專利名稱：確定dna中長(zhǎng)度多態(tài)性的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的方法和裝置涉及用于鑒定病狀的遺傳鑒定系統(tǒng)。更具體地說(shuō)，所述方法和裝置涉及檢測(cè)重復(fù)單元狀況的系統(tǒng)，例如短串聯(lián)重復(fù)單元的數(shù)目，用于，例如在法醫(yī)或親子鑒定方面鑒定個(gè)體，或用于確定病狀，例如用于檢測(cè)克隆腫瘤。
相關(guān)申請(qǐng)信息本申請(qǐng)涉及1997年12月5日申請(qǐng)的，題目為“電子生物學(xué)裝置的方法和設(shè)備”，序列號(hào)為No.08/986065的申請(qǐng)，它是1995年9月27日申請(qǐng)的，題目為“主動(dòng)程序化矩陣設(shè)備的裝置和方法”，序列號(hào)為No.08/534454的部分連續(xù)申請(qǐng)，它又是1994年9月9日申請(qǐng)的，題目為“自動(dòng)分子生物學(xué)診斷系統(tǒng)”，序列號(hào)為No.08/304657的部分連續(xù)申請(qǐng)，該申請(qǐng)目前已被授權(quán)為美國(guó)專利，專利號(hào)為5632957(該申請(qǐng)隨后轉(zhuǎn)入1997年5月20日申請(qǐng)的，題目為“主動(dòng)、程序化電子微生物學(xué)系統(tǒng)的控制系統(tǒng)”，序列號(hào)為No.08/859644的申請(qǐng))，專利號(hào)為5632957的申請(qǐng)是1994年7月7日申請(qǐng)的，題目為“用于分子生物學(xué)分析和診斷的電子嚴(yán)緊控制方法”，序列號(hào)為No.08/271882的部分連續(xù)申請(qǐng)，目前已被接受，其又是1993年11月1日申請(qǐng)的，題目為“分子生物學(xué)分析和診斷用主動(dòng)程序化電子設(shè)備”，序列號(hào)為No.08/146504的部分連續(xù)申請(qǐng)，該申請(qǐng)目前已被授權(quán)為美國(guó)專利，專利號(hào)為5605662(該申請(qǐng)已經(jīng)連續(xù)地轉(zhuǎn)入1996年10月4日申請(qǐng)的，題目為“聚合物的電子合成方法”，序列號(hào)為No.08/725976的申請(qǐng))，序列號(hào)為No.08/986065的申請(qǐng)還是1996年9月6日申請(qǐng)的，題目為“電子雜交反應(yīng)的優(yōu)化方法和材料”，序列號(hào)為No.08/708262的部分連續(xù)申請(qǐng)，它們的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
背景技術(shù)：
分子生物學(xué)包括多種多樣的分析核酸和蛋白質(zhì)的技術(shù)。這些技術(shù)和方法中的一部分構(gòu)成了臨床診斷分析和試驗(yàn)的基礎(chǔ)。這些技術(shù)包括核酸雜交分析、限制性酶分析、遺傳序列分析、以及核酸和蛋白質(zhì)的分離和純化(參見(jiàn)，例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，分子克隆試驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989)。
這些技術(shù)中的大多數(shù)涉及對(duì)大量樣品進(jìn)行為數(shù)眾多的操作(例如，移液、離心、電泳)。它們通常復(fù)雜且耗時(shí)，一般需要高度精確。許多技術(shù)由于缺乏靈敏度、特異性、或重現(xiàn)性而限制了其應(yīng)用。例如，這些問(wèn)題已經(jīng)限制了核酸雜交分析的一些診斷應(yīng)用。
很多涉及為遺傳性或感染性疾病而進(jìn)行的DNA雜交分析的完全程序。大體上說(shuō)，完全程序可以被分成很多步驟和亞步驟。在診斷遺傳性疾病的情況下，第一步涉及獲得樣品(血液或組織)。根據(jù)樣品的類型，可以進(jìn)行各種預(yù)處理。第二步涉及打碎或溶解細(xì)胞，其隨后釋放粗DNA材料以及其它細(xì)胞成分。通常，需要進(jìn)行幾個(gè)亞步驟以便除去細(xì)胞碎片以及進(jìn)一步純化粗DNA。此時(shí)對(duì)于進(jìn)一步的加工和分析存在幾種任選步驟。一種任選步驟涉及使純化的樣品DNA變性，然后用多種模式(斑點(diǎn)印跡、微珠、微平板等)中的一種直接進(jìn)行雜交分析。第二種任選步驟，被稱為Southern印跡雜交，涉及用限制性酶切DNA，在電泳凝膠上分離DNA片段，印到薄膜濾膜上，然后用特異性DNA探針序列與該印跡雜交。該程序有效地降低了基因組DNA樣品的復(fù)雜性，因此有助于提高雜交特異性和靈敏度。遺憾的是，該程序費(fèi)時(shí)費(fèi)力。第三種任選步驟是進(jìn)行擴(kuò)增程序，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、鏈置換擴(kuò)增或其它方法。這些程序相對(duì)于非-目標(biāo)序列擴(kuò)增(增加)了目標(biāo)DNA序列的數(shù)目。目標(biāo)DNA的擴(kuò)增有助于克服基因組DNA分析中有關(guān)的復(fù)雜性和靈敏度的問(wèn)題。在這些樣品制備和DNA加工步驟之后，進(jìn)行真正的雜交反應(yīng)。最后，將雜交反應(yīng)轉(zhuǎn)化成分析結(jié)果，進(jìn)行檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。
核酸的雜交分析通常涉及用過(guò)量探針DNA，在相對(duì)大量的復(fù)雜非目標(biāo)核酸中檢測(cè)非常少量的特異性目標(biāo)核酸(DNA或RNA)。在樣品制備中降低DNA復(fù)雜性的亞步驟已經(jīng)用于幫助檢測(cè)低拷貝數(shù)(即10000-100000)的核酸目標(biāo)物。通過(guò)應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和其它方法擴(kuò)增目標(biāo)核酸序列，一定程度上克服了DNA復(fù)雜性。(參見(jiàn)，M.A.Innis等，PCR方案方法和應(yīng)用指南，Academic Press，1990，Spargo等，1996，分子和細(xì)胞探針，關(guān)于SDA擴(kuò)增)。擴(kuò)增產(chǎn)生巨大數(shù)目的目標(biāo)核酸序列，其改進(jìn)了隨后的直接探針雜交步驟。
真正的雜交反應(yīng)代表全過(guò)程中最重要和最核心的步驟之一。雜交步驟涉及在目標(biāo)DNA序列發(fā)生雜交的一系列優(yōu)選條件下，將制備的DNA樣品與特異性報(bào)告探針接觸?？梢园凑沾罅磕Ｊ街械娜魏我环N進(jìn)行雜交。例如，已經(jīng)在多種濾膜和固體支持物模式上進(jìn)行了多樣品核酸雜交分析(參見(jiàn)G.A.Beltz等，酶學(xué)方法，第100卷，B部分，B.R.Wu，L.Grossman，K.Moldave，編，Academic Press，New York，第19章，266-308頁(yè)，1985)。一種模式，即所謂的“斑點(diǎn)印跡”雜交，涉及目標(biāo)DNA非共價(jià)貼附于濾膜，之后與放射性同位素標(biāo)記的探針雜交?！鞍唿c(diǎn)印跡”雜交具有廣泛的應(yīng)用，已經(jīng)形成多種模式(參見(jiàn)M.L.M.Anderson和B.D.Young，核酸雜交——試驗(yàn)研究，B.D.Hames和S.J.Higgins，編，IRL Press，Washington，D.C.，第4章，73-111頁(yè)，1985)。已經(jīng)形成基因組突變的多重分析(D.Nanibhushan和D.Rabin，EPA 0228075，1987年7月8日)以及重疊克隆的檢測(cè)和基因組圖譜的構(gòu)建(G.A.Evans，US專利號(hào)5219726，1993年6月15日)。
已經(jīng)形成新技術(shù)，用于在微-格式化的多重設(shè)備或矩陣設(shè)備(例如，DNA芯片)上進(jìn)行多樣品核酸雜交分析(參見(jiàn)，M.Barinaga，253，科學(xué)，1489頁(yè)，1991；W.Bains，10，生物/技術(shù)，757-758頁(yè)，1992)。這些方法通常將特定DNA序列附著于固體支持物的非常小的特定區(qū)域，例如DNA芯片的微孔。這些雜交模式屬于常規(guī)“斑點(diǎn)印跡”和“夾層”雜交系統(tǒng)的微規(guī)模形式。
微模式雜交可以用于進(jìn)行“雜交測(cè)序”(SBH)(參見(jiàn)M.Barinaga，253，科學(xué)，1489頁(yè)，1991；W.Bains，10，生物/技術(shù)，757-758頁(yè)，1992)。SBH利用所有可能的n-核苷酸低聚物(n-mer)鑒定未知DNA樣品中的n-mer，其隨后通過(guò)算法分析排列，以制備DNA序列(R.Drmanac和R.Crkvenjakov，Yogoslav專利申請(qǐng)#570/87，1987；R.Drmanac等，4，基因組，114，1989；Strezoska等，88，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展，10089，1992；和R.Drmanae和R.B.Crkvenjakov，美國(guó)專利5202231，1993年4月13日)。
進(jìn)行SBH存在兩種模式。第一種模式涉及在支持物上形成一種所有可能的n-mer的排列，然后使其與目標(biāo)序列雜交。第二種模式涉及將目標(biāo)序列附著于支持物，隨后用所有可能的n-mer與其雜交。這兩種模式均存在直接探針雜交的基本問(wèn)題，其它困難涉及多重雜交。
Southern，英聯(lián)邦專利申請(qǐng)GB8810400，1988；E.M.Southern等，13，基因組1008，1992，建議用第一種模式分析DNA或?qū)ζ錅y(cè)序。Southern用PCR擴(kuò)增的基因組DNA鑒定了一種已知的單點(diǎn)突變。Southern還描述了用于SBH的在固體支持物上合成一種低聚核苷酸排列的方法。然而，Southern沒(méi)有陳述如何實(shí)現(xiàn)一種排列上每種低聚核苷酸的優(yōu)化嚴(yán)緊條件。
同時(shí)，Drmanac等，260，科學(xué)1649-1652，1993，用第二種模式對(duì)幾種短(116bp)DNA序列進(jìn)行測(cè)序。目標(biāo)DNA被附著于薄膜支持物(“斑點(diǎn)印跡”模式)。隨后將各濾膜與272標(biāo)記的10-mer和11-mer低聚核苷酸雜交。使用較寬范圍的嚴(yán)緊條件，以便實(shí)現(xiàn)各n-mer的特異性雜交；清洗時(shí)間從5分鐘到整夜不等，溫度從0℃-16℃不等。大多數(shù)探針需要在16℃下清洗3小時(shí)。濾膜必須暴露2-18小時(shí)以便探測(cè)雜交信號(hào)。無(wú)論何種樣品目標(biāo)序列，無(wú)論減少低聚探針的組數(shù)，應(yīng)用提供的最嚴(yán)緊的條件，總假陽(yáng)性雜交率均為5％。
有很多檢測(cè)和分析雜交反應(yīng)的方法。根據(jù)用于標(biāo)記DNA探針的不同報(bào)告基團(tuán)(熒光團(tuán)、酶、放射性同位素等)，用熒光法、比色法、或通過(guò)射線自顯影法進(jìn)行檢測(cè)和分析。通過(guò)觀察和測(cè)量發(fā)散的射線，例如熒光射線或粒子輻射，可以得到關(guān)于雜交反應(yīng)的信息。甚至當(dāng)檢測(cè)方法具有非常高的內(nèi)在靈敏度時(shí)，由于非特異性結(jié)合材料存在的背景也難于檢測(cè)雜交反應(yīng)。很多其它因素也降低DNA雜交分析的靈敏度和選擇性。
基因分析的一種形式是確定基因序列中相對(duì)較短的重復(fù)序列的性質(zhì)。短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)已經(jīng)被確定為法醫(yī)領(lǐng)域和其它領(lǐng)域(親子試驗(yàn)、腫瘤檢測(cè)、D.Sidransky、遺傳病、動(dòng)物育種)中的有用工具。事實(shí)上，美國(guó)聯(lián)邦調(diào)查局已經(jīng)宣稱正在考慮將短串聯(lián)重復(fù)序列用于法醫(yī)目的。(Bruce Budowle博士，DNA法醫(yī)學(xué)，科學(xué)、證據(jù)和未來(lái)展望(DNA Forensics，Science，Evidence and Future Prospects)，McLean，VA.1997年11月)。
對(duì)于鑒定、擴(kuò)增、檢測(cè)和應(yīng)用多態(tài)性重復(fù)序列曾提出各種建議。例如，Tautz PCT WO90/04040-PCT/EP98/01203，在一篇題目為“DNA區(qū)中長(zhǎng)度多態(tài)性的分析方法”(翻譯自德語(yǔ))的申請(qǐng)中，公開(kāi)了在簡(jiǎn)單或隱性簡(jiǎn)單DNA序列區(qū)域中長(zhǎng)度多態(tài)性的分析方法。Tautz公開(kāi)了一種方法，其包括如下步驟將至少一對(duì)引物對(duì)加到待分析的DNA上，其中引物對(duì)分子之一基本上互補(bǔ)于簡(jiǎn)單或隱性簡(jiǎn)單DNA序列的5′至3′旁側(cè)的互補(bǔ)鏈，并且其中引物對(duì)加到復(fù)制起點(diǎn)之間，以至于用兩種引物之一進(jìn)行的引物控制的聚合反應(yīng)中得到的合成產(chǎn)物可以被利用，變性后，象加入其它引物的矩陣一樣，進(jìn)行引物-控制的聚合反應(yīng)，然后分離，例如通過(guò)通常的凝膠電泳分離產(chǎn)物，然后分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物。
Baylor醫(yī)學(xué)院的Caskey等也應(yīng)用DNA成像分析在短串聯(lián)重復(fù)序列中檢測(cè)多態(tài)現(xiàn)象。在Caskey等的美國(guó)專利US5364759中，1994年11月15日公開(kāi)，題目為“用短串聯(lián)重復(fù)序列的多態(tài)性對(duì)DNA分類以及多態(tài)性短串聯(lián)重復(fù)序列的鑒定”，公開(kāi)了一種方法，包括下述步驟從待測(cè)樣品中提取DNA，擴(kuò)增提取到的DNA，鑒定各種不同序列的擴(kuò)增延伸產(chǎn)物。Caskey需要將各不同序列區(qū)別標(biāo)記。應(yīng)用電泳進(jìn)行物理分離。
C.R.Cantor等人最近公開(kāi)了一種記錄短串聯(lián)DNA重復(fù)序列的技術(shù)。Yarr，R.等公開(kāi)了一種方法“短DNA重復(fù)長(zhǎng)度的原位檢測(cè)”，基因分析生物分子工程(Genetic AnalysisBiomolecular Engineering)13(1996)113-118，和PCT申請(qǐng)WO96/36731，PCT/US96/06527題目為“核酸的檢測(cè)方法”。它們公開(kāi)了含有嵌入單一序列中的串聯(lián)重復(fù)序列的寡核苷酸目標(biāo)物與一系列含有已知長(zhǎng)度串聯(lián)重復(fù)序列的互補(bǔ)探針雜交。單鏈環(huán)結(jié)構(gòu)形成含有錯(cuò)配(該處定義為不同)數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列的加倍體。當(dāng)串聯(lián)重復(fù)序列的錯(cuò)配(該處定義為相同)數(shù)目存在于雙倍體上，則不形成環(huán)結(jié)構(gòu)。用單鏈核酸酶消化環(huán)結(jié)構(gòu)。差別波長(zhǎng)，例如通過(guò)各種長(zhǎng)度探針的差別比色熒光儀(fluoriflor)鑒定哪里存在錯(cuò)配位點(diǎn)。按照該方法沒(méi)有表示需要使用電泳分離。
盡管知道重復(fù)單元存在多肽現(xiàn)象到目前已經(jīng)約15年，并且已經(jīng)知道它們?cè)诜ㄡt(yī)學(xué)和遺傳測(cè)試中應(yīng)用的希求，然而還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)商業(yè)可接受的實(shí)施。
發(fā)明概述提供了分析和確定遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法和設(shè)備。在本發(fā)明的一個(gè)方法中，遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元的性質(zhì)通過(guò)以下步驟確定對(duì)排列的多個(gè)試驗(yàn)位點(diǎn)進(jìn)行多個(gè)雜交復(fù)合分析，其中雜交復(fù)合分析包括至少一種含有單一重復(fù)性DNA序列的核酸目標(biāo)物，一種具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列的捕獲探針和互補(bǔ)于目標(biāo)序列的n個(gè)重復(fù)單元，其中n=0，1，2…，以及含有互補(bǔ)于同樣目標(biāo)序列鏈的選擇序列的報(bào)告探針，報(bào)告探針的選擇序列包括第二獨(dú)特旁側(cè)序列和m個(gè)重復(fù)單元，其中m=0，1，2…，但捕獲探針加報(bào)告探針中重復(fù)單元的總數(shù)大于0(n+m＞0)。按照該方法，捕獲探針的序列在至少兩個(gè)試驗(yàn)位點(diǎn)上不同。然后監(jiān)測(cè)雜交復(fù)合分析，至少部分通過(guò)確定雜交穩(wěn)定性來(lái)確定試驗(yàn)位點(diǎn)上雜交復(fù)合分析中的一致和不一致。最后，可以基于一致/不一致鑒定，結(jié)合定位在該位點(diǎn)的雜交復(fù)合物中的探針的知識(shí)確定目標(biāo)序列中重復(fù)單元的性質(zhì)。
作為實(shí)施該方法的例子，假定目標(biāo)物含有六個(gè)重復(fù)單元。在一個(gè)僅為了方便說(shuō)明而簡(jiǎn)化的系統(tǒng)中，多重雜交復(fù)合分析可能是排列在APEX型生物電子系統(tǒng)上的三個(gè)分析，其中第一個(gè)分析包括具有四個(gè)重復(fù)單元(n=4)的捕獲探針，第二個(gè)分析包括具有五個(gè)重復(fù)單元(n=5)的捕獲探針，第三個(gè)檢測(cè)包括具有六個(gè)重復(fù)單元(n=6)的捕獲探針。如果選擇具有一個(gè)重復(fù)單元(m=1)的報(bào)告探針，第一個(gè)分析處重復(fù)單元的總數(shù)將為五(n+m=4+1=5)，第二個(gè)分析處，重復(fù)單元的總數(shù)將等于6(n+m=5+1=6)，第三個(gè)分析處重復(fù)單元的總數(shù)將等于7(n+m=6+1=7)。第二個(gè)試驗(yàn)位點(diǎn)將是一致(協(xié)調(diào))試驗(yàn)位點(diǎn)，因?yàn)樵谶@種情況下，目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目等于捕獲探針加報(bào)告探針中重復(fù)單元的數(shù)目，那就是說(shuō)，它就是在目標(biāo)物中和在捕獲探針和報(bào)告探針的組合中均具有六個(gè)重復(fù)單元的試驗(yàn)位點(diǎn)。應(yīng)用有關(guān)探針定位的知識(shí)，知道第二試驗(yàn)位點(diǎn)包括具有5個(gè)重復(fù)單元(n=5)的捕獲探針，并且當(dāng)結(jié)合包括一個(gè)重復(fù)單元的報(bào)告探針的知識(shí)時(shí)，就可確定目標(biāo)物中存在總共六個(gè)重復(fù)單元。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，在所述方法中應(yīng)用電子輔助雜交或一致和不一致確定，或者二者都使用。一方面，當(dāng)核酸目標(biāo)物與捕獲探針和/或報(bào)告探針雜交時(shí)，可能使用電子嚴(yán)緊條件，優(yōu)選與其他影響嚴(yán)緊度的條件一起使用，以輔助雜交。該技術(shù)尤其有利于減少或消除重復(fù)單元中的滑動(dòng)雜交，并促進(jìn)更有效地雜交。另一方面，在雜交復(fù)合穩(wěn)定性確定過(guò)程中可能改變電子嚴(yán)緊條件，以便更準(zhǔn)確或快捷地確定一致或不一致的狀況。
本發(fā)明的另一方面，提供了一種確定遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法，通過(guò)提供一種生物電子設(shè)備，它包括陣列在一系列試驗(yàn)位點(diǎn)上的一系列探針，探針具有第一獨(dú)特(單一)旁側(cè)序列，第二獨(dú)特旁側(cè)序列，和具有可變重復(fù)單元數(shù)目的插入重復(fù)單元系列。目標(biāo)物與一系列試驗(yàn)位點(diǎn)上的一系列探針在電子嚴(yán)緊雜交條件下雜交，然后確定試驗(yàn)位點(diǎn)的一致/不一致。在優(yōu)選實(shí)施方式中，通過(guò)電子雜交穩(wěn)定性確定的應(yīng)用，至少部分確定一致/不一致。一致的試驗(yàn)位點(diǎn)表明該探針含有與目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目相等的重復(fù)單元數(shù)目。在一個(gè)該實(shí)施方式的變化中，僅在一致/不一致確定過(guò)程中使用電子嚴(yán)緊控制。
本發(fā)明的再一方面，提供了確定在樣品中大小改變的目標(biāo)等位基因的方法和設(shè)備。提供了鑒定目標(biāo)等位基因的平臺(tái)，其包括選自以下組的探針(ⅰ)具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列的探針、插入重復(fù)區(qū)和第二獨(dú)特旁側(cè)序列，和(ⅱ)一種夾層分析法，包括具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列和0，1，2…重復(fù)單元的捕獲探針，和具有0，1，2…重復(fù)單元和連接其后的第二獨(dú)特旁側(cè)序列的報(bào)告探針。之后，目標(biāo)物與探針雜交，優(yōu)選在電子嚴(yán)緊條件下，以便以適當(dāng)?shù)臉?biāo)引輔助，或者換一種方式，在后續(xù)步驟中應(yīng)用電子嚴(yán)緊條件或在雜交過(guò)程中和在后續(xù)步驟中都應(yīng)用電子嚴(yán)緊條件，然后至少部分通過(guò)確定雜交穩(wěn)定性，來(lái)確定試驗(yàn)位點(diǎn)上的一致和不一致。
在本發(fā)明的一個(gè)方面上，一致性試驗(yàn)位點(diǎn)的位置代表目標(biāo)序列重復(fù)單元的性質(zhì)(目標(biāo)物中存在的重復(fù)單元的數(shù)目)，它本身基于定位在該試驗(yàn)位點(diǎn)的探針的知識(shí)得出。即，根據(jù)與特定物理試驗(yàn)位點(diǎn)典型相關(guān)的特定探針的序列將了解它們，尤其包括重復(fù)單元的數(shù)目，這些試驗(yàn)位點(diǎn)的物理位置形成有關(guān)目標(biāo)物性質(zhì)的一致性位點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，尤其是重復(fù)單元的數(shù)目。通常，在一致的試驗(yàn)位點(diǎn)上，目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目等于捕獲探針中重復(fù)單元的數(shù)目和報(bào)告探針中重復(fù)單元數(shù)目的總和。
本發(fā)明的一個(gè)有利方面是所述方法和設(shè)備能夠有效地確定目標(biāo)序列中微小變異體的存在。該微小變異體可以包括一種或多種缺失、插入、轉(zhuǎn)換和/或顛換。它們可能是單一堿基或者是一個(gè)以上的堿基。重復(fù)單元中的缺失或插入可以通過(guò)高度控制條件的凝膠分離方法檢測(cè)到。這需要分辨單一堿基，并且靠近大多數(shù)凝膠分離技術(shù)的檢測(cè)極限。對(duì)于轉(zhuǎn)換或顛換突變，等位基因的大小不會(huì)改變，甚至當(dāng)序列被改變時(shí)。常規(guī)凝膠篩分法非常難于檢測(cè)這類突變，最近其他研究者(Sean Walsh，Dennis Roeder，DNA法醫(yī)學(xué)科學(xué)、證據(jù)和未來(lái)展望，McLean，VA.Nov.1997)的結(jié)果表明轉(zhuǎn)換和顛換突變會(huì)導(dǎo)致微細(xì)差別，從而給凝膠分析帶來(lái)困難，有時(shí)造成STR分析混亂。我們的方法是一種雜交方法，它十分擅長(zhǎng)可靠地檢測(cè)上述單核苷酸多態(tài)性。因此，通過(guò)設(shè)計(jì)具體的捕獲和報(bào)告寡核苷酸，可以在用于通過(guò)重復(fù)單元數(shù)目分辨STR等位基因性質(zhì)的同一平臺(tái)上進(jìn)行這些分析。設(shè)計(jì)用于微小變異體分析的捕獲寡核苷酸的一般策略與用于完整重復(fù)單元的一樣，然而，報(bào)告寡核苷酸可能與此不同，它們可能含有也可能不含獨(dú)特旁側(cè)序列。保留通過(guò)最大化雜交復(fù)合穩(wěn)定性有效地確定一致的條件，因?yàn)槿匀皇褂卯a(chǎn)生堿基堆積(如上述)的寡核苷酸設(shè)計(jì)參數(shù)。
本發(fā)明的另一方面，可以應(yīng)用各種附加步驟，以促進(jìn)分辨一致和不一致的試驗(yàn)位點(diǎn)。一致的一種方式可以是這樣的，在夾層分析模式中，在包括捕獲、報(bào)告和目標(biāo)序列的雜交復(fù)合中存在堿基的互補(bǔ)配對(duì)。在另一種非常有利的排列中，可以應(yīng)用報(bào)告序列和捕獲序列的并列末端核苷酸，其中它們的臨近性質(zhì)允許相互作用，例如堿基堆積。有利的是，可以選擇并列末端核苷酸的身份，這是存在的重復(fù)單元或相關(guān)序列帶來(lái)的，以便增加一致和不一致之間的能量差異。曾報(bào)道不同堿基之間的堿基堆積的穩(wěn)定性在約4倍的范圍內(nèi)變化(Sanenger，核酸結(jié)構(gòu)原理，1984，Springer-Verlag，New York，NY)。試驗(yàn)結(jié)果表明，在我們的系統(tǒng)中分析時(shí)，5’G-A3’對(duì)5’T-A3’的配對(duì)分辯率提高至少10倍，更多時(shí)候至少超過(guò)20倍。該結(jié)果通常與公開(kāi)的結(jié)果，即5’G-A3’堿基堆積比5’T-A3’堿基對(duì)存在更高的穩(wěn)定性，一致，用我們的分析法看到的穩(wěn)定性差異的增加超過(guò)了報(bào)道值。本發(fā)明利用這種天然條件，提供了一種優(yōu)越的分析便利，這是十分有利的。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以修飾末端核苷酸，以增加堿基堆積作用，例如添加丙炔基，甲基或膽固醇基。在另一個(gè)相關(guān)方面，可以應(yīng)用連接技術(shù)，例如酶聯(lián)或化學(xué)連接，以便增加一致位點(diǎn)和不一致位點(diǎn)之間的能量差異。
可以以多種方式證明不一致，例如存在缺口或重疊的夾層分析模式，或者存在環(huán)出序列的的環(huán)出法。另外，不一致可以存在于有堿基變異，例如缺失、插入、轉(zhuǎn)換和/或顛換的重復(fù)區(qū)。
在區(qū)別一致和不一致試驗(yàn)位點(diǎn)中，優(yōu)選部分基于雜交穩(wěn)定性得出差別。雜交穩(wěn)定性可以被多種因素影響，包括熱調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、以及電子嚴(yán)緊度調(diào)節(jié)，它們單獨(dú)地或與其它列出的因素組合作用。通過(guò)應(yīng)用電子嚴(yán)緊條件，在目標(biāo)物雜交步驟和/或報(bào)告寡核苷酸嚴(yán)緊步驟中，可以實(shí)現(xiàn)該過(guò)程的迅速完成。目標(biāo)物的電子嚴(yán)緊雜交是該方法的一個(gè)獨(dú)特方面，因?yàn)樗鼘儆陔p鏈DNA，且導(dǎo)致目標(biāo)物對(duì)捕獲序列的快速準(zhǔn)確的雜交。期望實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的適當(dāng)?shù)闹笜?biāo)化雜交，以便在具有準(zhǔn)確雜交復(fù)合的試驗(yàn)位點(diǎn)上獲得最大數(shù)目的分子。舉例說(shuō)明，應(yīng)用電子嚴(yán)緊條件，可以在十分鐘或更少時(shí)間，更優(yōu)選五分鐘或更少時(shí)間，最優(yōu)選一分鐘或更少時(shí)間內(nèi)完成最初的雜交步驟?？傊?，分析過(guò)程可以在半個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。
至于檢測(cè)雜交復(fù)合物，優(yōu)選該復(fù)合物是被標(biāo)記的。通常，在確定一致和不一致步驟中，需要檢測(cè)試驗(yàn)位點(diǎn)或其部分上標(biāo)記雜交復(fù)合物的數(shù)量。任何與本發(fā)明的目的和功能一致的檢測(cè)方式或形式都可以應(yīng)用，例如光學(xué)成像，電子成像，電荷偶聯(lián)裝置的應(yīng)用或其它定量方法?？梢詫?duì)目標(biāo)物、捕獲序列或報(bào)告序列進(jìn)行標(biāo)記。各種標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。在另一種實(shí)施方式中，可以通過(guò)雜交復(fù)合物中分子之間的能量轉(zhuǎn)移測(cè)定。再一方面，可以通過(guò)熒光微擾分析檢測(cè)。再一方面，可以通過(guò)一致和不一致位點(diǎn)之間的傳導(dǎo)性差異檢測(cè)。
本發(fā)明的另一方面，可以方便地進(jìn)行豐余分析。在一種實(shí)施方式中，可以應(yīng)用系列豐余分析，例如在進(jìn)行最初雜交復(fù)合物分析后，增加了嚴(yán)緊度條件，以影響變性，由此從第一雜交復(fù)合物分析中除去了報(bào)告序列。然后第二報(bào)告序列可以與剩余的復(fù)合目標(biāo)物和捕獲探針雜交，其中第二報(bào)告序列包括大量與第一報(bào)告序列中的重復(fù)單元數(shù)目和類型不同的重復(fù)單元。以這種方式，通過(guò)實(shí)施為其它應(yīng)用而描述的其它步驟，將除去存在一致的物理試驗(yàn)位點(diǎn)。結(jié)果是已經(jīng)就同樣的裝置和樣品材料進(jìn)行了豐余分析。
還可以進(jìn)行另一種豐余分析，其中存在多重，例如兩重或多重獨(dú)立分析系列。第一報(bào)告序列與第一套分析物雜交，第二報(bào)告序列與第二套分析物雜交，其中第一報(bào)告序列中重復(fù)單元的數(shù)目與第二報(bào)告序列中重復(fù)單元的數(shù)目或性質(zhì)不同。確定陣列的試驗(yàn)位點(diǎn)上的一致/不一致，結(jié)合定位在那些試驗(yàn)位點(diǎn)上的探針的知識(shí)，提供了兩種來(lái)源于雜交分析的的復(fù)合物，用于確定目標(biāo)物重復(fù)單元數(shù)目或性質(zhì)。
本發(fā)明的系統(tǒng)和方法對(duì)于確定復(fù)合樣品的性質(zhì)尤其有用，例如雜合樣品、和混合樣品例如來(lái)源于多重來(lái)源或供體的樣品。在應(yīng)用中，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可以用于更廣泛排列的應(yīng)用。其中包括鑒定，例如親子試驗(yàn)或其它的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用。還有另外一種應(yīng)用是疾病診斷，例如鑒定是否存在克隆腫瘤，其中腫瘤包括性質(zhì)或數(shù)目不同于患者的未患病基因狀態(tài)的重復(fù)單元。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供快速鑒定多態(tài)性系統(tǒng)重復(fù)單元性質(zhì)和/或數(shù)目的方法和系統(tǒng)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供準(zhǔn)確檢測(cè)患病狀態(tài)，尤其是克隆腫瘤疾病狀態(tài)、神經(jīng)學(xué)紊亂和遺傳疾病的易患病體質(zhì)的系統(tǒng)和方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供了一種用于在，例如法醫(yī)學(xué)和親子鑒定應(yīng)用中，進(jìn)行鑒定的快速有效的系統(tǒng)和方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A是按照本發(fā)明方法應(yīng)用的活動(dòng)矩陣裝置的一個(gè)實(shí)施方式的斷面圖。
圖1B是應(yīng)用本發(fā)明方法的活動(dòng)陣列裝置的透視圖。
圖2是包括目標(biāo)物、報(bào)告序列和捕獲序列的多重分析系統(tǒng)的各成分示意圖。
圖3A、3B和3C是包括分別存在缺口、重疊和配對(duì)的目標(biāo)序列、報(bào)告序列和捕獲序列的多重分析系統(tǒng)的示意簡(jiǎn)圖。
圖4A、4B和4C顯示相對(duì)于圖3A、3B和3C的圖示代表，分別表明有缺口、重疊和配對(duì)的TH01位置的多重分析列出的詳細(xì)序列。
圖5A-5G描述了顯示具有八個(gè)重復(fù)單元的目標(biāo)物、具有單一重復(fù)單元的報(bào)告序列和包括分別在圖5A-5G中表示的從四到十個(gè)重復(fù)單元的捕獲序列的多重分析物序列的概略圖。
圖6顯示了夾層分析的試驗(yàn)位點(diǎn)排列的計(jì)劃圖，其中有代表存在雜交復(fù)合物的如陰影所示的一致試驗(yàn)位點(diǎn)。
圖7A-7G顯示了包括具有八個(gè)堿基重復(fù)單元的目標(biāo)物、具有兩個(gè)堿基重復(fù)單元的報(bào)告序列和分別如圖7A-7G所示的從四到十個(gè)重復(fù)單元的一組捕獲序列的多重分辨系統(tǒng)的概略圖。
圖8顯示了含有代表存在雜交復(fù)合物的如陰影所示的一致試驗(yàn)位點(diǎn)的豐余分析試驗(yàn)位點(diǎn)的排列計(jì)劃圖。
圖9A顯示了一致條件下目標(biāo)物和雜交的報(bào)告序列的示意圖。
圖9B顯示了不一致條件下，也就是環(huán)條件下，目標(biāo)物和報(bào)告序列。
圖10A-A0G描述了環(huán)開(kāi)系統(tǒng)中的多重分辨，其中目標(biāo)物包括七個(gè)重復(fù)單元，報(bào)告序列包括分別在圖10A-10G中所示的從五到十一個(gè)重復(fù)單元的報(bào)告序列。
圖11是利用夾層雜交法鑒定THO1目標(biāo)DNA等位基因中，捕獲寡重復(fù)單元數(shù)對(duì)熒光(MFI)所作的函數(shù)圖。
圖12是捕獲序列中重復(fù)單元數(shù)目對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化熒光所作的函數(shù)圖，其中報(bào)告序列包括一個(gè)重復(fù)單元(左手側(cè))，還包括表示THO1基因座的豐余報(bào)告系統(tǒng)的零重復(fù)單元(右手側(cè))。
圖13是表示THO1基因座中被用于捕獲序列、報(bào)告序列和目標(biāo)等位基因的特定寡核苷酸的圖表。
圖14是G-A堆積與T-A堆積相比較，分別對(duì)分辨率所作的函數(shù)圖，其中成對(duì)的左圖和右圖分別表示8×對(duì)7×分辨(左側(cè)棒狀圖)和15×對(duì)14×分辨(右側(cè)棒狀圖)，它們表示G-A堆積和T-A堆積對(duì)目標(biāo)物的分辨率。
圖15分別表示芯片1到芯片4四個(gè)兩聯(lián)棒的分辨率圖，表示應(yīng)用十聚體報(bào)告序列(兩聯(lián)棒中的左棒)和末端具有丙炔基的十聚體報(bào)告序列(兩聯(lián)棒中的右棒)的最大分辨率。
圖16是雜合TPOX基因座中捕獲寡聚物對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化熒光密度所作的函數(shù)圖。
圖17是TPOX捕獲寡核苷酸、報(bào)告寡核苷酸和TPOX基因座的目標(biāo)等位基因的核苷酸序列表。
圖18是用于CSF1PON等位基因雜交分辨的捕獲重復(fù)單元數(shù)目對(duì)熒光密度(MFI/sec)所作的函數(shù)圖。
圖19是CSF1PO等位基因中捕獲寡核苷酸、報(bào)告寡核苷酸和目標(biāo)等位基因的表。
圖20是THO1/TPOX多重分析中捕獲序列重復(fù)單元的數(shù)目對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化密度所作的函數(shù)圖。
圖21是在鑒定雙鏈聚合物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的包括目標(biāo)TH01基因座的DNA中重復(fù)單元等位基因的系統(tǒng)中，捕獲寡核苷酸中重復(fù)單元數(shù)目對(duì)相對(duì)熒光所作的函數(shù)圖。
圖22A、22B和22C分別表示起始信號(hào)、變性三分鐘后信號(hào)、和變性十分鐘后信號(hào)的含有缺口(三聯(lián)棒中最左邊的棒)、相配(三聯(lián)棒中的中間棒)或重疊(三聯(lián)棒中的右棒)的捕獲寡核苷酸對(duì)熒光(MFI)所作的函數(shù)圖。
圖23是各種組合的相配/缺口和相配/重疊的配對(duì)區(qū)別圖表。
圖24是在應(yīng)用環(huán)出分析進(jìn)行目標(biāo)DNA的等位基因認(rèn)證中，用于確定重復(fù)單元性質(zhì)和數(shù)目的捕獲序列中重復(fù)單元的數(shù)目對(duì)熒光百分率所作的函數(shù)圖。
圖25A、25B和25C分別表示代表缺口、重疊和相配的多重TH01微變異分析的詳細(xì)序列列表。
圖26是用于檢測(cè)微變異等位基因THO19.3的捕獲寡核苷酸的數(shù)目或性質(zhì)對(duì)熒光密度(MFI)所作的函數(shù)圖。
圖1A和1B說(shuō)明應(yīng)用本發(fā)明的活動(dòng)可編程電子矩陣雜交系統(tǒng)的簡(jiǎn)單模型。通常，基底10支持電子可設(shè)定地址的微位置12的矩陣或排列。為了便于解釋，圖1A中的各微位置被標(biāo)記為12A、12B、12C和12D。將滲透層14置于單獨(dú)的電極12之上。滲透層允許相對(duì)較小荷電單元通過(guò)，但限制大荷電單元，例如DNA的移動(dòng)，以避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，大荷電單元與電極12輕易地直接接觸。滲透層14降低了由于DNA與電極12的直接接觸可能發(fā)生的電化學(xué)降解，部分可能由于極端pH導(dǎo)致的電解反應(yīng)。進(jìn)一步用于減小DNA與電極的強(qiáng)烈的、非特異性吸附。將附著區(qū)16置于滲透層14之上，其為目標(biāo)材料提供特異性結(jié)合位點(diǎn)。附著區(qū)16被標(biāo)記為16A、16B、16C和16D，以便分別與電極12A-D的標(biāo)記相對(duì)應(yīng)。
在操作中，儲(chǔ)庫(kù)18包括附著區(qū)16以上的空間，其含有需要的和不需要的用于檢測(cè)、分析或應(yīng)用的材料。將荷電單元20，例如荷電DNA加入儲(chǔ)庫(kù)18。在本發(fā)明的一個(gè)方面，活動(dòng)的、可編程的、矩陣系統(tǒng)包括將荷電材料20運(yùn)輸?shù)饺我馓囟ㄎ⑽恢?2的方法?；罨?，微位置12形成任何荷電功能化特定結(jié)合單元20朝向電極12的無(wú)區(qū)域電泳運(yùn)輸。例如，如果將電極12A設(shè)定為陽(yáng)極，電極12D設(shè)定為陰極，電泳力22的路線將貫通電極12A和12D。電泳力22的路線導(dǎo)致具有靜負(fù)電荷的荷電結(jié)合單元20向著陽(yáng)極12A移動(dòng)。具有靜正電荷的荷電材料20在電泳力作用下向荷負(fù)電荷的電極12D移動(dòng)。當(dāng)已被功能化的靜負(fù)電荷結(jié)合單元20接觸附著層16，導(dǎo)致其在電泳力作用下運(yùn)動(dòng)時(shí)，功能化的特定結(jié)合單元20即與附著層16A共價(jià)結(jié)合。
在詳細(xì)探討本專利的發(fā)明以前，首先將論述一般術(shù)語(yǔ)。本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“短串聯(lián)重復(fù)序列”(STR)指含有單一序列模塊的基因座，其在該基因座的不同等位基因串聯(lián)重復(fù)不同次數(shù)。重復(fù)單元通常指在短串聯(lián)重復(fù)序列中重復(fù)的個(gè)體單一序列模塊。重復(fù)單元可以是，例如，含有相同重復(fù)單一序列模塊的完全重復(fù)單元，或者可以是部分重復(fù)單元，例如重復(fù)單元之間存在一些不同，例如在重復(fù)單元之間存在的微小變異體。認(rèn)為一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)是表現(xiàn)雜交復(fù)合穩(wěn)定性的相對(duì)或局部最大值的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)。作為例子，一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)可以是這樣一種實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)，其中目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目等于用于多系統(tǒng)的捕獲序列中重復(fù)單元的數(shù)目加報(bào)告探針中重復(fù)單元的數(shù)目之和，或者其中目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目等于探針中重復(fù)單元的數(shù)目。在一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的另一個(gè)例子中，如果存在部分重復(fù)單元，一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)可以表現(xiàn)為這樣一種位點(diǎn)，即其中目標(biāo)物中重復(fù)單元基本上類似于捕獲序列加探針中重復(fù)單元的性質(zhì)，或單個(gè)探針的性質(zhì)。另一方面，不一致位點(diǎn)是相對(duì)于至少一個(gè)其它位點(diǎn)表現(xiàn)相對(duì)較低水平的雜交復(fù)合穩(wěn)定性的位點(diǎn)。通常被稱為不一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的例子是那些存在缺口、重疊、點(diǎn)突變(例如，單個(gè)堿基突變，例如缺失、插入、轉(zhuǎn)換和顛換)、點(diǎn)突變加重疊、點(diǎn)突變加缺口、單核苷酸變異或其它微變異的位點(diǎn)。
多重系統(tǒng)例如夾層分析中的雜交復(fù)合分析通常包括目標(biāo)物、捕獲序列和報(bào)告序列。環(huán)出應(yīng)用中的雜交復(fù)合分析通常至少包括目標(biāo)物和探針。本發(fā)明應(yīng)用的陣列通常指多實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)，最少兩個(gè)以上實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的通常數(shù)目將是基因座的每個(gè)等位基因分別一個(gè)位點(diǎn)。需要實(shí)驗(yàn)的基因座的數(shù)目將根據(jù)不同應(yīng)用而異，用于遺傳疾病分析通常為一個(gè)，用于腫瘤檢測(cè)為一到五個(gè)，用于親子鑒定和法醫(yī)為六、八、九、十三或更多。實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)相對(duì)于另一個(gè)位點(diǎn)的物理定位可以按照任何方便的形狀，可為線狀或成排和柱狀排列。
圖2是多重分析各元件的示意圖。目標(biāo)物30包括包括第一獨(dú)特旁側(cè)區(qū)32，第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34，以及位于第一獨(dú)特旁側(cè)區(qū)32和第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34之間的一個(gè)或多個(gè)重復(fù)單元36。目標(biāo)物30可以是一種來(lái)自特定基因座，例如TH01的單鏈或雙鏈核酸。報(bào)告序列40包括至少一種獨(dú)特序列區(qū)42，并任選包括一種或多種位于獨(dú)特序列區(qū)42末端的重復(fù)單元44。如果標(biāo)記報(bào)告序列40，標(biāo)記物46在此結(jié)合。通常，報(bào)告序列40的獨(dú)特序列區(qū)42與目標(biāo)物30的第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34互補(bǔ)。捕獲序列50包括一種捕獲獨(dú)特序列區(qū)52以及一種或多種位于捕獲獨(dú)特序列區(qū)52末端的重復(fù)單元54。如果捕獲序列50結(jié)合到固體支持物或其它固定基質(zhì)時(shí)，可以使用一種結(jié)合元件56，例如生物素。
圖3A、3B和3C是是包括目標(biāo)物、報(bào)告序列和捕獲序列的多重分析系統(tǒng)的概略圖，其中分別存在缺口、重疊和匹配。為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，采用圖2中各相應(yīng)構(gòu)件的編號(hào)。在圖3A中，存在缺口狀況?？偟貋?lái)說(shuō)，目標(biāo)物30與報(bào)告序列40和捕獲序列50雜交。具體地說(shuō)，第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34與報(bào)告序列40的包括獨(dú)特序列區(qū)42的互補(bǔ)鏈雜交。同樣，目標(biāo)物30的第一獨(dú)特旁側(cè)區(qū)32與捕獲序列50的互補(bǔ)捕獲獨(dú)特序列區(qū)52雜交。在該樣品中，目標(biāo)物30包括八個(gè)重復(fù)單元。該詳細(xì)描述的結(jié)構(gòu)同樣適用于圖3A、3B和3C。圖3A描述了一種缺口區(qū)56，其來(lái)源于具有六個(gè)重復(fù)單元54的捕獲序列50和具有一個(gè)重復(fù)單元44的報(bào)告序列40。因此，報(bào)告序列加捕獲序列中重復(fù)單元44、54的總和是七，該值比目標(biāo)物30中重復(fù)單元36的總數(shù)少一。在圖3B中，顯示了一種重疊狀況。其中，捕獲序列包括八個(gè)重復(fù)單元34，報(bào)告序列40仍然包括一個(gè)重復(fù)單元44。其中捕獲序列50和報(bào)告序列40中重復(fù)單元34、44的總數(shù)是九，超過(guò)了目標(biāo)物中重復(fù)單元36的數(shù)目，因此一個(gè)重復(fù)單元被重疊，此處顯示的是與報(bào)告序列40結(jié)合的重復(fù)單元44。圖3C顯示了一種目標(biāo)物30與報(bào)告序列40加捕獲序列50之間相匹配的狀況。其中存在七個(gè)與捕獲序列50結(jié)合的重復(fù)單元34和一個(gè)與報(bào)告序列40結(jié)合的重復(fù)單元44。因此，目標(biāo)物30中重復(fù)單元36的數(shù)目等于捕獲序列50中重復(fù)單元34的數(shù)目加報(bào)告序列40中重復(fù)單元44數(shù)目的總和。
圖4A、4B和4C顯示了一種與圖3A、3B和3C的例子相對(duì)應(yīng)的具體核苷酸序列的實(shí)例。需要注意的是圖3A、3B和3C的從左至右的取向與圖4A、4B和4C從左至右的取向相反。圖4A顯示了一種缺口狀況，其中缺口56位于報(bào)告序列40的重復(fù)單元44和臨近捕獲序列50的缺口56的末端重復(fù)單元(5’CATT3’)之間。在圖4A、4B和4C中，目標(biāo)物30的堿基重復(fù)單元36是5’AATG3’，因此，它的互補(bǔ)堿基序列是5’CATT3’44、54。在圖4A、4B和4C中，堿基重復(fù)單元的核苷酸用大寫(xiě)字母表示。這樣做用以將這些單元與構(gòu)成目標(biāo)物30的第一獨(dú)特旁側(cè)區(qū)32和第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34以及報(bào)告序列40的獨(dú)特區(qū)序列42和捕獲序列50的捕獲獨(dú)特序列區(qū)52的核苷酸區(qū)別開(kāi)來(lái)。就象看到的那樣，雜交鏈中的核苷酸配對(duì)，被稱為A-T對(duì)和G-C對(duì)是互補(bǔ)的。圖4B顯示了具有一個(gè)重復(fù)單元重疊的錯(cuò)配。具體地說(shuō)，含有序列5’CATT3’的堿基重復(fù)單元44從與目標(biāo)物30的第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34相鄰的堿基單元36雜交狀況下被轉(zhuǎn)移出來(lái)。如所示，報(bào)告序列40的獨(dú)特序列區(qū)42的5’末端核苷酸(指定為“c”)顯示從與目標(biāo)序列30的第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)的互補(bǔ)“g”末端核苷酸的完全雜交條件下輕微轉(zhuǎn)移出來(lái)。這種描述是任選的，它也可以包括這種狀況，即獨(dú)特序列區(qū)42的末端核苷酸處于與目標(biāo)物30的第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34的末端核苷酸雜交的條件下。圖4C顯示了一種匹配狀況，在該實(shí)例中，重復(fù)區(qū)的性質(zhì)，即重復(fù)單元部分和整體數(shù)目以及序列的互補(bǔ)性相匹配。在圖4C的匹配狀況下，報(bào)告序列40的重復(fù)單元44的5’末端核苷酸“C”鄰近并與捕獲序列50的堿基重復(fù)單元54的3’末端核苷酸“T”連續(xù)，其使報(bào)告序列40的重復(fù)單元44的5’“C”和捕獲寡核苷酸50的堿基重復(fù)單元54的3’“T”之間的堿基堆積成為可能。這兩個(gè)堿基堆疊的核苷酸在圖4C中用下劃線表示。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可以經(jīng)5’末端含有合適吸附化合物，優(yōu)選生物素的捕獲寡聚物固定雜交復(fù)合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，可以經(jīng)3’末端具有合適分子，優(yōu)選發(fā)色團(tuán)的報(bào)告寡聚物40標(biāo)記雜交復(fù)合物。
本文中重復(fù)單元的性質(zhì)被定義為包括完全(或完整)重復(fù)單元的數(shù)目和部分重復(fù)單元的數(shù)目。也被成為微變異體或隱性簡(jiǎn)單序列的部分重復(fù)單元可以包括與最常見(jiàn)重復(fù)單元序列的單核苷酸變異。這些變異可以由簡(jiǎn)單重復(fù)序列的插入、缺失、轉(zhuǎn)換或顛換多態(tài)現(xiàn)象構(gòu)成。因?yàn)樗蟹治鯴TR基因座的現(xiàn)有方法均依賴于核苷酸的大小或數(shù)目，因此缺乏有關(guān)轉(zhuǎn)換頻率和轉(zhuǎn)換重復(fù)單元多態(tài)性的信息。然而，近來(lái)其它研究者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到它們的意義，很可能那些能夠有效檢測(cè)它們的方法將會(huì)很有價(jià)值(Sean Walsh和Dennis Roeder，DNA法醫(yī)學(xué)—科學(xué)、證據(jù)和未來(lái)展望，McLean，VA.，1997年11月)。
圖25證明了本發(fā)明如何檢測(cè)到常見(jiàn)微變異體TH01 9.3的存在。這里提供了兩種新的單元含有部分重復(fù)單元71 ATG的微變異體目標(biāo)序列70和互補(bǔ)于71和七個(gè)5’相鄰核苷酸的微變異體報(bào)告寡核苷酸80。圖25顯示了當(dāng)目標(biāo)等位基因的性質(zhì)為總共九個(gè)重復(fù)單元其中一個(gè)部分重復(fù)時(shí)，DNA亞序列的關(guān)系，形成一種匹配的一致。在前面圖4A-4C中論述的元件保留它們的編號(hào)，新元件用新編號(hào)標(biāo)記。因此目標(biāo)序列70由第一獨(dú)特序列34、完整重復(fù)序列36、第二獨(dú)特旁側(cè)序列32和新的部分重復(fù)序列71構(gòu)成。捕獲序列50與圖4A中所述的相同，除了它均有三個(gè)重復(fù)單元54。微變異報(bào)告序列80類似于具有重復(fù)序列44的報(bào)告序列40，但不同之處在于沒(méi)有獨(dú)特旁側(cè)序列以及包括互補(bǔ)于目標(biāo)物70部分重復(fù)單元71的序列81。報(bào)告序列80的穩(wěn)定性通過(guò)以下兩個(gè)特征而增強(qiáng)。第一，它僅與微變異區(qū)互補(bǔ)，第二，它將會(huì)發(fā)生堿基堆積，因此僅在含有3ru捕獲寡聚物的位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)一致或局部最大穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到如何將本發(fā)明應(yīng)用于不同于TH01 9.3序列的微變異序列。圖26證明了該方法的有效性。
有利地進(jìn)行了鄰近或靠近核苷酸的選擇，從而增加了一致和不一制實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)之間的能量差異。下面將進(jìn)一步描述該選擇或修飾的詳細(xì)論述，例如應(yīng)用末端核苷酸堿基儲(chǔ)備，或末端核苷酸用例如丙炔基、甲基或膽固醇基修飾，或通過(guò)應(yīng)用結(jié)合技術(shù)例如酶連接或化學(xué)連接。
圖5A-5G描繪了一種多重系統(tǒng)的概略示意。該系統(tǒng)中使用的雜交復(fù)合物有時(shí)也被成為夾層分析。同樣，為了方便說(shuō)明，采用的編號(hào)對(duì)應(yīng)于圖2、圖3A、3B和3C以及圖4A、4B和4C中所用的那些。在各描述中，目標(biāo)物30具有一個(gè)獨(dú)特旁側(cè)區(qū)32和一個(gè)第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34，以及一組插入其中的重復(fù)單元36。在該實(shí)例中，重復(fù)單元36的編號(hào)是8。報(bào)告序列40包括一個(gè)獨(dú)特序列區(qū)42，其與第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34互補(bǔ)，該實(shí)例中在報(bào)告序列末端還包括一個(gè)重復(fù)單元44。捕獲序列50包括一個(gè)捕獲獨(dú)特序列區(qū)52，在該實(shí)例中在捕獲序列50末端還包括多個(gè)重復(fù)單元54。捕獲獨(dú)特序列區(qū)52與第一獨(dú)特旁側(cè)區(qū)32互補(bǔ)。
圖5A顯示了一種具有4個(gè)重復(fù)單元54的捕獲序列50。因?yàn)椴东@序列50中重復(fù)單元54的數(shù)目加報(bào)告序列40中重復(fù)單元44的數(shù)目之和(4+1)比目標(biāo)物30中重復(fù)單元36的數(shù)目(8)少，因此存在缺口56。如圖5A所示，缺口基本上是3個(gè)重復(fù)單元36、44、54的長(zhǎng)度。就術(shù)語(yǔ)而論，捕獲序列50中重復(fù)單元54的數(shù)目有時(shí)被稱為“N捕獲物”，其中N等于捕獲物50中堿基重復(fù)單元54的數(shù)目加報(bào)告物40中堿基重復(fù)單元44的數(shù)目。采用該術(shù)語(yǔ)，存在一種具有N捕獲物的匹配，其中N等于目標(biāo)物30中重復(fù)單元36的數(shù)目。因此，在存在匹配狀況的圖5D的實(shí)例中，具有7個(gè)重復(fù)單元54的捕獲物50也可以被稱為“8捕獲物”，因?yàn)榫哂?個(gè)重復(fù)單元54的捕獲物50當(dāng)使用用它們選擇的具有單一重復(fù)單元44的報(bào)告序列40時(shí)，即提供了一種匹配狀況，其中重復(fù)單元44、54的總數(shù)目等于目標(biāo)物中重復(fù)單元36的數(shù)目。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解可以用各種命名或編號(hào)協(xié)定準(zhǔn)確描述下劃線的編號(hào)，這些下劃線編號(hào)包括本文中的本發(fā)明，不是已采用的命名或編號(hào)協(xié)定。
圖5B顯示了具有5個(gè)重復(fù)單元54的捕獲序列50，其中存在長(zhǎng)度基本上為2個(gè)重復(fù)單元36、44、54的缺口56。圖5C顯示了具有6個(gè)重復(fù)單元54的捕獲序列50，其中存在長(zhǎng)度基本上為單一重復(fù)單元36、44、56的缺口56。圖5D顯示了一種匹配狀況，其中具有7個(gè)重復(fù)單元54的捕獲序列50和具有單一重復(fù)單元44的報(bào)告序列40等于目標(biāo)物30中重復(fù)單元36的數(shù)目。
圖5E、5F和5G顯示了一種重疊狀況。圖5E顯示了具有8個(gè)重復(fù)單元54的捕獲序列50。如所述，報(bào)告序列40的重復(fù)單元44顯示基本上處于與目標(biāo)物30非雜交狀況。圖5F顯示具有9個(gè)重復(fù)單元54的捕獲序列50，其中捕獲序列50的末端重復(fù)單元58和報(bào)告序列的重復(fù)單元44分別與目標(biāo)物30均處于基本上非雜交狀況。圖5G顯示了具有10個(gè)重復(fù)單元54的捕獲序列50，以至捕獲序列50的兩個(gè)末端重復(fù)單元58和報(bào)告序列40的重復(fù)單元44與目標(biāo)物30處于基本上非雜交關(guān)系。
圖6顯示了多重分析，例如夾層分析中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)排列的計(jì)劃圖。一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)被確定為含有7個(gè)重復(fù)單元的捕獲序列的位點(diǎn)。該圖描述了一種用1個(gè)重復(fù)單元的報(bào)告序列進(jìn)行的分析，因此可以確定目標(biāo)物必須含有8個(gè)重復(fù)單元，因?yàn)樵谝恢挛稽c(diǎn)上，捕獲序列中重復(fù)單元的數(shù)目(7)加報(bào)告序列中重復(fù)單元的數(shù)目(1)等于8。該描述涉及圖5，其中顯示了用含有一個(gè)重復(fù)單元的報(bào)告序列對(duì)含有8個(gè)重復(fù)單元目標(biāo)物的DNA樣品進(jìn)行的分析所得到的結(jié)果。
圖7A至7G是多重系統(tǒng)，例如夾層分析的概略圖示，其中報(bào)告序列包括兩個(gè)重復(fù)單元。這與圖5A-G(其中報(bào)告序列包括單一重復(fù)單元)的分析有所區(qū)別。同樣，為了方便說(shuō)明，前面圖的編號(hào)在相似情況下將被采用。圖7A顯示了具有第一獨(dú)特旁側(cè)區(qū)32和第二獨(dú)特旁側(cè)區(qū)34的目標(biāo)物30。報(bào)告序列40包括一個(gè)獨(dú)特序列區(qū)42，該實(shí)例中還包括兩個(gè)重復(fù)單元44。捕獲序列50包括一個(gè)捕獲獨(dú)特序列區(qū)52和4個(gè)重復(fù)單元54。同樣，從術(shù)語(yǔ)上說(shuō)，捕獲序列50可以被稱為“5捕獲物”，反映了應(yīng)用的與圖5A-5G的分析有關(guān)的術(shù)語(yǔ)，也就是使用具有單一重復(fù)單元44的報(bào)告序列40的那些術(shù)語(yǔ)。
圖7B顯示了一種多重系統(tǒng)，其中捕獲序列50包括5個(gè)堿基單元54。圖7A和7B的實(shí)例均包括缺口56。
圖7C顯示了一種匹配狀況，其中目標(biāo)物30中重復(fù)單元36的數(shù)目等于捕獲序列50中重復(fù)單元54的數(shù)目加報(bào)告序列40中重復(fù)單元44的數(shù)目的總和(6+2=8)。圖7C描繪了存在匹配狀況的一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)。需要注意的是一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的有效位置從圖5D移到了圖7C。這反映了報(bào)告序列40中重復(fù)單元44數(shù)目的改變。使用增加較長(zhǎng)捕獲序列50的一個(gè)序列或一段單元，具有比一個(gè)堿基單元44短或長(zhǎng)的報(bào)告序列40將改變一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的物理位置，例如在圖6中，當(dāng)從具有一個(gè)重復(fù)單元44的報(bào)告序列改變成為具有兩個(gè)重復(fù)單元44的報(bào)告序列40時(shí)，實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)從26D改變成為26C。
圖7B-7G顯示了一種重疊狀況。在圖7D中，報(bào)告序列40的一個(gè)重復(fù)單元44與目標(biāo)物30的重復(fù)單元36處于雜交關(guān)系。報(bào)告序列40的第二重復(fù)單元44’與復(fù)合物處于錯(cuò)配，即重疊狀況。圖7E顯示了一種重疊狀況，其中重復(fù)單元60與目標(biāo)物30處于非雜交條件。圖7F和7G也包括錯(cuò)配排列，其包括多重復(fù)單元60與目標(biāo)物30處于非雜交條件的重疊。錯(cuò)配重復(fù)單元即可以是來(lái)自報(bào)告序列30，也可以來(lái)自捕獲序列50，或者來(lái)自二者的組合。
圖8顯示了多重分析，例如夾層分析中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)排列的計(jì)劃圖。一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)被確定為含有6個(gè)重復(fù)單元的捕獲序列的位點(diǎn)。該分析描述了用一種具有2個(gè)重復(fù)單元的報(bào)告序列進(jìn)行的分析，因此能夠確定目標(biāo)物一定含有8個(gè)重復(fù)單元，因?yàn)樵谝恢挛稽c(diǎn)，捕獲序列中重復(fù)單元的數(shù)目(6)加報(bào)告序列中重復(fù)單元的數(shù)目(2)等于8。該描述涉及圖7A-7G，其中顯示了用具有兩個(gè)重復(fù)單元的報(bào)告序列對(duì)含有一種八重復(fù)單元目標(biāo)物的DNA樣品進(jìn)行的分析中得到的結(jié)果。與圖6相比，當(dāng)用第二報(bào)告寡核苷酸對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行豐余分析時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)位置的改變和目標(biāo)等位基因信息的確定。
圖9A和圖9B顯示了本發(fā)明的環(huán)出實(shí)施方式的概略圖。在該圖中，捕獲序列60包括第一獨(dú)特旁側(cè)序列62，第二獨(dú)特旁側(cè)序列64，以及含有一個(gè)或多個(gè)重復(fù)單元的重復(fù)單元66插入序列。報(bào)告序列70包括報(bào)告第一獨(dú)特旁側(cè)序列72，報(bào)告第二獨(dú)特旁側(cè)序列74，以及重復(fù)單元76的插入序列。報(bào)告序列70的重復(fù)單元76的插入序列中重復(fù)單元數(shù)目可以與捕獲序列60的重復(fù)單元66的插入序列中重復(fù)單元的數(shù)目相同，也可以不同。可以包括報(bào)告序列的標(biāo)記物78。
圖10A至10G描繪了可變長(zhǎng)度的重復(fù)單元的多重系統(tǒng)。圖7-10的編號(hào)在可操作的程度上將采納圖9A-9B的編號(hào)。在圖10A中，捕獲序列60包括第一獨(dú)特旁側(cè)序列62，第二獨(dú)特旁側(cè)序列64，和具有5個(gè)重復(fù)單元的重復(fù)單元66插入序列。報(bào)告序列70包括報(bào)告第一獨(dú)特旁側(cè)序列72，報(bào)告第二獨(dú)特旁側(cè)序列74，和重復(fù)單元插入序列，具體地說(shuō)，具有7個(gè)重復(fù)單元。存在錯(cuò)配或環(huán)出狀況，其中在插入序列66、76中，給出不同的重復(fù)單元編號(hào)。同樣，在圖10B和10D-10G中，存在錯(cuò)配或環(huán)出狀況。報(bào)告序列70中各組成圖形包括7個(gè)堿基重復(fù)單元。描述了在捕獲序列60的重復(fù)單元66插入序列中一段或序列數(shù)目不斷增加的重復(fù)單元。圖10B包括6個(gè)重復(fù)單元，其仍然導(dǎo)致圖10B中的錯(cuò)配，即環(huán)出狀況，其中在報(bào)告序列70的插入序列76中的大量重復(fù)單元是環(huán)出是。在圖10D-10D的各圖中，在捕獲序列60中的插入序列66中，重復(fù)單元的數(shù)目超過(guò)了報(bào)告序列的插入序列76中重復(fù)單元的數(shù)目。然后出現(xiàn)環(huán)出或錯(cuò)配狀況。在圖10D中，重復(fù)單元64的插入序列中存在8個(gè)重復(fù)單元，其與報(bào)告插入序列的重復(fù)單元76的數(shù)目相差一個(gè)重復(fù)單元。在圖10E中，捕獲序列60中重復(fù)單元64的插入序列中存在9個(gè)重復(fù)單元。在圖10F中，捕獲序列60中重復(fù)單元64的插入序列中存在10個(gè)重復(fù)單元。在圖10G中，捕獲序列60中重復(fù)單元64的插入序列中存在11個(gè)重復(fù)單元。
在一種方式中，標(biāo)記雜交復(fù)合物，確定一致和不一致的步驟包括檢測(cè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上標(biāo)記的雜交復(fù)合物的量。檢測(cè)裝置和方法可以包括，但不限于光成像、電子成像、用CCD照相機(jī)成像以及集成光學(xué)成像。另外，無(wú)論標(biāo)記或未標(biāo)記，檢測(cè)是定量的，其可以包括統(tǒng)計(jì)分析。復(fù)合物的標(biāo)記部分可以是目標(biāo)物、捕獲序列、報(bào)告序列或全部雜交復(fù)合物。標(biāo)記可以是選自以下物質(zhì)但不限于它們的熒光標(biāo)記BodipyTexas Red，Bodipy Far Red，Lucifer Yellow，Bodipy 630/650-X，BodipyR6G-X和5-CR 6G。還可以通過(guò)比色標(biāo)記、射干內(nèi)務(wù)發(fā)光標(biāo)記和/或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記進(jìn)一步可以包括雜交復(fù)合物分子間的能量轉(zhuǎn)移混亂分析、淬火、給體分子到受體分子之間的電子傳送、后者可以被雙鏈匹配雜交復(fù)合物促進(jìn)(參見(jiàn)，例如，Tom Meade和FaizKayyem，DNA間的電子轉(zhuǎn)移(electrontransportthrough DNA))。任選地，如果雜交復(fù)合物沒(méi)有標(biāo)記，可以通過(guò)測(cè)定雙鏈和非雙鏈DNA之間的導(dǎo)電性差異進(jìn)行檢測(cè)(參見(jiàn)，例如，Tom Meade和Faiz Kayyem，DNA間的電子轉(zhuǎn)移)。另外，可以通過(guò)基于多孔硅的光干涉測(cè)量法進(jìn)行直接檢測(cè)。
可以擴(kuò)增標(biāo)記，標(biāo)記可以包括例如分支或分叉DNA。如果目標(biāo)DNA是純化的，可以不擴(kuò)增也可以擴(kuò)增。另外，如果擴(kuò)增的是純化，并且擴(kuò)增是指數(shù)法，目標(biāo)物可以是，例如，PCR擴(kuò)增的DNA或SDA擴(kuò)增的DNA?？梢允褂镁€性DNA擴(kuò)增法，例如滾環(huán)或轉(zhuǎn)錄失控。如果目標(biāo)DNA是未純化的，無(wú)論是未擴(kuò)增的或擴(kuò)增的，擴(kuò)增方法進(jìn)一步由用于指數(shù)擴(kuò)增的PCR和SDA，以及用于線性擴(kuò)增的滾環(huán)或轉(zhuǎn)錄失控組成。
目標(biāo)DNA可以來(lái)源于組織，包括但不限于頭發(fā)、血液、皮膚、唾液糞便、精液、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、犯罪現(xiàn)場(chǎng)的證據(jù)。目標(biāo)DNA的來(lái)源可以包括正常組織、死亡組織、腫瘤組織、植物材料、動(dòng)物材料、哺乳動(dòng)物、人、鳥(niǎo)、魚(yú)、微生物材料、異型生物質(zhì)材料、病毒材料、細(xì)菌材料、和原生動(dòng)物材料。
其中目標(biāo)材料來(lái)源于克隆的有機(jī)體(Ian Wilmut，Roslyn研究所，Edinborough)，以確定遺傳漂變特性和水平的程度。
另外，目標(biāo)材料的來(lái)源可以包括RNA。再進(jìn)一步說(shuō)，目標(biāo)材料的來(lái)源可以包括線粒體DNA。
實(shí)施例實(shí)施例1通過(guò)夾層雜交法鑒定TH01目標(biāo)DNA等位基因TH01基因座在人酪氨酸羥化酶基因(ref)的非編碼區(qū)中含有五到十一個(gè)拷貝數(shù)的四核苷酸重復(fù)序列(AATG)。該基因座是一種法醫(yī)領(lǐng)域用于DNA指紋分析的通常被使用和接受的基因座。圖1描述了從設(shè)計(jì)用于確定未知目標(biāo)DNA樣品中存在的等位基因性質(zhì)的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)本發(fā)明描述的方法分析后得到的數(shù)據(jù)。
通過(guò)將混合抗生物素蛋白鏈菌素的瓊脂有機(jī)層旋轉(zhuǎn)涂布到電極頂端，制備硅芯片，由此形成用于結(jié)合DNA的下部基礎(chǔ)的滲透層(參見(jiàn)，例如，美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)No.08/271882，1994年7月7日申請(qǐng)，題目為“用于分子生物學(xué)分析和診斷的電子嚴(yán)緊控制法”，按照Sosnowski等，1997，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院科學(xué)進(jìn)展)。該滲透層一面與電極相鄰，另一面與含有分析液的緩沖液相鄰。然后將特異于各TH01等位基因的捕獲DNA電子定位到旋轉(zhuǎn)涂布芯片上的個(gè)體位點(diǎn)，以便各實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)能夠檢測(cè)不同的TH01等位基因。捕獲寡聚物的序列在表1中列出。捕獲寡聚物在50mM組氨酸緩沖液(pH約為5.4)中以500nM的濃度電子定位。某一時(shí)刻，襯墊被加+5偏壓，提供+4.0微安培(A)的電流38微秒。然后逆轉(zhuǎn)該區(qū)域的極性，加-4.0A到5個(gè)襯墊，持續(xù)25微秒。在約30秒的總電子定位時(shí)間內(nèi)重復(fù)該循環(huán)500次。在這樣的條件下，捕獲寡聚物的生物素基質(zhì)與活化實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上的滲透層中的抗生物素蛋白鏈菌素反應(yīng)，從而使捕獲寡聚物固定到該位點(diǎn)上。
然后將由TH01等位基因5和9構(gòu)成的互補(bǔ)目標(biāo)DNA的混合物電子雜交到含有設(shè)定地址的捕獲DNA的各位點(diǎn)上。電子雜交在低導(dǎo)電性兩性離子緩沖液中，在經(jīng)驗(yàn)確定的能夠促進(jìn)無(wú)滑移雜交的溫度下進(jìn)行?；陔娮与s交的性質(zhì)，具體地說(shuō)是低導(dǎo)電性的緩沖液(Edman，等，核酸研究，1997)，在比常規(guī)非電子雜交較低的溫度下能夠?qū)崿F(xiàn)高嚴(yán)緊度的雜交。分析TH01的實(shí)驗(yàn)通常在34-42％C下進(jìn)行。目標(biāo)DNA在50mM組氨酸緩沖液(在其中性pH～5.4)中，以5-125nM的濃度進(jìn)行電子雜交。程序化電子方案包括下列步驟。某一時(shí)刻襯墊被加偏壓至+5，提供+4.0微安培(A)的電流19微秒(ms)。然后逆轉(zhuǎn)該區(qū)域的極性，將-4.0A的電流加到同樣5個(gè)襯墊上，持續(xù)12ms。在總共約30秒的電子定位時(shí)間內(nèi)重復(fù)該偏壓-AC循環(huán)500次。
該實(shí)驗(yàn)也通過(guò)被動(dòng)、非電子雜交在高嚴(yán)緊度條件下進(jìn)行，但提供更長(zhǎng)的保溫時(shí)間(50mMNaPO4緩沖液，pH7.0，60％C，30-60分鐘，結(jié)果未顯示)。
由于四核苷酸重復(fù)互補(bǔ)排列的可塑性質(zhì)，這種雜交步驟的嚴(yán)緊度很?chē)?yán)格。不需要排列旁側(cè)獨(dú)特序列即可十分容易地得到穩(wěn)定的雜交體，因?yàn)橹貜?fù)區(qū)域的長(zhǎng)度為20-44個(gè)堿基。由于無(wú)足夠嚴(yán)緊度形成的記錄雜交體以外的雜交體將不能被任何雜交分析準(zhǔn)確地分辯。在相對(duì)交低溫度下，可以用電子雜交獲得高嚴(yán)緊度的雜交，這是由于緩沖液的低導(dǎo)電性，以及形成的排斥負(fù)電荷對(duì)DNA骨架的低屏蔽。DNA的電濃縮克服了它們的排斥作用同時(shí)維持高度嚴(yán)緊的雜交條件。
然后將1個(gè)重復(fù)單元的報(bào)告DNA(圖13，在50mM NaPO4，500mM NaCl，pH7.0中，濃度為500nM)被動(dòng)雜交到通過(guò)上述步驟形成的捕獲-目標(biāo)復(fù)合物上。在目標(biāo)物定向雜交以使捕獲寡聚物和報(bào)告寡聚物的末端核苷酸并列的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上報(bào)告序列的雜交最穩(wěn)定。這種附加穩(wěn)定性是由于末端核苷酸的堿基堆積導(dǎo)致。這種并列將根據(jù)捕獲寡聚物上吸附化合物的位置而成為5’-3’或3’-5’。不穩(wěn)定構(gòu)型是捕獲序列和報(bào)告序列之間存在一個(gè)四堿基(或更多)的缺口，或者存在一個(gè)捕獲序列和報(bào)告序列的四堿基(或更多)重疊(參見(jiàn)，例如，圖3A-3C，和5A-5G)。
報(bào)告序列雜交后，將攜帶DNA的芯片用50mM NaPO4，pH7.0在室溫下沖洗幾次。然后將雜交有機(jī)金屬-芯片的溫度升高到30℃，以一分鐘的時(shí)間間隔記錄各實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的熒光水平。通過(guò)計(jì)算機(jī)程序(IP Lab)數(shù)字化處理熒光值，作為平均像素強(qiáng)度。選擇各襯墊上的特定區(qū)域，儲(chǔ)存各位點(diǎn)的像素強(qiáng)度用于分析。圖1中的直方圖顯示了變性步驟剛一完成后各實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上的平均像素強(qiáng)度。
圖11顯示了熒光作為重復(fù)單元數(shù)目的指標(biāo)的圖形。這些結(jié)果顯示TH01 DNA的雜合混合物可以被分成匹配(一致)和錯(cuò)配(不一致)雜交體，匹配雜交體代表DNA樣品中存在的等位基因的特性。所有可能的純合和雜合TH01 STR等位基因混合物(5+6，5+7，5+8等)均經(jīng)芯片模式，例如圖1A和1B所示的模式分析表明等位基因間差別相似的良好水平。
實(shí)施例2用豐余報(bào)告序列進(jìn)行的目標(biāo)DNA的再分析通過(guò)升高溫度至約50℃，不會(huì)使由捕獲序列得到的目標(biāo)物變性的條件下，使來(lái)自前面實(shí)施例中描述芯片的匹配位點(diǎn)的一重復(fù)單元報(bào)告序列變性。然后使該芯片再次與零重復(fù)單元的報(bào)告序列雜交(參見(jiàn)例如圖5)。這使穩(wěn)定夾層復(fù)合物的位置從4位和5位(參見(jiàn)，圖12，左側(cè)，一重復(fù)單元的報(bào)告序列)轉(zhuǎn)移到5位和6位(圖12，右側(cè)，零重復(fù)單元的報(bào)告序列)。利用捕獲序列中重復(fù)單元的數(shù)目加報(bào)告序列中重復(fù)單元的數(shù)目等于目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目的公式，我們發(fā)現(xiàn)這種情況下目標(biāo)DNA存在TH01的5和6等位基因的雜合混合。再分析進(jìn)一步確認(rèn)具有第二寡聚物序列的目標(biāo)DNA中存在的等位基因的特性。這種豐余分析增加了分析結(jié)果的重要性，因?yàn)樗举|(zhì)上是一種目標(biāo)DNA與具有不同序列的寡聚物的新的詢問(wèn)。應(yīng)用不同序列降低了由于寡聚物二級(jí)結(jié)構(gòu)或其它與序列有關(guān)的異常導(dǎo)致的人為結(jié)果的可能性。
用二重復(fù)單元的報(bào)告序列重復(fù)上述方案(參見(jiàn)，例如，圖7A-7G)，以便將穩(wěn)定匹配雜交體的位置轉(zhuǎn)移到第三實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)。這種STR分析的再一次重復(fù)進(jìn)一步強(qiáng)化了該分析的穩(wěn)固性。
實(shí)施例3為了增加堿基堆積效果進(jìn)行的末端核苷酸的選擇和/或修飾堿基堆積依賴于單個(gè)堿基的環(huán)結(jié)構(gòu)與其最接近的堿基環(huán)之間的相互作用。該相互作用的強(qiáng)度依賴于憑經(jīng)驗(yàn)確定的相關(guān)環(huán)的類型。申請(qǐng)人不希望被任何理論所限，用于解釋該現(xiàn)象的可能理論是參與π鍵相互作用的兩個(gè)堿基之間存在數(shù)個(gè)電子，以及用于從螺旋內(nèi)部排除水的不同堿基組合的功效，由此增加熵，雖然上述模型與目前的數(shù)據(jù)一致，堆積相互作用的可能機(jī)制不限于這些概念。
還觀察到對(duì)參與堿基堆積相互作用的堿基進(jìn)行修飾可以加強(qiáng)二者之間的π鍵，或堆積。作為從上述模型中得出的一個(gè)可能的預(yù)測(cè)，這些修飾提供了更多的電子用于π鍵和/或增加環(huán)的表面積，從而增加了堆積堿基之間的疏水面積。
圖14論述了應(yīng)用于本發(fā)明的那些模型的一個(gè)實(shí)施例。用CSF1PO基因座進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)使用了一種A和Tastheterminal核苷酸，以提供可分辯的堿基堆積。參考文獻(xiàn)指出，A-T堿基堆積相互作用是所有核苷酸組合中最不穩(wěn)定的。因此，我們改變了捕獲寡聚物和報(bào)告寡聚物的設(shè)計(jì)，安排G和A末端核苷酸，因?yàn)閾?jù)報(bào)道它是更穩(wěn)定的構(gòu)型。用實(shí)施例中描述的方法進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，除了被檢查的基因座是CSF1PO。為了比較不同并列放置的相鄰末端核苷酸的堿基堆積貢獻(xiàn)，設(shè)計(jì)了另外一組CSF1PO捕獲序列和報(bào)告序列，以使末端核苷酸從T-A改變成為G-A。圖15比較了從既含有A-T又含有G-A末端核苷酸的錯(cuò)配雜交體中分辯匹配雜交體。結(jié)果表示為分辯率，即一致位點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度(MFI)除以不一致位點(diǎn)的平均MFI?？梢钥吹?，當(dāng)使用G-A末端核苷酸而不是T-A末端核苷酸，分辨率從約2.5增加到約25。這些數(shù)據(jù)證明本系統(tǒng)可以按照堿基堆積理論以及以前觀察預(yù)測(cè)的方式調(diào)控，由此強(qiáng)調(diào)本發(fā)明的機(jī)制在于依賴相鄰堿基之間的π鍵。
除了利用自然選擇的堿基堆積相互作用之外，還可以預(yù)測(cè)增加環(huán)中電子數(shù)目或增大疏水區(qū)的堿基修飾也能增加匹配雜交體從錯(cuò)配雜交體中的分辯。通過(guò)合成5’末端核苷酸含有與堿基環(huán)結(jié)合的丙炔基的TH01報(bào)告寡聚物，驗(yàn)證上述預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)該修飾將通過(guò)上述任何一種增加的電子疏水性模型增加堿基堆積。圖15顯示在具有丙炔基修飾的末端堿基或沒(méi)有丙炔基修飾的末端堿基的TH01報(bào)告序列的直接比較中，匹配/錯(cuò)配的結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)用TH01基因座按照實(shí)施例所述的方式進(jìn)行。同樣數(shù)據(jù)用分辨率表示。在4個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，觀察到含有丙炔基修飾報(bào)告序列的復(fù)合物中穩(wěn)定性增強(qiáng)。分辨率的平均增加值為95％。結(jié)果再次表明，本系統(tǒng)可以按照可預(yù)測(cè)的方式控制。可以通過(guò)添加其它類似物例如甲基或膽固醇基進(jìn)一步運(yùn)用這一概念。添加這些類型的修飾的方法是已知的(例如，Gryaznov)。
可以通過(guò)將修飾分子連接到一起，使這些修飾進(jìn)一步穩(wěn)定報(bào)告序列與一致位點(diǎn)的結(jié)合。Gryazov指示了這樣一個(gè)實(shí)例，兩個(gè)末端核酸均應(yīng)用膽固醇，然后附加膽固醇結(jié)合分子，例如低密度脂蛋白(LDL)。這將在有目標(biāo)物、膽固醇修飾的捕獲序列、膽固醇修飾的報(bào)告序列和LDL組成的一致位點(diǎn)的復(fù)合物中發(fā)生。
實(shí)施例4TPOX等位基因的雜交檢測(cè)
TPOX基因座在人甲狀腺過(guò)氧化酶基因的非編碼區(qū)中含有六到十三拷貝數(shù)的四核苷酸重復(fù)序列(AATG)(參見(jiàn)，例如，Anbach等，1996，法醫(yī)血液遺傳學(xué)進(jìn)展(Advanced in Forensic Haemogenetics)。該基因座也是法醫(yī)領(lǐng)域用于DNA指紋分析中被普遍使用和接受的基因座之一。序列在圖17中提供。
圖16描述了用基本上與實(shí)施例1描述的相同的方法分析含有TPOX 8和11等位基因的目標(biāo)DNA的實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)。將含有所有可能等位基因的捕獲寡聚物電子定位到芯片的個(gè)體位點(diǎn)上。然后使由具有8和11 STR的TPOX等位基因組成的互補(bǔ)目標(biāo)DNA混合物電子雜交到各含有被定位的捕獲DNA的襯墊上。電子雜交的條件與實(shí)施例1中描述的條件相同。然后使一重復(fù)單元的報(bào)告寡聚物被動(dòng)雜交到陣列上，并用TH01實(shí)施例的方式處理。圖16顯示了一種在含有7和10個(gè)重復(fù)單元的捕獲寡聚物的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上的穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。因?yàn)閳?bào)告寡聚物具有一個(gè)重復(fù)單元，可以鑒定目標(biāo)DNA具有8和11個(gè)重復(fù)單元。
結(jié)果表明可以將TPOX 8和11 STR DNA的混合物從所有錯(cuò)配體中準(zhǔn)確無(wú)誤地分辯出來(lái)。另外，所有其它被分析的純合和雜合TPOX組合形成同等分辨。
實(shí)施例5CSF1PO等位基因的雜交分辯含有CSF1PO等位基因7-15(圖19)(包含)的捕獲寡聚物被電子定位到前面描述的代表位點(diǎn)。然后使含有CSF1PO 11和12等位基因(圖19)的目標(biāo)DNA電子雜交到各位點(diǎn)上。然后雜交CSF1PO的一重復(fù)單元報(bào)告序列(圖1)。在30℃下使報(bào)告序列變性。圖18顯示了分析之后各捕獲位點(diǎn)的平均像素強(qiáng)度，證明了準(zhǔn)確分辯目標(biāo)物樣品中存在的等位基因的分析能力。實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例1中的描述進(jìn)行。實(shí)施例6THO1/TPOX多重分析將基因座-等位基因特異性捕獲寡聚物個(gè)體定位到一個(gè)芯片的不同位點(diǎn)上。然后使含有捕獲寡聚物的DNA芯片與含有雜合等位基因的THO1和TPOX目標(biāo)DNA混合物雜交。然后沖洗芯片，并通過(guò)前面描述的雜交分析形式分析。上述步驟按照實(shí)施例1的描述進(jìn)行。用相對(duì)熒光水平確定位點(diǎn)是否含有一致或不一致DNA雜交復(fù)合物。使用的兩種報(bào)告序列均含有一個(gè)重復(fù)單元。
圖20的結(jié)果顯示，在分析條件下，THO1的7和9STR等位基因與它們的識(shí)別捕獲位點(diǎn)雜交良好。與其它捕獲等位基因的雜交沒(méi)有檢測(cè)到(5×、7×、9×和10×)，表明THO1 7/9雜合子被良好分辯。對(duì)于TPOX基因座，我們也得到了一種良好匹配的捕獲物/目標(biāo)物相互作用(位點(diǎn)9×和11×)。另外，用10和12STR目標(biāo)物形成的不一致雜交復(fù)合物的穩(wěn)定性非常低，以至復(fù)合物不能被檢測(cè)到(7×c和12×c)，或者低到足以產(chǎn)生15倍或更高的分辨率(分別為10×c和8×c)，使TPOX10/12雜合目標(biāo)物輕易分辯。實(shí)施例7雙鏈PCR-擴(kuò)增的DNA中STR等位基因的鑒定進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)用于確定本發(fā)明用于詢問(wèn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的雙鏈DNA中的效用。圖6提供了用我們的系統(tǒng)準(zhǔn)確鑒定PCR產(chǎn)生的目標(biāo)物的能力的實(shí)施例。
按照Promega STR用戶手冊(cè)(3)中描述的標(biāo)準(zhǔn)條件，用來(lái)自K562細(xì)胞系的基因組模版PCR擴(kuò)增TPOX1基因座。K562的基因型是8和9重復(fù)等位基因的雜合子。擴(kuò)增后，擴(kuò)增子在95℃變性，并雜交到Nanogen APEX芯片上。如前面所述，芯片含有特異于PCR產(chǎn)物的捕獲探針，所述PCR產(chǎn)物含有不同數(shù)目的重復(fù)序列長(zhǎng)度。
本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)方面與實(shí)施例1和4中描述的方法相同，除了使用雙鏈、PCR擴(kuò)增的DNA作為目標(biāo)物。
圖21顯示了實(shí)驗(yàn)完成后，正(8C，9C匹配)和負(fù)(7C，10C錯(cuò)配)位點(diǎn)上出現(xiàn)的信號(hào)的相對(duì)量。如實(shí)施例4中能夠看到的，可獲得的分辯水平的范圍從20倍至無(wú)窮大。用來(lái)自K562對(duì)照DNA和從不知名供體中分離出來(lái)的基因組DNA的CSF1和TH01已經(jīng)得到相似的結(jié)果。這些結(jié)果表明本發(fā)明一般可應(yīng)用與所有雙鏈DNA，無(wú)論是通過(guò)PCR還是其它技術(shù)擴(kuò)增的，并含有分析未擴(kuò)增DNA的潛力。
實(shí)施例8微變異體檢測(cè)在以前所列的實(shí)施例中，通過(guò)直接對(duì)報(bào)告序列或報(bào)告序列/目標(biāo)DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。一個(gè)實(shí)施方式是熒光擾動(dòng)，其中淬滅劑和報(bào)告發(fā)色團(tuán)彼此相鄰排列，以至于熒光被淬滅。參見(jiàn)，例如，(應(yīng)用電控制雜交的雜交分析方法和用于分析和合成用電子擾動(dòng)催化劑的電子熒光擾動(dòng)法)，全部被參考插入本發(fā)明，如同在本發(fā)明中完全描述一樣。
寡聚物合成和結(jié)合的方法和材料屬于常規(guī)技術(shù)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，捕獲探針的一個(gè)末端含有一個(gè)結(jié)合基團(tuán)，例如生物素，在其遠(yuǎn)末端或伸入STR區(qū)的末端有一個(gè)發(fā)色團(tuán)。DNA合成過(guò)程中，連接手臂或間隔區(qū)將會(huì)插入內(nèi)部的適當(dāng)位置或末端。這些連接手臂具有功能集團(tuán)，以后發(fā)色團(tuán)將與之結(jié)合，例如氨基連接手臂和琥珀酰亞胺酯發(fā)色團(tuán)。報(bào)告探針在其伸入STR區(qū)的末端也含有以同樣方式插入的不同發(fā)色團(tuán)。因此，當(dāng)存在目標(biāo)物時(shí)，捕獲探針和報(bào)告探針將會(huì)雜交，并使發(fā)色團(tuán)彼此處于最接近的位置。發(fā)色團(tuán)之間的距離將由間隔區(qū)的長(zhǎng)度確定，在那里發(fā)色團(tuán)經(jīng)堿基、骨架、或糖連接到DNA上。
實(shí)施例9捕獲物和報(bào)告物的目標(biāo)物-依賴性連接本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例將通過(guò)將報(bào)告物連接到預(yù)先結(jié)合的捕獲物上進(jìn)一步穩(wěn)定報(bào)告物與一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的結(jié)合。這將在捕獲物和報(bào)告物之間形成一個(gè)共價(jià)鍵，同時(shí)捕獲物通過(guò)生物素-抗生物素蛋白鏈菌素相互作用力固定在位點(diǎn)上。該實(shí)施例的關(guān)鍵部分是以可選擇的方式完成連接，維持匹配雜交體從錯(cuò)配雜交體中分辯出來(lái)的能力。這將通過(guò)電子或常規(guī)方法，仔細(xì)控制雜交嚴(yán)緊度實(shí)現(xiàn)。
可以通過(guò)酶法(Maniatis等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室指南，1982)或化學(xué)法實(shí)現(xiàn)連接(Gryaznov，核酸研究，1994)。可以通過(guò)具體類型的反應(yīng)涉及的動(dòng)力學(xué)以及使某一特定方法參與形成一種產(chǎn)品的總功效來(lái)選擇方法。
實(shí)施例10從錯(cuò)配/缺口和錯(cuò)配/重疊中分辯匹配本系統(tǒng)不僅能夠從錯(cuò)配雜交體中分辯出匹配雜交體，而且能夠分辯兩種類型的錯(cuò)配，缺口和重疊，這種能力增加了本方法的應(yīng)用。圖22A、22B和22C顯示了缺口、匹配和重疊條件(從左至右的棒狀圖)的熒光密度圖，初始信號(hào)(圖22A)，變性三分鐘后(圖22B)和變性十分鐘后(圖22C)。本技術(shù)的這種特性提供了有關(guān)目標(biāo)DNA的其它信息，即有關(guān)所有可能的三種類型雜交體的信息。這些附加信息能夠以以下幾種方式應(yīng)用。
首先，利用該特性可能減少準(zhǔn)確鑒定目標(biāo)DNA所需的襯墊數(shù)目。圖23顯示了應(yīng)用TH01基因座中該特性的潛力。預(yù)測(cè)可以用一組具有五個(gè)、七個(gè)和九個(gè)重復(fù)單元的捕獲寡聚物與具有一個(gè)重復(fù)單元的報(bào)告TH01基因座組合實(shí)現(xiàn)所有TH01等位基因的準(zhǔn)確鑒定。這使所需的分析實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的數(shù)目從七個(gè)減少到三個(gè)。當(dāng)該特性與進(jìn)行豐余報(bào)告的能力結(jié)合時(shí)，能夠顯著減少用于統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性基因分型的一系列基因座分析所需的襯墊數(shù)目。目前該水平約為10個(gè)基因座。它的優(yōu)異效果將使一個(gè)芯片上容納更多基因座，因此形成更大的陣列，在同一個(gè)芯片上分析多個(gè)體的能力將降低分析成本。這對(duì)于高通量處理尤其有用，目前進(jìn)行中的建立重罪犯的STR數(shù)據(jù)庫(kù)同樣需要。
即使分析STR等位基因所需的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的數(shù)目沒(méi)有減少，分辯缺口錯(cuò)配和重疊錯(cuò)配中得到的附加信息也將有助于準(zhǔn)確分析。任何附加信息都可以組合到最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析中，以提供一種盡可能高度準(zhǔn)確的答案。
實(shí)施例11通過(guò)環(huán)出分析確定目標(biāo)DNA的STR等位基因的特性在另一個(gè)通過(guò)雜交來(lái)分辯STR等位基因的實(shí)施例中，我們已經(jīng)證明可以使用不同的寡核苷酸系統(tǒng)。這種被稱為環(huán)出系統(tǒng)的方法在圖9A和9B以及圖10A-10G中描述。從圖中顯見(jiàn)，它是一種鑒定矩陣中等位基因的夾層法的替換方法。環(huán)出系統(tǒng)應(yīng)用捕獲寡聚物的陣列，其中捕獲寡聚物以與夾層分析模式類似的方式分布。捕獲寡聚物的結(jié)構(gòu)與夾層模式中的結(jié)構(gòu)不同之處在于存在重復(fù)區(qū)兩個(gè)末端旁側(cè)的基因座-特異性獨(dú)特序列。目標(biāo)DNA還被標(biāo)記，用左報(bào)告分析?？梢栽跀U(kuò)增過(guò)程中應(yīng)用熒光(或含有任何其它適當(dāng)?shù)挠糜跈z測(cè)的分子修飾)PCR引物標(biāo)記目標(biāo)物。
實(shí)踐中，特異于基因座的不同等位基因的環(huán)出捕獲寡聚物以矩陣排列，以使個(gè)體實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)代表不同等位基因(參見(jiàn)，例如，圖6)。實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖24所示。然后在電子條件下使標(biāo)記的目標(biāo)寡聚物與完整陣列嚴(yán)緊雜交。含有最穩(wěn)定雜交體的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)與目標(biāo)DNA的等位基因特性一致。確定桅頂雜交體的位置(因此等位基因-特異性捕獲寡聚物與它結(jié)合)鑒定目標(biāo)DNA中代表的等位基因。捕獲寡聚物和報(bào)告寡聚物之間形成的重復(fù)單元數(shù)目相同的雜交體是匹配的。還可以說(shuō)該實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)與目標(biāo)等位基因的特性一致。不一致或捕獲序列和目標(biāo)物之間等位基因數(shù)目不相等的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)將在目標(biāo)或捕獲DNA中形成一種具有環(huán)的雜交(參見(jiàn)，例如，10A、10B和10D-10G)。捕獲物比目標(biāo)物重復(fù)單元少的不一致位點(diǎn)將產(chǎn)生有環(huán)的雜交體。這些雜交體本質(zhì)上比匹配雜交體穩(wěn)定性低。因此電子嚴(yán)緊控制下的變性將從低穩(wěn)定性雜交體中分辯出表明一致位點(diǎn)的穩(wěn)定雜交體，基于那些位點(diǎn)上存在的探針的知識(shí)，使用戶能夠確定目標(biāo)DNA中重復(fù)單元的數(shù)目。實(shí)施例12微變異等位基因TH019.3的檢測(cè)隨著STR應(yīng)用越來(lái)越廣泛，越來(lái)越經(jīng)常地發(fā)現(xiàn)重復(fù)區(qū)內(nèi)存在偏差。這給常規(guī)尺寸分段分離法帶來(lái)麻煩，因?yàn)榉洲q的余地從四個(gè)堿基降低到一個(gè)堿基。在插入或缺失突變情況下存在同樣問(wèn)題。對(duì)于轉(zhuǎn)化或顛換突變，等位基因的大小沒(méi)有改變，然而序列發(fā)生了改變。
對(duì)于這兩種類型的突變，插入/缺失和轉(zhuǎn)換/顛換，都能夠用我們的技術(shù)不困難地檢測(cè)。這主要由于這樣的事實(shí)，即Nanogen’s研究是基于分析而不是大小分段法的雜交。因此末端核苷酸堿基堆積與單核苷酸多態(tài)性的組合提供了有利的分辯工具。
一種眾所周知的STR微變異體是TH01 9.3等位基因。它十分重要因?yàn)樗诖蟛糠指呒铀魅巳褐写嬖凇?.3微變異體的分析基本上與正常STR等位基因的分析相同，但是需要設(shè)計(jì)特別的捕獲和報(bào)告寡聚物。捕獲寡聚物僅含三個(gè)重復(fù)單元(3ru，圖13)。這是因?yàn)槟繕?biāo)鏈上重復(fù)單元6和3之間存在單堿基缺失。與捕獲物結(jié)合的TH01 9.3目標(biāo)DNA在含有超過(guò)三個(gè)重復(fù)單元的捕獲位點(diǎn)上穩(wěn)定性降低，因?yàn)樵?.3的重復(fù)區(qū)中存在一個(gè)移碼。已經(jīng)設(shè)計(jì)了報(bào)告寡聚物(微變異體9.3，圖13)，從而它將與含有缺失的重復(fù)單元區(qū)最穩(wěn)定地結(jié)合。另外，設(shè)計(jì)了捕獲寡聚物，從而僅在3ru實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)發(fā)生目標(biāo)物指引的捕獲DNA和報(bào)告DNA的堿基堆積。圖25顯示了用于檢測(cè)TH01 9.3微變異體的捕獲和報(bào)告寡核苷酸的詳細(xì)序列排列。圖中的編號(hào)與圖4C中的編號(hào)一致，另外附加了互補(bǔ)于構(gòu)成微變異體的部分重復(fù)單元的序列45。這種特殊的微變異體報(bào)告物沒(méi)有第二獨(dú)特旁側(cè)序列42。這對(duì)分析TH01 9.3等位基因是必要的，但不是其它微變異體-特異性報(bào)告物的特征。從該圖中顯見(jiàn)，在與TH01 9.3等位基因一致的雜交復(fù)合物中，存在目標(biāo)DNA和報(bào)告DNA之間的序列互補(bǔ)性，以及捕獲寡聚物和報(bào)告寡聚物之間的堿基堆積。圖26顯示了來(lái)自TH01等位基因的個(gè)體純合子的PCR擴(kuò)增DNA的分析結(jié)果。
雖然為了清楚和便于理解，通過(guò)圖解說(shuō)明和實(shí)施例的方式詳細(xì)描述了上述發(fā)明，然而本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員按照本發(fā)明的指教可以進(jìn)行某些改變和調(diào)整而不偏離本發(fā)明所附權(quán)利要求的實(shí)質(zhì)和范圍，這是顯而易見(jiàn)的。
權(quán)利要求
1．一種用于確定遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法，包括以下步驟在多個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上排列多個(gè)雜交復(fù)合物分析，其中雜交復(fù)合物分析包括至少一種含有重復(fù)DNA序列的核酸目標(biāo)物，一種具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列和互補(bǔ)于目標(biāo)序列的n個(gè)重復(fù)單元的捕獲探針，其中n≥0，和一種具有互補(bǔ)于同一目標(biāo)序列鏈的選擇序列的報(bào)告探針，該報(bào)告探針包括選自下組的特征a)其中報(bào)告探針的選擇序列包括第二獨(dú)特旁側(cè)序列，b)其中報(bào)告探針的選擇序列包括互補(bǔ)于目標(biāo)序列微變異區(qū)的序列，和c)其中報(bào)告探針的選擇序列包括一種互補(bǔ)于目標(biāo)序列微變異區(qū)的第二獨(dú)特旁側(cè)序列，其中捕獲探針加報(bào)告探針中重復(fù)單元的總數(shù)大于零，捕獲探針的序列在至少兩個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上不同，至少部分通過(guò)確定雜交穩(wěn)定性，來(lái)確定實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上雜交復(fù)合物分析中的一致和不一致，和基于一致位點(diǎn)的確認(rèn)，以及定位在該位點(diǎn)上雜交復(fù)合物中的探針的知識(shí)，確定目標(biāo)序列中重復(fù)單元的性質(zhì)。
2．權(quán)利要求1的方法，其中，基于定位在該實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的探針的知識(shí)，通過(guò)目標(biāo)物中存在的重復(fù)單元的數(shù)目，一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的位置體現(xiàn)目標(biāo)序列重復(fù)單元的性質(zhì)。
3．權(quán)利要求2的方法，其中在一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上，目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目等于捕獲探針中重復(fù)單元的數(shù)目和報(bào)告探針中重復(fù)單元數(shù)目的總和。
4．權(quán)利要求1的方法，其中一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的位置通過(guò)目標(biāo)序列中微變異體的檢測(cè)體現(xiàn)目標(biāo)序列重復(fù)單元的性質(zhì)。
5．權(quán)利要求4的方法，其中微變異體包括一種或多種選自下組的突變?nèi)笔А⒉迦?、轉(zhuǎn)換和顛換。
6．權(quán)利要求5的方法，其中微變異體影響單個(gè)堿基。
7．權(quán)利要求5的方法，其中微變異體影響一個(gè)以上堿基。
8．權(quán)利要求1的方法，其中一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的位置通過(guò)重復(fù)單元的數(shù)目以及通過(guò)目標(biāo)序列中微變異體的檢測(cè)體現(xiàn)目標(biāo)序列重復(fù)單元的性質(zhì)。
9．權(quán)利要求8的方法，其中微變異體包括一種或多種選自下組的突變?nèi)笔?、插入、轉(zhuǎn)換和顛換。
10．權(quán)利要求9的方法，其中微變異體影響單個(gè)堿基。
11．權(quán)利要求9的方法，其中微變異體影響一個(gè)以上堿基。
12．權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)于相同基因座，當(dāng)出現(xiàn)在一個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上的雜交復(fù)合物相對(duì)于其它實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上的雜交復(fù)合物更穩(wěn)定時(shí)，認(rèn)為該實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)是一致的。
13．權(quán)利要求12的方法，其中在包括捕獲物、報(bào)告物和目標(biāo)物的雜交復(fù)合物中由于堿基互補(bǔ)配對(duì)增強(qiáng)了穩(wěn)定性。
14．權(quán)利要求12的方法，其中通過(guò)使報(bào)告物和捕獲物的并列末端核苷酸相鄰，形成堿基堆積，來(lái)增強(qiáng)穩(wěn)定性。
15．權(quán)利要求14的方法，進(jìn)一步包括選擇并列的末端核苷酸增加一致和不一致之間的能量差異。
16．權(quán)利要求15的方法，其中選擇至少部分與堿基堆積相關(guān)。
17．權(quán)利要求16的方法，其中堆積的堿基對(duì)是5’GpC3’。
18．權(quán)利要求16的方法，其中堆積的堿基對(duì)是5’TpA3’。
19．權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括促進(jìn)堿基堆積的末端核苷酸修飾。
20．權(quán)利要求19的方法，其中末端核苷酸用丙炔基修飾。
21．權(quán)利要求19的方法，其中末端核苷酸用甲基修飾。
22．權(quán)利要求19的方法，其中末端核苷酸用膽固醇基修飾。
23．權(quán)利要求12的方法，其中用連接技術(shù)增強(qiáng)穩(wěn)定性。
24．權(quán)利要求23的方法，其中連接是酶連接。
25．權(quán)利要求23的方法，其中連接是化學(xué)連接。
26．權(quán)利要求1的方法，其中不一致包括捕獲物和報(bào)告物之間存在一個(gè)缺口。
27．權(quán)利要求1的方法，其中不一致包括捕獲物和報(bào)告物之間存在一個(gè)重疊。
28．權(quán)利要求1的方法，其中不一致包括重復(fù)區(qū)中的堿基變異。
29．權(quán)利要求28的方法，其中堿基變異包括缺失。
30．權(quán)利要求28的方法，其中堿基變異包括插入。
31．權(quán)利要求28的方法，其中堿基變異包括轉(zhuǎn)換。
32．權(quán)利要求28的方法，其中堿基變異包括顛換。
33．權(quán)利要求1的方法，其中不一致包括捕獲物和報(bào)告物之間或重復(fù)區(qū)中存在一個(gè)單核苷酸變異。
34．權(quán)利要求1的方法，其中不一致包括捕獲物和報(bào)告物之間或重復(fù)區(qū)中存在一個(gè)以上單核苷酸的堿基變異體。
35．權(quán)利要求1的方法，其中不一致包括堿基變異加捕獲物和報(bào)告物之間或重復(fù)區(qū)中的重疊。
36．權(quán)利要求1的方法，其中不一致包括堿基變異加捕獲物和報(bào)告物之間或重復(fù)區(qū)中的缺口。
37．權(quán)利要求1的方法，其中重復(fù)單元中的堿基數(shù)目為2-50。
38．權(quán)利要求37的方法，其中重復(fù)單元中的堿基數(shù)目為3-6。
39．權(quán)利要求1的方法，其中包括微變異體的重復(fù)單元的數(shù)目為5-50。
40．權(quán)利要求1的方法，其中包括微變異體的重復(fù)單元的數(shù)目為2-2500。
41．權(quán)利要求1的方法，其中某一時(shí)刻被分析的基因座的數(shù)目為一。
42．權(quán)利要求1的方法，其中某一時(shí)刻被分析的基因座的數(shù)目為二。
43．權(quán)利要求1的方法，其中某一時(shí)刻被分析的基因座的數(shù)目少于五。
44．權(quán)利要求1的方法，其中某一時(shí)刻被分析的基因座的數(shù)目少于十。
45．權(quán)利要求1的方法，其中某一時(shí)刻被分析的基因座的數(shù)目少于十三。
46．權(quán)利要求1的方法，其中某一時(shí)刻被分析的基因座的數(shù)目少于二十。
47．權(quán)利要求1的方法，其中某一時(shí)刻被分析的基因座的數(shù)目少于一百。
48．權(quán)利要求1的方法，其中雜交穩(wěn)定性至少部分通過(guò)電子嚴(yán)緊度控制(ESC)確定。
49．權(quán)利要求1的方法，其中雜交穩(wěn)定性至少部分通過(guò)熱調(diào)控嚴(yán)緊度確定。
50．權(quán)利要求1的方法，其中雜交穩(wěn)定性至少部分通過(guò)化學(xué)調(diào)控嚴(yán)緊度確定。
51．權(quán)利要求1的方法，其中雜交穩(wěn)定性至少部分通過(guò)電子嚴(yán)緊度控制(ESC)和熱控制確定。
52．權(quán)利要求1的方法，其中雜交穩(wěn)定性至少部分通過(guò)電子嚴(yán)緊度控制(ESC)和化學(xué)控制確定。
53．權(quán)利要求1的方法，其中雜交穩(wěn)定性至少部分通過(guò)電子嚴(yán)緊度(ESC)、熱和化學(xué)控制確定。
54．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括捕獲探針與目標(biāo)核酸雜交過(guò)程中的電子嚴(yán)緊條件。
55．權(quán)利要求54的方法，由此獨(dú)特旁側(cè)序列以適當(dāng)指數(shù)與目標(biāo)物雜交。
56．權(quán)利要求54的方法，由此電子嚴(yán)緊條件保證了重復(fù)單元的適當(dāng)指標(biāo)化。
57．權(quán)利要求54的方法，由此電子嚴(yán)緊條件限制了重復(fù)單元的滑移。
58．權(quán)利要求54的方法，其中初始雜交步驟發(fā)生在10分鐘內(nèi)或更短時(shí)間內(nèi)。
59．權(quán)利要求58的方法，其中初始雜交步驟發(fā)生在5分鐘或更短時(shí)間內(nèi)。
60．權(quán)利要求54的方法，其中初始雜交步驟發(fā)生在1分鐘或更短時(shí)間內(nèi)。
61．權(quán)利要求54的方法，其中電子嚴(yán)緊控制包括電流和緩沖液。
62．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括捕獲探針與核酸目標(biāo)物雜交過(guò)程中的嚴(yán)緊條件。
63．權(quán)利要求62的方法，其中嚴(yán)緊條件包括嚴(yán)緊度的熱調(diào)控。
64．權(quán)利要求62的方法，嚴(yán)緊度調(diào)節(jié)包括嚴(yán)緊度的熱和電子調(diào)控。
65．權(quán)利要求62的方法，嚴(yán)緊度調(diào)節(jié)包括嚴(yán)緊度的化學(xué)調(diào)控。
66．權(quán)利要求62的方法，其中嚴(yán)緊度條件包括嚴(yán)緊度的化學(xué)和電子調(diào)控。
67．權(quán)利要求62的方法，其中嚴(yán)緊度條件包括嚴(yán)緊度的化學(xué)、熱和電子調(diào)控。
68．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括報(bào)告探針與捕獲探針核酸目標(biāo)物雜交復(fù)合物雜交過(guò)程中的電子嚴(yán)緊度條件。
69．權(quán)利要求68的方法，由此獨(dú)特旁側(cè)序列以適當(dāng)索引與目標(biāo)物雜交。
70．權(quán)利要求1的方法，電子嚴(yán)緊條件由此保證了重復(fù)單元的適當(dāng)指標(biāo)化。
71．權(quán)利要求1的方法，電子嚴(yán)緊條件由此限制重復(fù)單元的滑移。
72．權(quán)利要求68的方法，其中初始雜交步驟發(fā)生在10分鐘或更短時(shí)間內(nèi)。
73．權(quán)利要求68的方法，其中初始雜交步驟發(fā)生在5分鐘或更短時(shí)間內(nèi)。
74．權(quán)利要求68的方法，其中初始雜交步驟發(fā)生在1分鐘或更短時(shí)間內(nèi)。
75．權(quán)利要求68的方法，其中電子嚴(yán)緊條件包括電流和緩沖液。
76．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括報(bào)告探針與捕獲探針核酸目標(biāo)物雜交復(fù)合物雜交過(guò)程中的嚴(yán)緊條件。
77．權(quán)利要求76的方法，其中嚴(yán)緊條件包括嚴(yán)緊度的熱調(diào)控。
78．權(quán)利要求76的方法，嚴(yán)緊度調(diào)節(jié)包括嚴(yán)緊度的熱和電子調(diào)控。
79．權(quán)利要求76的方法，嚴(yán)緊度調(diào)節(jié)包括嚴(yán)緊度的化學(xué)調(diào)控。
80．權(quán)利要求76的方法，其中嚴(yán)緊度條件包括嚴(yán)緊度的化學(xué)和電子調(diào)控。
81．權(quán)利要求76的方法，其中嚴(yán)緊度條件包括嚴(yán)緊度的化學(xué)、熱和電子調(diào)控。
82．權(quán)利要求1的方法，其中雜交復(fù)合物是標(biāo)記的。
83．權(quán)利要求82的方法，其中確定一致和不一致的步驟包括檢測(cè)試驗(yàn)位點(diǎn)上標(biāo)記雜交復(fù)合物的量。
84．權(quán)利要求83的方法，其中檢測(cè)是成像檢測(cè)。
85．權(quán)利要求84的方法，其中成像是光學(xué)成像。
86．權(quán)利要求84的方法，其中成像是電子成像。
87．權(quán)利要求84的方法，其中成像是CCD成像。
88．權(quán)利要求84的方法，其中成像是集成光成像。
89．權(quán)利要求83的方法，其中成像檢測(cè)是定量的。
90．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括統(tǒng)計(jì)分析步驟。
91．權(quán)利要求82的方法，其中復(fù)合物的標(biāo)記部分是目標(biāo)物。
92．權(quán)利要求82的方法，其中復(fù)合物的標(biāo)記部分是捕獲物。
93．權(quán)利要求82的方法，其中復(fù)合物的標(biāo)記部分是報(bào)告物。
94．權(quán)利要求82的方法，其中標(biāo)記通過(guò)熒光標(biāo)記。
95．權(quán)利要求94的方法，其中熒光標(biāo)記用Bodipy Texas Red進(jìn)行。
96．權(quán)利要求94的方法，其中熒光標(biāo)記通過(guò)Bodipy 630/650進(jìn)行。
97．權(quán)利要求94的方法，其中熒光標(biāo)記通過(guò)Lucifer Yellow進(jìn)行。
98．權(quán)利要求82的方法，其中標(biāo)記通過(guò)比色標(biāo)記。
99．權(quán)利要求82的方法，其中標(biāo)記通過(guò)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。
100．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括雜交復(fù)合物分子之間的能量轉(zhuǎn)移。
101．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括熒光擾動(dòng)分析。
102．權(quán)利要求100的方法，其中能量轉(zhuǎn)移包括淬滅。
103．權(quán)利要求100的方法，其中能量轉(zhuǎn)移包括給體分子和受體分子之間的電子遷移，其通過(guò)雙鏈匹配雜交復(fù)合物促進(jìn)。
104．權(quán)利要求103的方法，其中通過(guò)電子經(jīng)雙鏈DNA遷移介導(dǎo)轉(zhuǎn)移。
105．權(quán)利要求100的方法，其中能量轉(zhuǎn)移包括雙鏈匹配雜交復(fù)合物促進(jìn)的電子遷移。
106．權(quán)利要求82的方法，其中標(biāo)記物是擴(kuò)增的。
107．權(quán)利要求106的方法，其中標(biāo)記物進(jìn)一步包括分支DNA。
108．權(quán)利要求1的方法，其中雜交復(fù)合物是未標(biāo)記的。
109．權(quán)利要求108的方法，其中一致檢測(cè)至少部分基于電子循雜交DNA的傳導(dǎo)。
110．權(quán)利要求108的方法，其中一致檢測(cè)至少部分基于質(zhì)量檢測(cè)。
111．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括豐余分析。
112．權(quán)利要求111的方法，其中豐余分析是一種連續(xù)豐余分析。
113．權(quán)利要求112的方法，其中連續(xù)豐余分析在至少確定了一致和不一致步驟之后，包括下列步驟增加變性嚴(yán)緊度，以除去所有位點(diǎn)，包括一致或不一致位點(diǎn)上的所述報(bào)告探針，雜交第二報(bào)告探針，其中所述第二報(bào)告探針中重復(fù)單元的數(shù)目與所述報(bào)告探針中重復(fù)單元的數(shù)目不同，其中一致試驗(yàn)位點(diǎn)的位置，基于定位在該位點(diǎn)上的探針的知識(shí)，指示目標(biāo)物中存在的重復(fù)單元的數(shù)目，其中在一致試驗(yàn)位點(diǎn)上，目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目等于捕獲探針中重復(fù)單元的數(shù)目和報(bào)告探針中重復(fù)單元數(shù)目之和，至少部分通過(guò)確定雜交穩(wěn)定性，確定試驗(yàn)位點(diǎn)上的雜交復(fù)合物分析中的一致和不一致試驗(yàn)位點(diǎn)，將這些結(jié)果與最初的復(fù)合物雜交分析比較，確證目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目。
114．權(quán)利要求111的方法，進(jìn)一步包括重復(fù)豐余分析的步驟，直到獲得有統(tǒng)計(jì)意義的結(jié)果。
115．權(quán)利要求111的方法，其中豐余分析包括多種排列。
116．權(quán)利要求115的方法，進(jìn)一步包括目標(biāo)物與至少兩組獨(dú)立分析物雜交的步驟，將所述報(bào)告物與第一組雜交，第二報(bào)告物與第二組雜交，其中所述報(bào)告探針中重復(fù)單元的數(shù)目與第二報(bào)告物中重復(fù)單元的數(shù)目不同，至少部分通過(guò)確定雜交穩(wěn)定性，來(lái)確定試驗(yàn)位點(diǎn)上的雜交復(fù)合物分析中的一致和不一致試驗(yàn)位點(diǎn)，其中一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的位置，基于定位在該實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上探針的知識(shí)，指示目標(biāo)物中存在的重復(fù)單元的數(shù)目，和將這些結(jié)果與所述兩個(gè)復(fù)合物雜交分析比較，確證目標(biāo)物中重復(fù)單元的數(shù)目。
117．權(quán)利要求116的方法，包括不同標(biāo)記的報(bào)告物的同步雜交步驟。
118．權(quán)利要求117的方法，其中核酸序列中重復(fù)單元數(shù)目不同的、區(qū)別標(biāo)記的兩個(gè)報(bào)告物包括之后被同時(shí)提供給本裝置的報(bào)告物。
119．權(quán)利要求117的方法，其中不同標(biāo)記的報(bào)告物，發(fā)色團(tuán)不同。
120．權(quán)利要求119的方法，其中發(fā)色團(tuán)是熒光發(fā)色團(tuán)。
121．權(quán)利要求119的方法，其中發(fā)色團(tuán)是發(fā)光發(fā)色團(tuán)。
122．權(quán)利要求119的方法，其中發(fā)色團(tuán)是電化學(xué)發(fā)光發(fā)色團(tuán)。
123．權(quán)利要求119的方法，其中發(fā)色團(tuán)包括熒光發(fā)色團(tuán)、發(fā)光發(fā)色和電化學(xué)發(fā)光發(fā)色團(tuán)的組合。
124．權(quán)利要求117的方法，其中一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的位置，基于定位在該位點(diǎn)的探針的知識(shí)，指示目標(biāo)物中存在的重復(fù)單元的數(shù)目。
125．權(quán)利要求117的方法，其中在第一實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上檢測(cè)到第一標(biāo)記物的存在，指示了該實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上報(bào)告序列和捕獲序列相關(guān)重復(fù)單元的已知數(shù)目，其被在第二實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上檢測(cè)到存在第二標(biāo)記物進(jìn)一步確證，在第二實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上檢測(cè)到存在第二標(biāo)記物指示該實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上報(bào)告序列和捕獲序列相關(guān)重復(fù)單元的已知數(shù)目。
126．權(quán)利要求115的方法，其中兩組排列在同一個(gè)裝置上。
127．權(quán)利要求115的方法，其中兩組排列在不同裝置上。
128．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)DNA是純化的。
129．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)物是未擴(kuò)增的。
130．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)物是擴(kuò)增的。
131．權(quán)利要求130的方法，其中擴(kuò)增是目標(biāo)DNA擴(kuò)增的指數(shù)法。
132．權(quán)利要求131的方法，其中擴(kuò)增包括PCR擴(kuò)增的DNA。
133．權(quán)利要求131的方法，其中擴(kuò)增包括鏈置換擴(kuò)增法(SDA)擴(kuò)增的DNA。
134．權(quán)利要求131的方法，其中擴(kuò)增包括DNA擴(kuò)增的線性法。
135．權(quán)利要求134的方法，其中擴(kuò)增包括滾環(huán)擴(kuò)增。
136．權(quán)利要求134的方法，其中擴(kuò)增包括轉(zhuǎn)錄失控?cái)U(kuò)增。
137．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)DNA是未純化的。
138．權(quán)利要求137的方法，其中目標(biāo)物是未擴(kuò)增的。
139．權(quán)利要求137的方法，其中目標(biāo)物是擴(kuò)增的。
140．權(quán)利要求139的方法，其中擴(kuò)增是目標(biāo)DNA擴(kuò)增的指數(shù)法。
141．權(quán)利要求140的方法，其中擴(kuò)增包括PCR擴(kuò)增的DNA。
142．權(quán)利要求140的方法，其中擴(kuò)增包括SDA擴(kuò)增的DNA。
143．權(quán)利要求139的方法，其中擴(kuò)增是DNA擴(kuò)增的線性法。
144．權(quán)利要求143的方法，其中擴(kuò)增包括滾環(huán)擴(kuò)增。
145．權(quán)利要求143的方法，其中擴(kuò)增包括失控?cái)U(kuò)增。
146．權(quán)利要求1的方法，其中排列在實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上的多個(gè)雜交復(fù)合物分析包括基因座的每個(gè)等位基因至少一個(gè)位點(diǎn)。
147．權(quán)利要求146的方法，其中等位基因包括一個(gè)完整數(shù)目的重復(fù)單元。
148．權(quán)利要求146的方法，其中等位基因包括一個(gè)完整數(shù)目的重復(fù)單元加至少一個(gè)微變異體。
149．權(quán)利要求1的方法，其中各一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)鑒定了目標(biāo)物的重復(fù)單元數(shù)目。
150．權(quán)利要求1的方法，其中所有不一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)鑒定了目標(biāo)物的重復(fù)單元數(shù)目。
151．權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)于均一樣品，每一基因座陣列的一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的數(shù)目在非豐余、多重陣列豐余、或連續(xù)豐余分析中為一或二。
152．權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)于混合樣品，一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的數(shù)目大于一。
153．權(quán)利要求117的方法，其中對(duì)于不同標(biāo)記報(bào)告物的同步雜交豐余分析，一致實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的數(shù)目大于一。
154．權(quán)利要求1的方法，其中雜交復(fù)合物的性質(zhì)可以分成匹配、錯(cuò)配/缺口、和錯(cuò)配/重疊。
155．權(quán)利要求154的方法，其中分辨率通過(guò)雜交復(fù)合物分析的信號(hào)強(qiáng)度確定。
156．權(quán)利要求155的方法，其中分辨率通過(guò)應(yīng)用選擇的電子、化學(xué)和熱嚴(yán)緊度條件的梯度確定，導(dǎo)致雜交復(fù)合物分析的信號(hào)強(qiáng)度的改變。
157．權(quán)利要求154的方法，其中分辨率通過(guò)雜交復(fù)合物分析中存在的探針的知識(shí)確定。
158．權(quán)利要求1的方法，其中實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)的數(shù)目少于每個(gè)等位基因提供一個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)。
159．權(quán)利要求1的方法，其中如此提供目標(biāo)物以至能夠減少鑒定目標(biāo)DNA中重復(fù)單元數(shù)目必須的實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)。
160．權(quán)利要求159的方法，其中所述減少增加了結(jié)果的統(tǒng)計(jì)意義。
161．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)材料由一個(gè)基因座的純合等位基因組成。
162．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)材料由一個(gè)基因座的雜合等位基因組成。
163．權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)于一種混合樣品，目標(biāo)材料由每一基因座超過(guò)一個(gè)等位基因組成。
164．權(quán)利要求163的方法，其中混合樣品進(jìn)一步包括來(lái)自一個(gè)以上個(gè)體的樣品。
165．權(quán)利要求164的方法，其中混合樣品進(jìn)一步包括與正常組織混合的腫瘤組織。
166．權(quán)利要求165的方法，其中腫瘤組織是正常組織。
167．權(quán)利要求165的方法，其中腫瘤組織是疾病組織。
168．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)材料包括腫瘤組織。
169．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)材料包括植物材料。
170．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)材料包括動(dòng)物材料。
171．權(quán)利要求170的方法，其中動(dòng)物材料是哺乳動(dòng)物材料。
172．權(quán)利要求170的方法，其中動(dòng)物材料是人的材料。
173．權(quán)利要求170的方法，其中目標(biāo)材料包括鳥(niǎo)的材料。
174．權(quán)利要求170的方法，其中目標(biāo)材料包括魚(yú)的材料。
175．權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)材料由微生物材料構(gòu)成。
176．權(quán)利要求175的方法，其中微生物材料是病毒。
177．權(quán)利要求175的方法，其中微生物材料是細(xì)菌。
178．權(quán)利要求75的方法，其中微生物材料是原生動(dòng)物。
179．權(quán)利要求1的方法，其中該方法應(yīng)用于鑒定。
180．權(quán)利要求1的方法，其中該方法應(yīng)用于親子鑒定。
181．權(quán)利要求1的方法，其中該方法應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)。
182．權(quán)利要求1的方法，其中該方法應(yīng)用于疾病診斷。
183．權(quán)利要求1的方法，其中該方法應(yīng)用于育種。
184．權(quán)利要求164的方法，其中混合樣品進(jìn)一步包括來(lái)自包括單克隆和多克隆細(xì)胞源的個(gè)體的樣品。
185．權(quán)利要求106的方法，其中標(biāo)記物通過(guò)酶標(biāo)記擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增。
186．一種適應(yīng)權(quán)利要求1方法實(shí)施的活動(dòng)、可編程、電子生物診斷設(shè)備。
187．一種應(yīng)用電子技術(shù)確定遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法，包括以下步驟在多個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上排列多個(gè)雜交復(fù)合物分析，其中雜交復(fù)合物分析包括至少一個(gè)含有重復(fù)DNA序列的核酸目標(biāo)物，具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列和n個(gè)重復(fù)單元的捕獲探針，其中n≥0，并且互補(bǔ)于目標(biāo)序列，和具有一個(gè)互補(bǔ)于同一目標(biāo)序列鏈的選擇序列的報(bào)告探針，報(bào)告物包括選自下組的屬性a)其中報(bào)告物的選擇序列包括一個(gè)第二獨(dú)特旁側(cè)序列和n個(gè)重復(fù)單元，其中n≥0，b)其中報(bào)告物的選擇序列包括互補(bǔ)于目標(biāo)序列微變異體區(qū)的序列，c)其中報(bào)告物的選擇序列包括一個(gè)第二獨(dú)特旁側(cè)序列和n個(gè)重復(fù)單元，其中n≥0，并且序列互補(bǔ)于目標(biāo)序列的微變異體區(qū)。其中捕獲物加報(bào)告物中重復(fù)單元的總和大于零，捕獲探針的序列在至少兩個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上不同，至少部分通過(guò)確定雜交穩(wěn)定性，確定試驗(yàn)位點(diǎn)上雜交復(fù)合物分析中的一致和不一致，基于一致位點(diǎn)的確認(rèn)，并進(jìn)一步基于定位在該位點(diǎn)上的雜交復(fù)合物中的探針的知識(shí)，確定目標(biāo)序列中重復(fù)單元的性質(zhì)。
188．一種確定遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法，包括以下步驟提供一種鑒定遺傳目標(biāo)物的平臺(tái)，其包括一組具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列、數(shù)目可變的插入重復(fù)單元和第二獨(dú)特旁側(cè)序列的探針，使遺傳目標(biāo)物與探針雜交，包括雜交過(guò)程中的電子雜交嚴(yán)緊度條件，通過(guò)該條件獨(dú)特旁側(cè)序列連同目標(biāo)物被適當(dāng)標(biāo)引，和至少部分通過(guò)確定電子雜交穩(wěn)定性確定實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上的一致和不一致，由此在不一致雜交中形成一種環(huán)出，因此提供了一種比一致雜交中能量較為不利的條件。
189．一種確定遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法，包括以下步驟提供一種鑒定遺傳目標(biāo)物的平臺(tái)，包括一組具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列、數(shù)目可變的插入重復(fù)單元和第二獨(dú)特旁側(cè)序列的探針，使遺傳目標(biāo)物與探針雜交，包括雜交過(guò)程中的電子雜交嚴(yán)緊度條件，通過(guò)該條件獨(dú)特旁側(cè)序列連同目標(biāo)物被適當(dāng)標(biāo)引，和確定該實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上的一致和不一致，由此在不一致雜交中形成一種環(huán)出，其提供比一致雜交中能量較為不利的條件。
190．一種確定遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法，包括以下步驟提供一種鑒定遺傳目標(biāo)物的平臺(tái)，包括一組具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列、數(shù)目可變的插入重復(fù)單元和第二獨(dú)特旁側(cè)序列的探針，使遺傳目標(biāo)物與探針雜交，和至少部分通過(guò)確定電子雜交穩(wěn)定性，確定實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上的一致和不一致，由此在不一致雜交中形成一種環(huán)出，其提供比一致雜交中能量較為不利的條件。
191．一種確定遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法，包括以下步驟提供一種鑒定遺傳目標(biāo)物的平臺(tái)，包括選自下組的探針，1)一種具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列、插入重復(fù)區(qū)和第二獨(dú)特旁側(cè)序列的探針，和2)一種夾層分析，包括一種具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列和n≥0個(gè)重復(fù)單元的捕獲探針，和具有n≥0個(gè)重復(fù)單元以及順序相連的第二獨(dú)特旁側(cè)序列，其中重復(fù)單元的總數(shù)＞0，使目標(biāo)物在電子嚴(yán)緊條件下與探針雜交，以提供適當(dāng)?shù)臉?biāo)引，和至少部分通過(guò)確定雜交穩(wěn)定性，來(lái)確定試驗(yàn)位點(diǎn)上的一致和不一致，其中雜交穩(wěn)定性包括電子雜交穩(wěn)定性。
192．一種確定遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法，包括以下步驟在多個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上排列多個(gè)雜交復(fù)合物分析，其中雜交復(fù)合物分析包括至少一個(gè)含有重復(fù)DNA序列的核酸目標(biāo)物，具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列和互補(bǔ)于目標(biāo)序列的n個(gè)重復(fù)單元的捕獲探針，其中n≥0，和具有一個(gè)互補(bǔ)于同一目標(biāo)序列鏈的選擇序列的報(bào)告探針，報(bào)告物包括第二獨(dú)特旁側(cè)序列，以及n≥0個(gè)重復(fù)單元，其中捕獲物加報(bào)告物中重復(fù)單元的總和大于零，捕獲探針的序列在至少兩個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上不同，至少部分通過(guò)確定雜交穩(wěn)定性，確定試驗(yàn)位點(diǎn)上雜交復(fù)合物分析中的一致和不一致，和基于一致位點(diǎn)的確認(rèn)，并進(jìn)一步基于定位在該位點(diǎn)上的雜交復(fù)合物中的探針的知識(shí)，確定目標(biāo)序列中重復(fù)單元的性質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了分析和檢測(cè)遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元性質(zhì)的方法和裝置。在本發(fā)明的一個(gè)方法中,遺傳目標(biāo)物中重復(fù)單元的性質(zhì)通過(guò)以下步驟確定:在多個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上排列多個(gè)雜交復(fù)合物分析,其中雜交復(fù)合物分析包括至少一個(gè)含有簡(jiǎn)單重復(fù)性DNA序列的核酸目標(biāo)物,具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列和互補(bǔ)于目標(biāo)序列的n個(gè)重復(fù)單元(其中n=0、1、2…,)或其片段的捕獲探針,以及具有互補(bǔ)于同一目標(biāo)序列鏈的選擇序列的報(bào)告探針,其中報(bào)告序列的選擇序列包括第二獨(dú)特旁側(cè)序列和m個(gè)重復(fù)單元(m=0、1、2…)或其片段,但是捕獲探針加報(bào)告探針中重復(fù)單元的總數(shù)大于0(n+m>0)。按照本方法,捕獲探針的序列至少在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)不同。然后監(jiān)測(cè)雜交復(fù)合物分析,至少部分通過(guò)雜交穩(wěn)定性確定實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)上雜交復(fù)合物分析中的一致和不一致。最后,可以基于一致/不一致確認(rèn)并結(jié)合定位在該位點(diǎn)的雜交復(fù)合物中的探針的知識(shí),確定目標(biāo)序列中重復(fù)單元的性質(zhì)。本發(fā)明的一個(gè)方面,在初始雜交相中,例如幫助適當(dāng)索引雜交材料,或者在一致/不一致相中,或者在這兩個(gè)過(guò)程中,可以應(yīng)用電子嚴(yán)緊控制。在本發(fā)明的另一方面,系統(tǒng)包括多個(gè)位點(diǎn),其中每個(gè)位點(diǎn)包括至少一個(gè)具有第一獨(dú)特旁側(cè)序列、第二獨(dú)特旁側(cè)序列和一個(gè)具有數(shù)目可變重復(fù)單元的插入重復(fù)單元序列的探針?？梢源_定環(huán)出狀況或準(zhǔn)確一致?tīng)顩r的存在。應(yīng)用包括親子鑒定、法醫(yī)學(xué)應(yīng)用、和疾病診斷,例如鑒定克隆腫瘤的存在。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1297489SQ99805207
公開(kāi)日2001年5月30日 申請(qǐng)日期1999年2月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月25日
發(fā)明者羅納德·G·索斯諾夫斯基, 尤金·圖 申請(qǐng)人:內(nèi)諾金有限公司