣前處理的必要性。另外，上述反應體系中的全血試樣的比例可以不用前述那樣的體積比例(例如 0. 1 0.5體積％)，而用血紅蛋白(以下稱作“Hb”)的重量比例表示。這種情況下，上述反應體系中的全血試樣的比例換算成Hb量，例如優(yōu)選0. 565 113g/L，更優(yōu)選的是2. 825 56. 5g/L，更為優(yōu)選的是5. 65 28. 25g/L。此外，上述反應體系中全血試樣的添加比例例如可以滿足上述體積比例和上述Hb重量比例兩者，也可以滿足其中任何一者。全血例如可以是溶血的全血、未溶血的全血、抗凝固全血、含有凝固級分的全血等的任一種。上述擴增步驟中，優(yōu)選在擴增反應開始之前，還向上述反應液中添加白蛋白。通過這樣添加白蛋白，例如能進一步降低上述沉淀物、渾濁的產(chǎn)生所帶來的影響，且能進一步提高擴增效率。上述反應液中白蛋白的添加比例例如為0.01 2重量％，優(yōu)選的是0. 1 1重量％，更優(yōu)選的是0. 2 0. 8重量％。上述白蛋白并無特別限制，例如可以是牛血清白蛋白 (BSA)、人血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、馬血清白蛋白等。這些物質(zhì)可以使用任一種，還可以并用兩種以上。接著，關(guān)于本發(fā)明擴增方法，作為示例，說明作為上述引物(Xl)使用正常型引物 (Xlwt),作為上述引物(X2)使用突變型引物(X2mt)，通過PCR法進行擴增的方法。另外，本發(fā)明不限于此。另外，PCR的條件無特別限制，可以通過目前公知的方法來進行。首先，制備含有模板核酸和前述各種引物的PCR反應液。上述PCR反應液中各種引物的添加比例無特別限制，正常型引物(Xlwt)例如優(yōu)選添加使之為0. 01 10 μ mol/L,更優(yōu)選的是0. 05 5 μ mol/L，特別優(yōu)選的是0. 1 1 μ mol/L。突變型引物(X^llt)例如優(yōu)選添加使之為0. 01 10 μ mol/L,更優(yōu)選的是0. 05 5 μ mol/L,特別優(yōu)選的是0. 1 0. 5 μ mol/L。 上述正常型引物(Xlwt)和突變型引物(X2mt)的摩爾比(Xlwt X2mt)例如優(yōu)選0.001 1 10 1，更優(yōu)選的是0.01 1 2 1，特別優(yōu)選的是0.1 1 1 1。另外，在除了上述正常型引物(Xlwt)和上述突變型引物(X2mt)之外，還并用上述弓丨物(Yl)的情況下，上述引物(Yl)例如優(yōu)選添加使之為0.01 ΙΟμπιοΙ/L，更優(yōu)選的是 0. 05 5ymol/L，特別優(yōu)選的是0. 1 lymol/L。上述突變型引物(X2mt)和上述引物(Yl) 的摩爾比(X2mt Yl)例如優(yōu)選為1 0.001 1 10，更優(yōu)選的是1 0.01 1 2，特別優(yōu)選的是1 0. 1 1 1。上述反應液可以還含有其它成分，例如優(yōu)選含有與PCR反應相關(guān)的成分。上述其它成分無特別限制，本領(lǐng)域人員能夠進行適當設(shè)定。上述其它成分例如DNA聚合酶等聚合酶、核苷三磷酸、溶劑、各種催化劑等。上述反應液中，例如各成分的添加順序無任何限制。上述DNA聚合酶無特別限制，例如，可以使用目前公知的來源于耐熱性細菌的聚合酶。具體例中來源于水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的DNA聚合酶(美國專利第4，889，818號和第5，079，352號)(商品名Taq聚合酶)、來源于嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)的 DNA 聚合酶(W091/09950) (rTth DNA polymerase)、來源于嗜熱古細菌(Pyrococcus furiosus)的 DNA 聚合酶(W092/9689) (Pfu DNA polymerase :Stratagenes 公司生產(chǎn))、來源于極端嗜熱細菌(Thermococcus litoralis)的聚合酶(EP-A45M30 (商標Vent) =New England Biolabs公司制造)等能商業(yè)獲得，其中優(yōu)選來源于水生棲熱菌 (Thermus aquaticus)的耐熱性聚合酶。上述反應液中的DNA聚合酶的添加比例無特別限制，例如為1 100U/mL，優(yōu)選的是5 50U/mL，更優(yōu)選的是20 40U/mL。DNA聚合酶的活性單位⑶一般是以活化鮭魚精子 DNA為模板引物，在活性測定用反應液中，74°C下、30分鐘內(nèi)，將IOnmol的總核苷酸吸收到酸不溶性沉淀物中的活性作為1U。上述活性測定用反應液的組成例如為25mmol/LTAPS緩沖液(pH9. 3、25°C )、50mmol/L KCl、2mmol/L MgCl2、lmmol/L 巰基乙醇、200 μ mol/L dATP、 200ymol/L dGTP、200 μ mol/L dTTPUOO μ mol/L “ α-32P” dCTP、0. 25mg/mL 活化鮭魚精子 DNA。上述核苷三磷酸通常有dNTP (dATP、dCTP、dGTP、以及dTTP或者dUTP)。上述反應液中的dNTP的添加比例無特別限制，例如為0. 01 lmmol/L，優(yōu)選的是0. 05 0. 5mmol/ L,更優(yōu)選的是0. 1 0. 3mmol/L0上述溶媒例如有！"ris-HCl、Tricine、MES、MOPS、HEPES、CAPS等緩沖液，可以使用市售的PCR用緩沖液或者市售的PCR試劑盒的緩沖液等。上述反應液還可以含有肝素、甜菜堿、KCl、MgCl2、MgS04、甘油等。它們的比例例如只要設(shè)定為不干擾PCR反應的范圍即可。上述反應液的總體積并無特別限定，例如可以根據(jù)所用機器(熱循環(huán)儀)等適當?shù)卦O(shè)定，上述體積通常為1 500 μ L、優(yōu)選為10 100 μ Lo接著，進行PCR。PCR例如含有(1)雙鏈DNA解離成單鏈DNA、⑵引物的退火、(3) 引物的延伸(聚合酶反應)這三個步驟。各步驟的條件無特別限制，上述(1)步驟例如優(yōu)選90 99°C、1 120秒，更優(yōu)選的是92 95°C、1 60秒，上述O)步驟例如優(yōu)選40 70°C、1 300秒，更優(yōu)選的是50 70°C、5 60秒，上述(3)步驟例如優(yōu)選50 80°C、1 300秒，更優(yōu)選的是50 75°C、5 60秒。另外，循環(huán)次數(shù)也無特別限制，以上述(1) (3) 三個步驟為一個循環(huán)，例如優(yōu)選30個循環(huán)以上。上限無特別限制，例如總共100個循環(huán)以下，優(yōu)選的是70個循環(huán)以下，更優(yōu)選的是50個循環(huán)以下。各步驟的溫度變化，例如可以使用熱循環(huán)儀等自動地控制。本發(fā)明中，例如，可以在一個反應體系中，對于兩種以上的基因，同時擴增各自的靶序列，另外，也可以對于相同的基因，擴增分別含有位點不同的多態(tài)性的兩種以上的靶序列。這種情況下，可以對每個目標靶序列，準備前述的引物(Xi)和引物m任意準備引物 (Yl)，在它們共存下進行前述那樣的擴增反應。本發(fā)明的靶序列的擴增方法還可以含有檢測通過前述的擴增反應而得到的擴增產(chǎn)物的步驟。由此，例如能夠檢測上述靶序列中的靶位點的多態(tài)性。上述多態(tài)性檢測例如， 可以通過后述的Tm分析來確認。具體而言，例如，在上述擴增步驟中的上述擴增反應的反應體系中，再添加能夠與含有上述模板序列中的上述靶位點的靶序列雜交的探針。然后， 改變上述反應體系的溫度，測定表示上述擴增產(chǎn)物和上述探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號值。由此，能夠基于伴隨溫度變化的上述信號值的變動，來確認突變型或者正常型等多態(tài)性的種類。上述探針的添加時機無特別限制，例如可以在上述擴增反應前、擴增反應中途和擴增反應后的任何階段，添加到上述反應體系中。其中，例如不需要為了添加上述探針而將上述反應液暴露在外部環(huán)境中，另外，可以連續(xù)進行上述擴增反應和信號值的測定，因此，上述探針的添加優(yōu)選在上述擴增反應前。關(guān)于上述多態(tài)性檢測，具體將在后述的本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法中進行說明。另外，關(guān)于上述探針等也如后文所述?！炊鄳B(tài)性檢測方法〉本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法如前文所述，其特征在于，包括利用上述本發(fā)明的擴增方法，擴增含有模板核酸中的靶位點的靶序列的步驟，以及利用能夠與上述靶序列雜交的探針，檢測上述靶序列中的上述靶位點的多態(tài)性的步驟。本發(fā)明的特征在于，通過前述的方法擴增靶序列，對得到的擴增產(chǎn)物，利用探針檢測多態(tài)性，其它的步驟和條件無任何限制。本發(fā)明的檢測方法例如可以含有下述(a) (C)步驟。(a)利用本發(fā)明的擴增方法，來擴增上述靶序列的擴增步驟(b)在上述探針的存在下，改變含有上述(a)步驟中得到的擴增產(chǎn)物的反應體系的溫度，測定表示上述擴增產(chǎn)物和上述探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號值的測定步驟(c)基于伴隨上述溫度變化的上述信號值的變動，檢測上述模板核酸中的上述靶位點的多態(tài)性的步驟本發(fā)明優(yōu)選應用于含有核酸的試樣，上述試樣無特別限制，可以是與前述相同的試樣。另外，上述模板核酸的種類也無特別限制，可以是與前述相同的核酸。以下也將上述探針稱為“檢測用探針”。上述探針無特別限制，可以通過目前公知的方法進行設(shè)定。例如，在上述模板核酸為雙鏈的情況下，可以設(shè)計為與正義鏈的靶序列雜交(正義鏈的檢測用探針)，也可以設(shè)計為與反義鏈的靶序列雜交(反義鏈的檢測用探針)。在設(shè)計上述探針時，上述靶序列中的靶位點的堿基例如可以設(shè)定為正常型堿基，也可以設(shè)定為突變型堿基。即，上述探針例如在與上述靶序列雜交時，與上述靶序列中的靶位點的堿基相對應的堿基例如可以與正常型堿基互補，也可以與突變型堿基互補。本發(fā)明中，例如，在以檢測突變型為目的情況下，優(yōu)選上述探針中，與靶位點的堿基對應的堿基與突變型堿基互補，與正常型堿基非互補。本發(fā)明中，上述探針如前文所述，只要是能夠與含有上述靶位點的靶序列雜交的序列即可。上述探針的序列無特別限制，例如在雜交體形成時，除了與上述靶位點成對的位點的堿基之外，與上述靶序列的互補性例如優(yōu)選為90% 100%，尤其優(yōu)選的是100%，即， 優(yōu)選是與上述靶序列完全匹配的序列。上述反應體系中的探針的添加比例無特別限制，例如優(yōu)選添加上述探針，使之為 10 400nmol/L的范圍，更優(yōu)選的是20 200nmol/L。在上述探針為用熒光染料等標記物質(zhì)標記的標記探針的情況下，例如，為了調(diào)節(jié)檢測的熒光強度等信號強度，可以并用與上述標記探針相同序列的未標記探針。該未標記探針例如可以在其3’末端附加磷酸基。這種情況下，上述標記探針和上述非標記探針的摩爾比例如優(yōu)選1 10 10 1。上述探針的長度無特別限制，例如5 50個堿基長，優(yōu)選的是10 30個堿基長。上述探針可以在上述(a)步驟之后，即進行靶序列的擴增反應之后，添加到擴增反應的反應體系中，但是從能夠容易并且迅速分析的角度，優(yōu)選在上述(a)步驟的擴增反應之前，預先添加到上述反應體系中。上述反應體系中的各種探針的添加比例等如前文所述。如此，在擴增反應之前，將上述探針添加到上述反應體系中的情況下，例如，為了預防探針自身的延伸，可以在其3’末端進一步添加磷酸基，用前述那樣的標記物質(zhì)將3’末端標記。本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法可以用于前述那樣的所謂的Tm分析(也稱為熔解曲線分析)。這里，對Tm分析中的Tm值進行。例如，對含有雙鏈DNA的溶液加熱時，260nm處的吸光度會上升。原因是因為，雙鏈DNA的兩鏈之間的氫鍵由于加熱而斷裂，解離為單鏈 DNA (DNA的熔解)。因此，當所有雙鏈DNA全部解離成為單鏈DNA時，該吸光度顯示為加熱開始時的吸光度(僅雙鏈DNA時的吸光度)的約1.5倍左右。由此可以判斷為熔解完全。 根據(jù)該現(xiàn)象，一般而言，熔解溫度Tm值被定義為吸光度達到吸光度最大上升值的50%時的溫度。在上述步驟(B)中，對表示上述擴增產(chǎn)物和上述探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號的測定，可以如前述，測定260nm處的吸光度，也可以是測定上述標記物質(zhì)的信號。具體而言，作為上述探針，優(yōu)選使用經(jīng)上述標記物質(zhì)標記的標記探針，進行上述標記物質(zhì)的信號測定。上述標記探針例如是單獨顯示信號并且通過形成雜交體而不顯示信號的標記探針；或者是單獨不顯示信號并且通過形成雜交體而顯示信號的標記探針。如果是前一種探針，則與擴增產(chǎn)物形成雜交體(例如雙鏈DNA)時不顯示信號，通過加熱上述探針從上述擴增產(chǎn)物上解離時顯示信號。如果是后一種探針，則通過與上述擴增產(chǎn)物形成雜交體(雙鏈DNA)而顯示信號，通過加熱上述探針從上述擴增產(chǎn)物上解離時信號減少(消失)。因此，通過檢測上述標記物質(zhì)的信號，與測定260nm處的吸光度類似，能夠進行雜交體的熔解過程以及Tm 值的確定等。上述標記物質(zhì)的信號檢測例如可在對上述標記物質(zhì)的信號來說特有的條件下進行檢測，上述條件例如是激發(fā)波長、檢測波長等。上述(C)步驟中，基于信號值的變動檢測上述靶位點的多態(tài)性可以根據(jù)現(xiàn)有的方法來進行。具體例例如，將上述信號值的變動，與上述探針和突變型靶序列的雜交體的變動和/或上述探針和野生型靶序列的雜交體的變動相比較，判斷多態(tài)性是突變型還是野生型。即，與突變型相同則為突變型，與野生型相同則為野生型。另外，例如，基于上述信號的變動求Tm值，和評價標準的Tm值相比較，由此能夠判斷多態(tài)性。首先，基于上述信號值的變動求Tm值。接著，將測定的上述Tm值，與預先求出的關(guān)于野生型靶序列的Tmwt值和/或關(guān)于突變型靶序列的Tmmt值相比較。然后，如果測定的Tm值與評價標準的Tm值wt相同或同等程度，則可以判斷為野生型，如果低于Tmwt值則可以判斷為突變型，如果與評價標準的 Tmfflt值相同或者同等程度則可以判斷為突變型，如果低于Tmmt值則可以判斷為野生型。同等程度是指例如士3°C左右。另外，如前文所述，在上述(a)步驟中，可以在同一反應體系中同時擴增兩種以上的靶序列。然后，對于各擴增產(chǎn)物確認各個靶位點的多態(tài)性。這種情況下，可以對每個含有靶位點的靶序列，準備雜交的探針。上述各探針優(yōu)選使用分別在不同條件下檢測的用不同標記物質(zhì)標記的標記探針。如果使用這樣的探針，則即使在同一反應體系中，也能夠通過改變檢測條件，分別檢測各多態(tài)性。上述標記探針中，上述標記物質(zhì)標記的位點無特別限制。構(gòu)成上述標記探針的寡核苷酸中，上述標記化位點例如優(yōu)選5’區(qū)域或3’區(qū)域，更優(yōu)選的是從5’末端或3’末端起數(shù)第1 4位的位置，更優(yōu)選的是，第1 3位的位置，特別優(yōu)選的是第1位(5’末端或3’末端)或者第2位。如后文所述，上述寡核苷酸中，上述標記物質(zhì)標記的堿基例如優(yōu)選胞嘧啶(c)或鳥嘌呤(g)。上述標記物質(zhì)例如可以直接標記堿基，也可以通過標記含有上述堿基的核苷酸殘基的任何位點(例如，磷酸基)，而間接標記上述堿基。上述標記物質(zhì)無特別限制，例如優(yōu)選通過上述標記探針單獨或者形成雜交體而發(fā)出信號。上述信號的種類無特別限制，例如可以是熒光、呈色、發(fā)色等。在上述信號為熒光的情況下，信號值例如可以是熒光強度。在上述信號為呈色或者發(fā)色的情況下，上述信號值例如可以是反射率、吸光度、透過率等。上述信號可以從上述標記物質(zhì)直接發(fā)出，也可以間接發(fā)出。上述標記物質(zhì)無特別限制，例如可以是熒光團等熒光物質(zhì)。上述熒光物質(zhì)例如可以是熒光素、磷光體、羅丹明、聚甲炔染料衍生物等。市售的熒光物質(zhì)例如為I^acific Blue (注冊商標，Molecular Probes 公司制造)、BODIPY FL (注冊商標，Molecular Probes 公司制造)>FluorePrime (商品名,Amersham Pharmacia 公司制造)、Fluoredite (商品名, Millipore公司制造)、FAM(注冊商標，ABI公司制造)、Cy3以及Cy5(商品名，Amersham Pharmacia公司制造)、TAMRA (商標名，Molecular Probes公司制造)等等。上述熒光物質(zhì)的檢測條件無特別限制，例如可根據(jù)使用的熒光物質(zhì)的種類適當確定。例如，對I^cific Blue而言檢測波長450 480nm、對TAMRA而言檢測波長585 700nm、對BODIPY FL而言檢測波長515 555nm下，能夠進行檢測。如果使用這類標記探針，例如檢測熒光作為上述信號，測定熒光強度作為上述信號值，由此能夠基于熒光強度的變動容易地確認雜交和解
1 O上述標記探針例如優(yōu)選單獨顯示信號并且通過形成雜交體而不顯示信號的標記探針，或者是單獨不顯示信號并且通過形成雜交體而顯示信號的標記探針。在上述標記物質(zhì)是熒光物質(zhì)的情況下，上述標記探針例如優(yōu)選為經(jīng)上述熒光物質(zhì)標記、單獨顯示熒光并且通過形成雜交體而熒光減少(例如淬滅)的探針。這種現(xiàn)象一般稱為熒光淬滅現(xiàn)象 (Quenching phenomenon) 0這種利用該現(xiàn)象的探針，一般稱為熒光淬滅探針。其中，上述熒光淬滅探針例如優(yōu)選寡核苷酸的3’末端或5’末端經(jīng)上述熒光物質(zhì)標記，經(jīng)標記的上述末端的堿基優(yōu)選為胞嘧啶(c)或者鳥嘌呤(g)。在所述末端的堿基為胞嘧啶(c)的情況下，優(yōu)選將上述熒光淬滅探針的堿基序列設(shè)計為使得上述熒光淬滅探針例如在與擴增產(chǎn)物形成雜交體時，上述擴增產(chǎn)物中的與經(jīng)標記的末端的胞嘧啶(c)配對的堿基或與上述配對的堿基距離1 3個堿基的堿基為鳥嘌呤(g)。與上述配對的堿基距離1個堿基的堿基是指上述配對的堿基的相鄰的堿基。這種探針一般稱為鳥嘌呤淬滅探針，已知為所謂QProbe (注冊商標)。這種鳥嘌呤淬滅探針與所述擴增產(chǎn)物雜交時，例如，經(jīng)上述熒光物質(zhì)標記的末端的胞嘧啶(c)靠近上述擴增產(chǎn)物中的鳥嘌呤(g)，由此出現(xiàn)上述熒光物質(zhì)的熒光變?nèi)?熒光強度減少)的現(xiàn)象。如果使用這種探針，例如通過熒光強度的變動，能夠容易地確認雜交和解離。同樣地，在上述末端的堿基為鳥嘌呤(g)的情況下，優(yōu)選將上述熒光標記探針的堿基序列設(shè)計為使得在上述熒光淬滅探針例如與上述擴增產(chǎn)物形成雜交體時，上述擴增產(chǎn)物中的與上述經(jīng)標記的末端的鳥嘌呤(g)配對的堿基或與上述配對的堿基距離1 3個堿基的堿基為胞嘧啶(c)。如前文所述，上述探針例如可以在3’末端附加磷酸基。如后文所述，在擴增反應時，可以使探針共存在擴增反應的反應體系中。這種情況下，如果在上述探針的3’末端附加磷酸基，則能夠充分防止上述探針自身通過上述擴增反應延伸。另外，上述3’末端附加如前述的標記物質(zhì)，也能獲得同樣的效果。接著，對本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法，以利用PCR進行擴增反應，使用標記探針作為上述檢測用探針的示例進行為例進行說明。另外，本發(fā)明不限于此。首先，使用添加了含有模板核酸的試樣、前述本發(fā)明的各種引物、以及與上述靶序列雜交標的記探針的反應液，如前文所述地進行PCR。上述反應液除了上述各種引物和標記探針之外，例如還可以含有DNA聚合酶、dNTP、其它核酸擴增中可以使用的各種添加劑。上述標記探針的添加時機無特別限制，例如，擴增反應前、擴增反應中途和擴增反應后的任何時間均可，為了可以連續(xù)進行上述(a)步驟的擴增反應和上述(b)步驟，優(yōu)選在擴增反應前添加。接著，進行得到的擴增產(chǎn)物(雙鏈DNA)的解離以及由解離而得到的單鏈DNA和上述標記探針的雜交。其例如可以通過改變上述反應液的溫度而進行。上述解離步驟中的加熱溫度只要是能夠?qū)㈦p鏈的上述擴增產(chǎn)物解離為單鏈的溫度則無特別限制，例如85 95°C。加熱時間也無特別限制，通常為1秒 10分，優(yōu)選的是 1秒 5分。解離的單鏈DNA和上述標記探針的雜交例如可以在上述解離步驟之后，通過降低上述解離步驟中的加熱溫度來進行。溫度條件例如為40 50°C。上述溫度下的處理時間無特別限制，例如為1 600秒。然后，改變上述反應液的溫度，測定表示上述擴增產(chǎn)物和上述標記探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號值。具體而言，例如加熱上述反應液，即加熱上述單鏈DNA和上述標記探針的雜交體，測定伴隨溫度上升的信號值的變動。如前文所述，例如，在使用了末端的C堿基被標記的探針(鳥嘌呤淬滅探針)的情況下，在與單鏈DNA雜交的狀態(tài)熒光濺少(或者淬滅)，解離的狀態(tài)下則發(fā)出熒光。因此，例如，可以對熒光減少(或淬滅)的雜交體慢慢加熱，測定伴隨溫度上升的熒光強度的增加。此外，在使用上述標記探針的情況下，上述信號值例如可以在與上述標記探針的標記物質(zhì)相適應的條件下測定。檢測目標的靶位點為多個，使用多種探針來檢測多態(tài)性時，如前文所述，可以使用用不同的檢測條件的標記物質(zhì)標記的探針，在與各探針的標記物質(zhì)向適應的條件下，測定各個信號值。測定上述熒光強度變化時的溫度范圍無特別限制，例如起始溫度是室溫 85°C， 優(yōu)選為25 70°C，終止溫度例如是40 105°C。另外，溫度的上升速度無特別限制，例如為0. 1 20°C /秒，優(yōu)選的是0. 3 5°C /秒。接著，基于測定的信號值來分析伴隨溫度變化的信號值的變動，確定表示大的變動(峰)的Tm值。信號值的變動例如可以通過計算每單位時間(t)的信號值(F)的變化量來進行分析。在由于雜交體的熔解(單鏈化)而信號值增加的情況下，例如，可以從得到的信號值計算各溫度下每單位時間(t)的信號值(F)的增加量或者其負微分值(-dF/dt)， 將顯示最低值的溫度確定為Tm值。另外，也可以將每單位時間(t)的信號值(F)的增加量或者其微分值(dF/dt)顯示為最高值的溫度確定為Tm值。另一方面，在由于雜交體的熔解(單鏈化)而信號值減少的情況下，例如相反地，可以通過計算每單位時間(t)的信號值 (F)的減少量，來確定Tm值。此外，如前文所述，替代升高上述反應液的溫度，測定伴隨溫度升高的信號變動的方法，例如可以測定雜交體形成時的信號值，分析其變動。即，也可以在降低上述反應體系的溫度以形成雜交體時，分析伴隨上述溫度降低的信號值的變動。上述信號值的變動的分析例如可以做成描繪溫度和信號值的變動的關(guān)系的圖而進行分析，在上述分析步驟中，做成上述圖不是必須的。上述iTm值例如可以利用目前公知的MELTCALC軟件(http://www. meltcalc. com/) 等來計算出，另外也可以通過鄰接法(Nearest Neighbor Method)來確定。然后，基于這些Tm值確定靶位點的堿基的種類，即突變型或者正常型等多態(tài)性。 Tm分析中，完全互補的雜交體(完全匹配)較之一個堿基不同的雜交體(錯配)，可以得到表示解離的Tm值更高的結(jié)果。因此，預先針對上述探針，將完全互補的雜交體的Tm值和一個堿基不同的雜交體的Tm值確定為評價標準值，從而能夠確定靶位點的多態(tài)性。例如，假設(shè)靶位點為突變型，在使用與含有其突變型堿基的靶序列互補的探針的情況下，如果形成的雜交體的Tm值與完全互補的雜交體的Tm值相同，則可以判斷靶位點為突變型。另外，如果形成的雜交體的Tm值與一個堿基不同的雜交體的Tm值相同(低于完全互補的雜交體的 Tm值的值)，則可以判斷靶位點為正常型。另外，在檢測到兩者的Tm值的情況下，例如，可以決定為顯示突變型的核酸和顯示正常型的核酸共存。本發(fā)明中，如前文所述，替代升高含有上述探針的反應液的溫度(即，加熱雜交體)測定伴隨溫度上升的信號變動的方法，例如，可以進行雜交體形成時的信號變動的測定。即，可以在降低含有上述探針的反應液的溫度形成雜交體時，測定伴隨上述溫度降下的
信號變動。作為具體例，在使用單獨顯示出信號并且通過形成雜交體而不顯示信號的標記探針(例如鳥嘌呤淬滅探針)的情況下，在單鏈DNA與上述標記探針在解離的狀態(tài)下發(fā)出熒光，由于降低溫度而形成雜交體時，上述熒光減少(或淬滅)。因此，例如，可以慢慢降低上述反應體系的溫度，測定伴隨溫度降低的熒光強度減少。另一方面，使用單獨不顯示信號并且通過形成雜交體而顯示信號的標記探針的情況下，上述單鏈DNA與上述標記探針在解離狀態(tài)下不發(fā)出熒光，由于降低溫度而形成雜交體時發(fā)出熒光。因此，例如，可以慢慢降低上述反應體系的溫度，測定伴隨溫度降低的熒光強度的增加。本發(fā)明中，上述試樣中的核酸可以是單鏈也可以是雙鏈。在上述核酸為雙鏈的情況下，例如，優(yōu)選含有在在上述(b)步驟的雜交之前，加熱使上述試樣中的雙鏈核酸解離的步驟。通過將雙鏈核酸解離為單鏈核酸，在接下來的(b)步驟中，可以更高效地進行上述檢測用探針和上述靶序列的雜交?！磾U增試劑〉本發(fā)明的擴增試劑是本發(fā)明的靶序列的擴增方法中使用的擴增試劑。本發(fā)明的擴增試劑的特征在于，上述靶序列為含有顯示多態(tài)性的靶位點的序列，上述靶位點的堿基(X) 為第1堿基(xl)或第2堿基(x2)，含有上述引物(Xl)和引物(X2)0另外，本發(fā)明的擴增試劑優(yōu)選還含有引物(Yl)。本發(fā)明的擴增試劑中，上述各引物與前述相同。本發(fā)明的擴增試劑例如可以含有本發(fā)明的靶序列的擴增方法中記載的、擴增反應中使用的各種成分。本發(fā)明的擴增試劑優(yōu)選在一個反應體系內(nèi)使用。另外，本發(fā)明的擴增試劑可以是本發(fā)明的靶序列的擴增方法中使用的擴增試劑盒，各成分可以分別包含在單獨的容器中，也可以適當組合包含在同一容器中。上述擴增試劑盒例如優(yōu)選含有使用說明書?！炊鄳B(tài)性檢測試劑〉本發(fā)明的多態(tài)性檢測試劑是本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法中使用的檢測試劑，其特征在于，含有本發(fā)明的擴增試劑以及能夠與含有上述模板核酸的上述靶位點的序列雜交的探針。本發(fā)明的多態(tài)性檢測試劑優(yōu)選在一個反應體系內(nèi)使用。另外，本發(fā)明的多態(tài)性檢測試劑，例如，還可以含有本發(fā)明的多態(tài)性檢測方法中記載的、擴增反應中使用的各種成分。另外，本發(fā)明多態(tài)性檢測試劑例如可以是本發(fā)明的多態(tài)性檢測試劑盒，例如優(yōu)選含有使用說明書。接著說明本發(fā)明的實施例。但是，本發(fā)明不限于下述實施例。 實施例[實施例1]本例中對bcr-abl基因進行Tm分析。(實施例1-1)本例中，使用具有附加序列(El)的正常型引物，對含有正常型bcr-abl基因的未精制的血液試樣進行Tm分析，確認了有無假陽性。本實施例中，序列編號1所示的bcr-abl基因的部分序列中，將堿基編號270的堿基(y)作為檢測位點。上述y為胞嘧啶(c)或者胸腺嘧啶(t)，如果是胞嘧啶則為判斷為正常型多態(tài)性(T315)，如果為胸腺嘧啶，則判斷為突變型多態(tài)性(T315I)。使用全自動SNPs檢查裝置(商品名i-densy (注冊商標)、ARKRAY公式制造)進行PCR和Tm分析。首先，混合使用EDTA采血管采集的全血10 μ L和下述稀釋液1 70 μ L， 制備稀釋血液1，然后，混合上述稀釋血液1 10 μ L和下述稀釋液2 70 μ L，制備稀釋血液2。 向上述檢查裝置用的反應池中添加上述稀釋血液2 17 μ L，將其設(shè)置在上述檢查裝置中，于 95°C加熱10分鐘。加熱后，向上述反應池中添加下述第1試劑23 μ L、下述第2試劑13 μ L 和下述第3試劑10 μ L，與加熱處理后的上述稀釋血液2混合，對該混合液進行PCR和Tm 分析。上述PCR在95°C處理60秒之后，以95°C 1秒和64°C 15秒為一個循環(huán)反復進行50 個循環(huán)。然后，上述Tm分析在95°C下1秒、40°C下60秒處理之后，以升溫速度1°C /3秒從 40°C加熱到70°C，升溫期間，測定熒光強度隨時間的變化。檢測波長為520 555nm。[表1]
權(quán)利要求
1.靶序列的擴增方法，其特征在于，包括在含有下述引物(Xi)和下述引物(X》的反應體系中，擴增模板核酸中的靶序列的擴增步驟，上述靶序列為含有顯示多態(tài)性的靶位點的序列， 上述靶位點的堿基(X)為第1堿基(Xl)或第2堿基(X2)， 引物(Xl)為如下引物 具有序列(Al，)和序列(El)，上述序列(Al’ )為與上述模板核酸中的部分序列(Al)互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(Al)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第1堿基(xl)互補的堿基(χΓ )，上述序列(El)為與和上述模板核酸中的上述部分序列(Al)的3’末端鄰接的部分序列(Bi)非互補的序列，結(jié)合在上述序列(Al，)的5，末端， 引物(Χ2)為如下引物 具有序列(Α2，)，上述序列(Α2’ )為與上述模板核酸中的部分序列(Α2)互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(Α2)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第2堿基(χ2)互補的堿基(x2’ )。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴增方法，上述引物(Xl)的上述序列(Al’)中、3’末端的堿基或者從3’末端起第2位的堿基為與上述第1堿基(xl)互補的堿基(xl’)，在上述引物擬、的上述序列(A2’)中，3’末端的堿基或者從3’末端起第2位的堿基為與上述第2堿基(x2)互補的堿基(x2’ )。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴增方法，上述引物(X2)中的上述序列(A2’)的Tm值為高于上述引物(Xl)中的上述序列(Al’ )的Tm值的值。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴增方法，上述第1堿基(xl)和上述第2堿基(U)中，一者為上述靶位點中的突變型堿基Umt)，另一者為上述靶位點中的正常型堿基(Xwt)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的擴增方法，上述引物、\1、還具有序列(E2)，上述序列(ε》為與和上述模板核酸中的上述部分序列m的3’末端鄰接的部分序列(B2)非互補的序列，結(jié)合在上述序列(A2’ )的5’末端，且是與上述引物(Xl)中的上述附加序列(El)不同的序列。
6.多態(tài)性檢測方法，其特征在于，包括利用權(quán)利要求1所述的擴增方法，擴增含有模板核酸中的靶位點的靶序列的步驟，以及利用能夠與上述靶序列雜交的探針，檢測上述靶序列中的上述靶位點的多態(tài)性的步馬聚ο
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多態(tài)性檢測方法，包括下述(a) (c)步驟，(a)利用權(quán)利要求1所述的擴增方法，來擴增上述靶序列的擴增步驟，(b)在上述探針的存在下，改變含有上述(a)步驟中得到的擴增產(chǎn)物的反應體系的溫度，測定表示上述擴增產(chǎn)物和上述探針的雜交體的熔解狀態(tài)的信號值的測定步驟，(c)基于伴隨上述溫度變化的上述信號值的變動，檢測上述模板核酸中的上述靶位點的多態(tài)性的步驟。
8.擴增試劑，其用于在權(quán)利要求1所述的擴增方法中使用，其特征在于， 模板核酸中的靶序列為含有顯示多態(tài)性的靶位點的序列，上述靶位點的堿基(χ)為第1堿基(xl)或第2堿基(x2)，含有下述引物(Xl)和下述引物(X2)，引物(Xl)為如下引物具有序列(Al，)和序列(El)，上述序列(Al’ )為與上述模板核酸中的部分序列(Al)互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(Al)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第1堿基(xl)互補的堿基(xl’)，上述序列(El)為與和上述模板核酸中的上述部分序列(Al)的3’末端鄰接的部分序列(Bi)非互補的序列，結(jié)合在上述序列(Al，)的5，末端；引物(Χ2)為如下引物具有序列(Α2，)，上述序列(Α2’ )為與上述模板核酸中的部分序列(Α2)互補的序列，其3’區(qū)域具有與上述部分序列(Α2)的5’區(qū)域中的上述靶位點的第2堿基(χ2)互補的堿基(x2’ )。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的擴增試劑，上述引物(Xl)的上述序列(Al’)中，3’末端的堿基或從3’末端起第2位的堿基為與上述第1堿基(xl)互補的堿基(xl’)，上述引物(Χ2)的上述序列(Α2’)中，3’末端的堿基或從3’末端起第2位的堿基為與上述第2堿基(χ2)互補的堿基(x2’)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的擴增試劑，上述引物(Χ2)中的上述序列(Α2’)的Tm值為高于上述引物(Xl)中的上述序列(Al’ )的Tm值的值。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的擴增試劑，上述第1堿基(xl)和上述第2堿基(U)中的一者為上述靶位點中的突變型堿基(Xmt)，另一者為上述靶位點中的正常型堿基(Xwt)。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的擴增試劑，上述引物、\1、還具有序列(Ε2)，上述序列(Ε》為與和上述模板核酸中的上述部分序列m的3’末端鄰接的部分序列(B2)非互補的序列，結(jié)合在上述序列(A2’ )的5’末端，且為與上述引物(Xl)中的上述附加序列(El)不同的序列。
13.檢測試劑，其在權(quán)利要求6所述的多態(tài)性檢測方法中使用，其特征在于，含有權(quán)利要求8所述的擴增試劑、以及能夠與含有模板核酸中的靶位點的靶序列雜交的探針。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供抑制由于引物的錯誤退火而造成的擴增的擴增方法。在含有顯示多態(tài)性的靶位點的靶序列的擴增中，使用引物X1和X2。X1為如下引物具有序列A1’和序列E1，A1’為與上述模板核酸中的部分序列A1互補的序列，其3’區(qū)域具有與A1的5’區(qū)域中的上述靶位點的第1堿基x1互補的堿基x1’，E1為與和上述模板核酸中A1的3’末端鄰接的部分序列B1非互補的序列、結(jié)合在A1’的5’末端。X2為如下引物具有序列A2’，A2’為與上述模板核酸中的部分序列A2互補的序列，其3’區(qū)域具有與A2的5’區(qū)域的上述靶位點的第2堿基x2互補的堿基x2’。X1和X2均在3’區(qū)域具有與靶位點互補的堿基。利用這樣的引物，在僅靶位點為第1堿基x1的模板的情況下，能夠防止具有第2堿基x2的靶序列的誤擴增。由此，能夠抑制第2堿基x2的多態(tài)性的假陽性。
文檔編號C12N15/09GK102471771SQ201180003098
公開日2012年5月23日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日
發(fā)明者細見敏也 申請人:愛科來株式會社